目的 探讨加减养精种玉汤通过雷帕霉素不敏感性伴随蛋白(rapamycin-insensitive companion of mTOR,Rictor)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物2(mammalian targeting of rapamycin complex 2,mTORC2)通路改善大鼠卵巢储备功能的作用机制.方法 准备动情周期正常的雌性SD大鼠 32只,随机选取其中 8只作为空白组(等剂量生理盐水灌胃),其余SD大鼠首次腹腔注射环磷酰胺50 mg/mL后连续 14d腹腔注射 8 mg/kg诱导卵巢储备功能减退(diminished ovarian reserve,DOR)模型.按随机数字表法将造模成功的 24 只大鼠分为模型组(等剂量生理盐水灌胃)、中药组(加减养精种玉汤 3.39 g/kg灌胃)、卵泡刺激素(follicle stimulating hor-mone,FSH)组(FSH 0.105 mg/kg灌胃).记录大鼠动情周期;HE染色观察左侧卵巢组织病理学变化并计算各组大鼠左侧卵巢窦卵泡数量;计算子宫、左侧卵巢系数;ELISA法测定FSH、黄体生成素(luteinizing hormone,LH)、雌二醇(estradiol,E2)、抗米勒管激素(anti-Müllerian hormone,AMH)水平;Western blot检测大鼠左侧卵巢组织Rictor、mTORC2蛋白表达水平.结果 与空白组相比,模型组动情周期次数减少(P<0.05);左侧卵巢成熟卵泡少;左侧卵巢指数、子宫指数、左侧卵巢窦卵泡数量均降低(P<0.05,P<0.01);血清AMH、E2 降低(P<0.01),LH、FSH升高(P<0.01);左侧卵巢组织Rictor、mTORC2 蛋白相对表达量升高(P<0.01).与模型组比,中药组及FSH组左侧卵巢结构改善,各级卵泡数量增加;左侧卵巢指数、子宫指数、左侧卵巢窦卵泡数量均上升(P<0.05);血清AMH、E2 升高(P<0.01),LH、FSH降低(P<0.01);左侧卵巢组织Rictor、mTORC2蛋白相对表达量降低(P<0.01).结论 加减养精种玉汤能够改善激素水平、调节卵巢卵泡细胞,从而起到改善DOR的作用,其机制可能与降低Rictor/mTORC2 的表达有关.

目的 探讨调控哺乳动物雷帕霉素蛋白复合物2(mTORC2)/Akt信号通路对6-羟基多巴胺(6-OHDA)损伤的SH-SY5Y细胞系是否具有保护作用,并阐明其分子作用机制.方法 经维甲酸(RA)处理的SH-SY5Y细胞分别给予6-OHDA、mTORC2信号通路抑制剂PP242和激动剂A-443654,通过免疫荧光染色观察各组细胞数目的变化;提取细胞总蛋白进行Western blotting和免疫共沉淀(CoIP)实验,明确mTORC2信号通路关键蛋白的表达水平及其相互作用;采用流式细胞术检测各组细胞的凋亡率.同时制备SH-SY5Y与Bv-2细胞系共培养的帕金森病(PD)模型,运用MTT及ELISA方法检测各组细胞活力及培养上清液中肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白细胞介素β(IL-1β)的含量.结果 6-0HDA损伤的PD细胞模型组酪氨酸羟化酶(TH)/增殖细胞核抗原(PCNA)/Hochest-、TH/5-溴脱氧尿嘧啶核昔(BrdU)-单标或双标阳性细胞数较正常组明显减少,凋亡率升高;Rictor、p-Akt、发育及DNA损伤反应调节蛋白1(REDD1)的表达均上升,且Rictor与p-Akt或REDD1存在相互作用;共培养模型中细胞活力明显降低且上清液中TNF-α和IL-β含量上升.A-443654组随着上述蛋白表达的进一步上调,细胞存活和凋亡以及炎性因子水平均有明显改善,而PP242组则呈现相反的变化.结论 A-443654通过使Akt磷酸化而激活mTORC2信号通路,引起Rictor和REDD1蛋白的表达增加,继而提高细胞存活率并降低凋亡率,促进SH-SY5Y细胞的增殖分化,改善了 6-0HDA引起的细胞损伤以及抑制了炎症因子的释放.

目的 探讨雷帕霉素不敏感性伴随蛋白(Rictor)/雷帕霉素复合物2(mTORC2)对血管瘤内皮细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭的作用及机制.方法 取对数生长期的血管瘤内皮细胞,设置空白对照组、阴性对照(si-NC)组和Rictor沉默(si-Rictor)组.实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)验证转染效率;采用细胞计数试剂盒8(CCK-8)法测定细胞增殖活性;抗凝血蛋白膜粘连蛋白-5/碘化丙啶(Annexin V-FITC/PI)法检测细胞凋亡情况;细胞划痕实验和Transwell实验检测细胞迁移、侵袭情况;Western blotting法检测丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶(AKT)、磷酸化AKT(p-AKT)蛋白表达水平;采用25 μmol/L AKT抑制剂MK2206处理Rictor沉默组细胞(si-Rictor+MK2206组),检测AKT、p-AKT蛋白表达水平和细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭情况.结果 血管瘤内皮细胞中Rictor mRNA表达显著高于人脐静脉内皮细胞,差异有统计学意义(t=121.510,P＜0.05).与si-NC组比较,si-Rictor-1、si-Rictor-2和si-Rictor-3组RictormRNA的表达均显著减少,差异均有统计学意义(t=9.564、10.760、22.105,P均＜0.05),其中si-Rictor-3组的沉默效果最好;因此,本次实验选择以si-Rictor-3作为干扰序列继续进行后续实验.si-Rictor组在3个时间点(48、72、96h)细胞增殖能力显著低于si-NC组,差异均有统计学意义(t=3.872、6.560、18.469,P均＜0.05);细胞迁移、侵袭能力显著弱于si-NC组,差异均有统计学意义(t=6.260、4.739,P均＜0.05);细胞凋亡率显著高于si-NC组,差异有统计学意义(t=19.624,P＜0.05);p-AKT的蛋白表达显著高于si-NC组,差异有统计学意义(t=8.981,P＜0.05).MK2206处理细胞后,与si-Rictor组比较,si-Rictor+MK2206组细胞p-AKT的蛋白表达显著下调,差异有统计学意义(t=5.399,P＜0.05);细胞增殖、迁移、侵袭能力显著增加,凋亡显著减少,差异均有统计学意义(P均＜0.05).结论 Rictor/mTORC2在血管瘤细胞中高表达,沉默Rictor抑制细胞增殖、迁移和侵袭,促进细胞凋亡,可能与AKT信号通路的激活有关.

目的 研究抑制了慢性排斥反应的大鼠模型中,T淋巴细胞中哺乳动物雷帕霉素靶蛋白-丝/苏氨酸蛋白激酶(mTOR)通路的各成分是否发生改变,探讨mTOR信号通路在抑制慢性排斥反应中的作用.方法 受体August-Copenhagen-Irish(ACI)大鼠与供体Wistar-Furth (WF)大鼠接受腹腔内异位心脏移植术.实验组大鼠给予慢性排斥反应消除处理,即术前给予经改造的Ⅰ类主要组织相容性复合物(MHC Ⅰ),并给予亚治疗量环孢素(CsA)(10 mg/kg,3d),治疗对照组于术后给予亚治疗量CsA(10 mg/kg,3 d),空白对照组不进行处理.将每组大鼠分为在术后1、3、7d处死的3个亚组,每个亚组大鼠数量为5只.分别在亚组对应天数处死大鼠,获取脾脏样本进行T细胞提取与蛋白免疫印迹(Western blot)分析.结果 蛋白免疫印迹结果表明,在消除了慢性排斥反应的移植心脏中(实验组),对雷帕霉素敏感的复合体1 (mTOR C1)的mTOR与mTOR调节相关蛋白(Raptor)下调,对雷帕霉素不敏感的复合体2(mTOR C2)的伴侣分子(Rictor)与哺乳动物应激活化蛋白激酶相互作用蛋白1 (Sin1)下调,mTOR调节因子(Deptor)与mTOR通路下游目标分子(Rac1)也受到抑制.结论 在消除了慢性排斥反应的大鼠心脏移植模型中,mTORC1和C2通路均受到影响,同时影响了细胞增殖调节(mTOR C1)和细胞运动调节(mTOR C2).因此,选择性地对T细胞肌动蛋白细胞骨架通路进行抑制,可成为新的免疫抑制剂发展方向.

目的 探讨 mTORC1/2 抑制剂 PP242 诱导多囊肾(polycystic kidney,PCK)大鼠胆管上皮细胞凋亡和自噬、抑制细胞增殖及胆管囊性扩张的分子机制.方法 免疫组织化学染色法检测PCK大鼠胆管上皮细胞中p-mTOR和p-Akt的表达;WST-1比色法检测雷帕霉素和PP242对胆管上皮细胞增殖活性的抑制作用,以及LC3、Beclin-1基因沉默和自噬特异性抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA)对细胞增殖的影响;蛋白免疫印迹法检测PP242 对PI3K/Akt信号通路相关蛋白、自噬标识蛋白 LC3 和 Beclin-1、 cleaved caspase-3表达的影响;流式细胞术和 ELISA 法检测 PP242对细胞凋亡的影响;免疫荧光染色法检测LC3 在细胞质中的表达情况;3D细胞培养检测Rictor基因沉默和雷帕霉素联用及雷帕霉素单独应用时对大鼠胆管上皮细胞成球能力的影响.结果 p-mTOR和 p-Akt在 PCK大鼠胆管上皮细 胞中呈过表达,PP242比雷帕霉素抑制胆管上皮细胞增殖效果更为明显,且呈浓度和时间依赖性改变(P<0.05);PP242明显抑制PI3K/Akt信号通路相关蛋白的表达;PP242 可诱导细胞凋亡和自噬,上调cleaved caspase-3、Beclin-1 和LC3-II/LC3-I比值. Rictor基因沉默和雷帕霉素联用比雷帕霉素单独应用对大鼠胆管上皮细胞的抑制作用更为明显;LC3、Beclin-1基因沉默和3-MA均可明显减弱PP242对细胞增殖的抑制作用(P <0.05).结论 PP242 可通过 PI3K/Akt/mTOR信号通路抑制PCK大鼠胆管上皮细胞的增殖,其机制与细胞凋亡和自噬密切相关.

哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)是一种进化上非常保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,属于磷脂酰肌醇激酶相关激酶(phosphatidylinositol kinase-related kinases,PIKKs)家族成员.mTOR结构复杂,有两种形式的复合物mTORC1和mTORC2.mTORC1含有底物募集的特异性正向调节因子raptor,mTORC2含有特异性亚基rictor.Guertin等[1]研究发现,敲除raptor的小鼠胚胎在发育初期就会死亡,敲除rictor的小鼠胚胎最长可存活至孕后10.5d.Chen等[2]究发现,小鼠植入期子宫内膜组织的mTOR呈现高表达,且具有时空特异性,孕鼠围植入期注射mTOR抑制剂可导致胚胎丢失.同时,Wollenhaupt等[3]对怀孕母猪子宫内膜mTOR的下游效应物表达的测定结果显示,真核起始因子4E蛋白在胚胎植入期(PD13)增高、在胎盘形成(PD24)期子宫内膜与胎盘接触部位表达降低.多项动物研究结果提示mTOR信号通路在胚胎植入期的子宫组织表达升高,并对维持成功植入以及胚胎早期发育至关重要.通过对mTOR信号通路参与胚胎植入机制的研究,可为探索女性生殖损伤的具体机制打开窗口.

目的:探讨运动及饮食对小鼠骨骼肌mTOR复合物及胰岛素信号通路蛋白活性的影响,分析高脂状态下运动在改善高脂饮食诱导的小鼠胰岛素抵抗过程中的作用机制,以便为运动改善机体代谢稳态提供新的理论依据.方法:随机将50只C57BL/6小鼠分为正常饮食组(C组,n=10)及高脂饮食组(n=40),分别给予正常及高脂饲料喂养6周,随后再根据口服糖耐量(OGTT)和空腹胰岛素检测结果取高脂饮食组中25只成模小鼠随机分为高脂安静组(H组,n=10)和高脂运动组(HE组,n=15).H组和HE组继续喂以高脂饲料,同时HE组小鼠施以8周、强度为75％VO2max有氧跑台运动干预(12 m/min、60 min/天、5次/周).8周后麻醉处死、取材,Western Blot检测小鼠比目鱼肌胰岛素信号通路相关蛋白表达,免疫共沉淀法分别检测比目鱼肌和腓肠肌Raptor-mTOR及Rictor-mTOR结合情况.结果:(1)在以氧化型肌纤维为主的比目鱼肌纤维,与C组相比,H组pAkt-T308(P<0.05),pIRS1-S307(P<0.001)位点的表达显著降低,而pS6K1-T389(P<0.05)显著增高,Raptor-mTOR结合量明显增加(P<0.05),而Rictor-mTOR结合量明显降低(P<0.05);与H组小鼠对比发现,HE组pAkt-S473(P<0.05)、pAkt-T308(P<0.05)、pAMPKα-T172(P<0.05)、pIRS1-S307(P<0.001)均显著增加,而pS6K1-T389表达、Raptor-mTOR结合量均显著降低(P<0.05),Rictor-mTOR结合量则显著增加(P<0.05).(2)在小鼠腓肠肌纤维,与C组相比,H组Raptor-mTOR结合量显著增加(P<0.05),而Rictor-mTOR结合量虽有增加趋势,但无统计学显著意义(P>0.05);与H组对比,HE组Raptor-mTOR显著降低(P<0.05),Rictor-mTOR虽有降低趋势,但无显著意义(P>0.05).结论:8周有氧跑台运动干预可有效逆转C57BL/6小鼠由高脂饮食诱导的代谢稳态失衡,其机制可能是通过抑制比目鱼肌纤维Akt/mTORC1信号,激活Akt/mTORC2信号通路实现的.

目的 探讨mTOR在宫颈癌紫杉醇耐药中的作用及mTORC1/2双重抑制剂OSI-027联用紫杉醇后HeLa/PTX细胞对紫杉醇(paclitaxel,PTX)敏感性的变化并对相关机制进行研究.方法 用sh-RNA-Raptor及sh-RNA-Rictor质粒转染HeLa/PTX细胞以下调Rictor及Raptor的表达,采用western blot法检测mTOR信号通路相关蛋白(Raptor、Rictor、p-Akt(ser473)、Akt和p-p70S6K)和凋亡相关蛋白(Bcl-2和Bax)的表达情况;采用平板克隆形成实验、CCK-8法及West-ern blot法检测单用mTORC1/2双重抑制剂(OSI-027)、PTX及联用OSI-027和PTX后细胞克隆形成能力、增殖活力的变化并计算药物联用指数(combination index,CI)及mTOR信号通路相关蛋白和凋亡相关蛋白的表达情况.结果 与对照组相比,在HeLa/PTX细胞中下调Raptor后p-p70S6K表达显著降低(P＜0.001),p-Akt(ser473)/Akt比率显著升高(P＜0.001),Bcl-2/Bax比值无显著差异(P＞0.05).下调Rictor后p-p70S6K蛋白表达、p-Akt(ser473)/Akt及Bcl-2/Bax比值均显著降低(P＜0.001);与单独使用OSI-027或PTX相比,联合用药组细胞的克隆形成能力及增殖活力均明显下降且两药联用具有协同作用;与空白对照组相比,单用PTX处理HeLa/PTX细胞后p-Akt(ser473)/Akt比率略降低(P＜0.05),p-p70S6K表达无明显变化(P＞0.05),而单用OSI-027处理HeLa/PTX细胞后p-Akt(ser473)/Akt比率及p-p70S6K表达均显著降低(p＜0.001);与单用OSI-027及PTX相比,联合用药处理HeLa/PTX细胞后p-Akt(ser473)/Akt比值、Bcl-2/Bax比值及p-p70S6K蛋白表达均显著降低(P＜0.001).结论 抑制mTORC2信号通路的活性可减弱mTORC1抑制引起的p-Akt(ser473)反馈激活可成为克服紫杉醇耐药的有效靶点;mTORC1/2双重抑制剂OSI-027与紫杉醇联用可产生协同抗肿瘤作用.

目的 探讨糖尿病胃轻瘫(DGP)发生过程中胃平滑肌组织能量代谢及雷帕霉素复合物1(mTORC1)与雷帕霉素复合物2(mTORC2)的变化及意义.方法 STZ诱导建立糖尿病大鼠模型,随机分为糖尿病4周(DM4w,n=10)、6周(DM6w,n=10)、8周(DM8w,n=10),正常大鼠为对照组(NC,n=9).离体肌条实验观察各组胃窦平滑肌自发性收缩运动情况,高效液相色谱法检测胃窦平滑肌组织中腺苷三磷酸(ATP)、腺嘌呤核糖核苷酸(AMP)和二磷酸腺苷(ADP)含量,Westen blot检测胃窦平滑肌组织中AMP依赖的蛋白激酶(AMPK)、p-AMPK、蛋白激酶B(Akt)、p-Akt、mTOR、雷帕霉素哺乳动物靶调控相关蛋白(Raptor)和雷帕霉素哺乳动物靶调控敏感蛋白(Rictor)的蛋白表达.结果 DM4w、DM6w和DM8w胃平滑肌的自主收缩频率与振幅逐渐降低(P<0.05).各组ATP含量比较,差异无统计学意义(P>0.05).与NC、DM4w组比较,DM6w、DM8w组ADP、ADP/ATP含量升高,能荷降低(P<0.05或P<0.01).各组Raptor蛋白含量比较,差异无统计学意义(P>0.05),DM4w、DM6w和DM8w组Rictor蛋白表达逐渐升高(P<0.05或P<0.01).结论 DGP发病过程中胃窦平滑肌能量代谢紊乱,可能受mTORC1与mTORC2通路变化影响.

目的:探讨高糖条件下M2型丙酮酸激酶(pyruvate kinase isozyme type M2,PKM2)对内皮细胞基质金属蛋白酶-1 (matrix metalloproteinase-1,MMP-1)表达的影响及其机制.方法:用低、中、高浓度(5.5,15.0,30.0 mmol/L)的D-葡萄糖孵育人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)72 h后,采用蛋白质印迹法检测PKM2,p-PKM2 Y105及其上下游分子的表达,检测PKM2四聚体/二聚体状态,结合免疫荧光分析检测PKM2核转位情况.通过使用siRNAs,PKM2抑制剂TEPP-46和哺乳动物雷帕霉素受体(mammalian target of rapamycin,mTOR)抑制剂雷帕霉素研究mTOR复合体,PKM2和MMP-1之间的调控关系.使用免疫共沉淀技术验证mTOR复合体和PKM2的相互作用.结果:高糖上调HUVECs中p-PKM2 Y105,MMP-1,PKM2四聚体,Rictor的蛋白质表达,促进PKM2核转位.沉默PKM2的表达或使用PKM2抑制剂TEPP-46可以阻止高糖引起的MMP-1的蛋白质表达上调.雷帕霉素逆转高糖引起的p-PKM2 Y105和MMP-1的蛋白质表达上调.在高糖情况下,沉默Rictor后p-PKM2 Y105的蛋白质表达下调,而沉默Raptor后p-PKM2 Y105的表达上调.免疫共沉淀结果表明Rictor与PKM2存在直接结合.结论:高糖条件下磷酸化的PKM2促进内皮细胞MMP-1表达,mTORC2参与了高糖诱导的PKM2磷酸化.