目的:利用表达结核分枝杆菌蛋白Ag85B、ESAT-6、Rv2031c和Rv2626c的重组腺病毒(Ad-AE-R2)滴鼻黏膜免疫小鼠，探究其对哮喘小鼠气道炎症的免疫预防作用。方法:本研究为实验研究，采用单纯随机抽样方法。将18只6~8周龄BALB/c雌性小鼠随机分为3组：空白对照组、哮喘模型组和免疫预防组，每组6只。免疫预防组滴鼻免疫10 8 PFU Ad-AE-R2，空白对照组和哮喘模型组滴鼻等量生理盐水。小鼠免疫3周后，利用卵清蛋白诱导免疫预防组和哮喘模型组小鼠哮喘。空白对照组用生理盐水雾化作为对照。末次激发小鼠哮喘24 h后，麻醉处死各组小鼠，检测小鼠支气管肺泡灌洗液(BALF)和外周血中IgE和γ干扰素(IFN-γ)、白细胞介素5(IL-5)、IL-13等细胞因子的含量，HE染色观察肺组织病理学改变。 结果:与空白对照组相比，哮喘模型组BALF和血清中的IgE含量增加(均 P<0.05)，BALF中IFN-γ/IL-5下降( P<0.01)。与哮喘模型组相比，免疫预防组BALF中IL-13含量降低( P<0.01)，BALF和血清中IFN-γ/IL-5升高(均 P<0.05)。小鼠肺组织病理切片HE染色结果表明，与空白对照组相比，哮喘模型组小鼠肺组织结构出现明显损伤，气道黏膜上皮细胞局部脱落，管壁及基底膜显著增厚，气道及血管周围可见大量炎症细胞浸润；与哮喘模型组相比，免疫预防组小鼠肺组织中的炎症性病理改变明显减轻。 结论:利用卵清蛋白成功诱导小鼠气道炎症，建立小鼠哮喘模型。Ad-AE-R2黏膜免疫可以提升小鼠气道Th1型免疫反应，促进Th1/Th2型细胞因子平衡，对小鼠哮喘具有一定的预防保护效果，为哮喘的免疫预防提供研究参考。

目的 构建结核分枝杆菌Rv2626c蛋白的重组表达载体,在大肠埃希菌(Escherichia coli,E.coli)中表达、纯化后研究Rv2626c重组蛋白的抗原性.方法 将GenBank公布的结核分枝杆菌H37Rv株Rv2626c蛋白的氨基酸序列(登录号:CCP45424.1)按E.coli密码子偏好转换为对应的DNA序列,合成该DNA序列并克隆至pET24a(+)质粒上,构建pET24a(+)-Rv2626c重组质粒,转化至E.coli BL21(DE3)中,以不同的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl β-D-thio-galactopyranoside,IPTG)浓度、温度和时间条件下诱导表达Rv2626c蛋白,通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)和蛋白免疫印迹法(Western Blot)对Rv2626c重组蛋白进行鉴定.利用镍螯合亲和层析法纯化Rv2626c重组蛋白并将其免疫青紫蓝兔,制备抗Rv2626c抗血清,采用Western Blot和酶联免疫吸附法分别检测抗血清的特异性和效价.结果 pET24a(+)-Rv2626c重组质粒构建成功.SDS-PAGE检测显示:转入该重组质粒的E.coli经IPTG诱导后表达Rv2626c重组蛋白,分子量约14 500,大小与预期相符;Rv2626c重组蛋白的最佳诱导表达条件为31 ℃ 1.0 mmol/L IPTG诱导表达6h,目的蛋白主要以可溶性形式存在,与Western Blot检测结果一致.Rv2626c重组蛋白免疫青紫蓝兔获得的高免血清特异性良好,经酶联免疫吸附法测定该血清效价为1∶256 000.结论 在E.coli中成功表达结核分枝杆菌Rv2626c蛋白,且纯化的Rv2626c重组蛋白具有较好的纯度和抗原活性,为进一步揭示其生物学功能奠定基础.

目的 验证结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)基因Rv2626c编码的低氧反应蛋白1(hypoxic response protein 1,HRP1)为分泌蛋白.方法 从Mtb H37Rv标准毒力株基因组上扩增目的基因并添加His标签;运用扩增产物构建重组质粒,电转入耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis,Ms)(MC2155)构建重组菌;热诱导重组菌表达蛋白,检测培养滤液及细菌裂解液中蛋白的表达情况,将10 kDa培养滤液抗原(CFP-10)(Ms)和CFP-10(Mtb)设为阳性对照,将胞质蛋白热休克蛋白65(GroEL2)(Mtb)作为阴性对照.结果 PCR成功扩增HRP1、GroEL2(Mtb)、CFP-10(Mtb)、CFP-10(Ms),并且重组质粒测序峰单一且信号稳定,鉴定重组质粒构建成功.成功构建重组Ms并实现蛋白GroEL2(Mtb)、CFP-10(Mtb)、CFP-10(Ms)、HRP1在Ms中的表达.在重组菌裂解液中和培养基滤液中均检测到目标蛋白HRP1;结果与阳性对照CFP-10一致;阴性对照GroEL2(Mtb)仅在细菌裂解液中检测到,在培养滤液在未检测到.结论 Mtb基因Rv2626c编码的蛋白HRP1可以通过Ms的分泌系统分泌到细菌外,作为Mtb分泌蛋白,在Mtb致病机制中发挥作用.

目的 评估11种结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)抗原用于MTB致敏后豚鼠皮肤试验反应的效果.方法 选取18只无特定病原体(specific pathogen free,SPF)级豚鼠(雌性,体质量250?300 g),按接种剂量分为高(5μg)、中(0.5 μg)、低(0.1 μg)3组,每组6只.采用MTB标准株(H37Rv,ATCC27294)致敏豚鼠,致敏成功后豚鼠背部去毛皮内注射结核菌素纯蛋白衍生物(TB-PPD)、重组结核杆菌融合蛋白(EC)和11种MTB抗原(包括重组抗原Rv3872、MPT64、Rv1985c、Rv0222、Rv3117、Rv3120、Rv2346c、Rv3619c、Rv3425、Rv1738和Rv2626c),各0.1 ml.分别于注射24 h和48 h后观察皮肤试验反应,测量硬结平均直径[(横径+纵径)/2],以硬结平均直径≥5 mm为阳性.分析11种MTB抗原皮肤试验反应与TB-PPD和EC的差异.结果 抗原注射24 h后,剂量为5 μg时Rv3120、Rv3619c的皮肤试验反应阳性率分别为9/9和8/9;剂量为0.5 μg时EC、MPT64的皮肤试验反应均为阳性.TB-PPD(5 IU)及EC(0.5μg剂量)、MPT64(0.5μg剂量)、Rv3120(5μg剂量)和Rv3619c(5μg剂量)皮肤试验反应24 h硬结平均直径[中位数(四分位数)]均大于反应48 h[硬结平均直径分别为:9.00(7.00,11.00)mm 和6.50(5.50,8.25)mm、13.00(12.75,14.25)mm 和9.00(8.00,9.75)mm、9.50(8.50,12.50)mm和8.50(5.50,9.50)mm、8.50(6.25,9.25)mm和5.00(0.00,5.50)mm、6.50(5.50,8.25)mm和3.50(1.50,4.75)mm],差异均有统计学意义(Z 值分别为-2.494、-2.677、-2.207、-2.673、-2.670;P 值分别为0.013、0.007、0.027、0.008、0.008).皮肤试验反应24 h 时,MPT64(0.5 μg 剂量)、Rv3120(5 μg剂量)和Rv3619c(5 μg剂量)与TB-PPD(5 IU)硬结平均直径接近,差异均无统计学意义(H值分别为-0.496、0.819和1.714,P值分别为1.000、1.000和0.865);MPT64(0.5 μg剂量)与EC(0.5 μg剂量)皮肤试验反应情况接近,差异无统计学意义(H=2.288,P=0.221);Rv3120(5 μg剂量)和Rv3619c(5 μg剂量)硬结平均直径均小于EC(0.5 μg剂量),差异均有统计学意义(H值分别为3.795和4.690,P值分别为0.001和0.000).结论 MPT64(0.5 μg剂量)和Rv3120(5 μg剂量)的豚鼠皮肤试验效果相对较好,对于结核病诊断具有潜在应用价值.

目的 原核表达结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)Rv2626c基因编码的低氧反应蛋白(hypoxic response protein 1,HRP1),并分析该蛋白对小鼠巨噬细胞ANA-1(简称ANA-1细胞)功能的影响及作用机理.方法 将Rv2626c基因克隆至表达载体pET-28a,构建重组表达质粒pET-28a-Rv2626c,转入表达菌株BL21,诱导表达HRP1,经亲和层析法纯化和Western blot鉴定.使其作用于ANA-1细胞,用CCK8法检测ANA-1细胞的增殖活力,流式细胞术检测ANA-1细胞凋亡情况,Griess法及ELISA法分别检测一氧化氮(nitric oxide,NO)产生水平和肿瘤坏死因子α(tumour necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素1β(interleukin-1β,IL-1β)的分泌情况,同时采用核因子κB(nuclear factor-κB,NF-κB)抑制剂Bay 11-7082、丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPK)抑制剂U0126、SB 203580预处理ANA-1细胞后,检测NO、TNF-α、IL-1β变化情况.结果 成功构建重组表达质粒pET-28a-Rv2626c,获得目的 蛋白HRP1.与空白组相比,不同浓度的HRP1作用于ANA-1细胞后,细胞增殖活力未受抑制(P＜0.05),凋亡率无明显差异,但培养细胞上清液中的NO、TNF-α及IL-1β含量均显著增加(P＜0.05);若用Bay 11-7082及U0126预处理的ANA-1细胞,其NO及TNF-α的分泌量明显减少(P＜0.001).结论 HRP1对ANA-1细胞无细胞毒性,并可通过激活ANA-1细胞内NF-κB及MAPK信号通路促进其分泌具有抗菌效应的NO及TNF-α,增强其固有免疫效应,可作为结核疫苗候选优势抗原.

目的 构建表达结核分枝杆菌多阶段抗原融合蛋白Ag85B-ESAT6(AE)和Rv2031c-Rv2626c(R2)的重组腺病毒,为其用于结核病新型疫苗的研究奠定基础.方法 体外合成人延长因子1α(EF1α)启动子DNA序列,将其亚克隆至腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV中,构建含有CMV、EF1α双启动子的腺病毒穿梭载体.PCR扩增课题组前期构建的AE、R2融合蛋白基因,并依次亚克隆至上述腺病毒穿梭载体的CMV和EF1启动子下游,阳性重组穿梭质粒命名为pAd-AE-R2.将pAd-AE-R2与骨架质粒共转染HEK293细胞,包装获得重组腺病毒,命名为Ad-AE-R2.RT-PCR法和间接免疫荧光法(IFA)对重组腺病毒表达的AE、R2融合蛋白的基因和蛋白表达水平进行鉴定.结果 Ad-AE-R2瞬时转染的HEK293细胞中可转录表达AE、R2融合蛋白基因.IFA法采用Ag85B、ESAT-6、Rv2626c和Rv2031c 4种抗原的单克隆抗体可分别检测到Ad-AE-R2感染的巨噬细胞中具有特异性的绿色荧光,表明Ad-AE-R2能够在宿主细胞内表达AE、R2融合蛋白.结论 成功构建并包装获得表达结核分枝杆菌多阶段抗原融合蛋白AE、R2的重组腺病毒,为其用于结核病新型疫苗研究奠定基础.