目的:探讨同源盒家族中的人类同源盒C6(HOXC6)基因在前列腺癌中的表达情况及其对前列腺癌细胞增殖、侵袭和迁移能力的影响及机制.方法:应用基于基因表达水平值的交互式分析平台(GEPIA)数据库中关于HOXC6 研究的数据,对其在前列腺癌中的表达水平变化进行分析.采用GEPIA数据库分析HOXC6 表达水平与前列腺癌患者生存预后之间的关系.通过Western印迹检测HOXC6 蛋白在前列腺癌组织、正常前列腺组织及不同前列腺癌细胞株 DU-145、PC-3 以及正常人前列腺上皮细胞 RWPE-1 中的表达情况.在人前列腺癌细胞DU145、PC-3 和正常人前列腺上皮细胞RWPE-1 中,利用siRNA质粒稳定干扰HOXC6 基因表达,采用CCK8、平板克隆、划痕、Transwell侵袭实验检测HOXC6 基因对前列腺癌细胞增殖、迁移、侵袭能力的影响.通过GEPIA数据库分析Wnt抑癌因子分泌型卷曲相关蛋白 1(SFRP1)基因与 HOXC6 的相关性,采用 Western 印迹检测 HOXC6-siRNA转染后PC-3 细胞中HOXC6、SFRP1、Wnt及β-catenin蛋白表达.结果:HOXC6 在前列腺癌组织中的表达高于正常前列腺组织(P<0.01),在前列腺癌细胞中的表达高于正常前列腺上皮细胞(P<0.01).结合生物信息学分析,HOXC6 高表达的PCa患者比低表达的生存率低(P=0.011).siRNA组HOXC6 蛋白相对表达量、吸光度值、克隆形成数、侵袭细胞数低于阴性对照组,差异有统计学意义(P<0.05).通过GEPIA数据库发现SFRP1 高表达的前列腺癌患者预后较好,在体外实验中,前列腺癌PC-3 细胞系中,Western印迹分析Wnt及β-catenin蛋白的表达均上升,SFRP1 蛋白表达明显下降(P<0.05);与siRNA-NC、前列腺癌PC-3 相比,siRNA-HOXC6 转染组中的Wnt及β-catenin蛋白的表达均明显下降,SFRP1 蛋白表达上升(P<0.05).结论:HOXC6 在前列腺癌组织中高表达,并与前列腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭有关;HOXC6 通过抑制 SFRP1/Wnt/β-catenin信号通路从而促进前列腺癌DU145、PC-3 细胞的生长,HOXC6 有可能是临床治疗前列腺癌的潜在靶标.

骨质疏松症是一种严重危害老年人健康的疾患。目前临床上治疗骨质疏松的药物主要有骨矿化促进药、骨吸收抑制药和骨形成促进药，可供选择种类仍然有限，亟待更多的基础研究成果向临床转化。本文将阐述骨质疏松基础领域新的潜在的治疗靶点和相关机制的研究现状：(1)骨质疏松发生发展的病理生理机制：骨重塑过程中的免疫调节(RANK/RANKL通路和WNT通路)；(2)单克隆抗体生物制剂研究(抗骨硬化蛋白Romosozumab)与骨质疏松；(3)细胞因子(骨形态发生蛋白、转化生长因子-β、生长激素和胰岛素样生长因子-1)与骨质疏松；(4)转录因子(GATA4、SFRP1、Tph1和DDK1)与骨质疏松；(5)干细胞与骨质疏松；(6)其他："骨骼-肠道菌群"调节轴和miRNAs等。

目的:探讨下调微小RNA-208a(miR-208a)对结直肠癌细胞5-氟尿嘧啶(5-FU)耐药的影响,阐明其相关分子机制.方法:采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法检测结直肠癌5-FU耐药细胞株HT-29/5-FU及其亲本HT-29细胞中miR-208a和分泌型卷曲相关蛋白1(SFRP1)mRNA表达水平.以HT-29/5-FU细胞为研究对象,将miR-208a抑制物(miR-208a inhibitor)质粒及其阴性对照质粒(inbibitor-NC)和SFRP1小干扰质粒(si-SFRP1)及其阴性对照质粒(si-NC)分别或同时转染至HT-29/5-FU细胞中,联合5-FU处理,将细胞分为空白组、inhibitor-NC组、miR-208a inhibitor组、miR-208a inhibitor+si-NC组和 miR-208a inhibitor+si-SFRP1 组.MTT 法检测各组细胞增殖活性并计算耐药指数,Annexin V-FITC/PI双染法结合流式细胞术检测不同浓度5-FU作用后各组细胞凋亡率,W estern blotting法检测各组细胞中SFRP1、β-连环蛋白(β-catenin)、P-糖蛋白(P-gp)和ATP结合盒B亚家族成员1转运蛋白(ABCB1)蛋白表达水平.双荧光素酶报告基因实验验证miR-208a与SFRP1的靶向关系.结果:与HT-29细胞比较,HT-29/5-FU细胞中miR-208a表达水平升高(P＜0.05),SFRP1 mRNA表达水平降低(P＜0.05).与 inhibitor-NC组比较,miR-208a inhibitor组细胞增殖活性降低(P＜0.05),耐药指数降低,细胞凋亡率升高(P＜0.05),细胞中β-catenin、P-gp和ABCB1蛋白表达水平降低(P＜0.05).双荧光素酶报告基因实验提示SFRP1是miR-208a靶基因,且miR-208a 可负向调控 SFRP1 的表达.与 miR-208a inhibitor+si-NC 组 比较,miR-208a inhibitor+si-SFRP1组细胞增殖活性升高(P＜0.05),耐药指数升高,细胞凋亡率降低(P＜0.05),细胞中β-catenin、P-gp和ABCB1蛋白表达水平升高(P＜0.05).结论:下调miR-208a可通过靶向上调SFRP1表达抑制Wnt信号通路的转导,进而改善HT-29/5-FU细胞对5-FU的耐药.

研究黄芩清热除痹胶囊(Huangqin Qingre Chubi Capsules,HQC)治疗类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis,RA)的作用及机制.70 只雄性SPF级大鼠随机分为正常组,模型组,HQC低(0.18 g·kg-1)、中(0.36 g·kg-1)、高(0.72 g·kg-1)剂量组,甲氨蝶呤(MTX,0.75 mg·kg-1)组,阴性对照组(NC组,模型+生理盐水).佐剂性关节炎(AA)大鼠成纤维样滑膜细胞(fibro-blast-like synoviocytes,FLS)分为正常组,模型组,HQC低(5%HQC含药血清+95%滑膜培养基)、中(10%HQC含药血清+90%滑膜培养基)、高(15%HQC含药血清+85%滑膜培养基)剂量组,阴性对照组.采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)和蛋白免疫印记法(Western blot)检测甲基转移酶3(methyltransgerase like 3,METTL3)、分泌型卷曲相关蛋白4(SFRP4)、β-连环蛋白(β-catenin)、细胞周期蛋白 D1(CCND1)、V-Myc骨髓细胞瘤病毒癌基因同源物(c-Myc)、纤连蛋白(fibronectin)、基质金属蛋白酶3(matrix metalloproteinase 3,MMP3)mRNA和蛋白的表达.免疫荧光法进一步检测MMP3 和β-catenin蛋白表达.在AA-FLS上敲低METTL3 基因表达水平,进一步检测各基因表达情况.酶联免疫吸附法(ELISA)检测白细胞介素(IL)-1β、IL-6、IL-8 的水平.结果显示,与正常组相比,模型组大鼠四肢均发现红肿现象,关节肿胀程度明显增加;与模型组相比,各给药组关节肿胀度显著下降(P<0.05),后足撤退阈值和体质量指数均显著增加(P<0.05).METTL3 在AA大鼠高表达,且与SFRP4 的表达呈负相关.AA-FLS经给药后,METTL3、β-catenin、CCND1、c-Myc、fibronectin、MMP3 mRNA和蛋白表达显著降低(P<0.05).与模型组相比,敲低METTL3 后β-catenin、CCND1、c-Myc、fibronectin、MMP3 mRNA和蛋白表达均降低(P<0.05).同时HQC+敲低METTL3 组的β-catenin、CCND1、c-Myc、fibronectin、MMP3 mRNA和蛋白表达均明显低于METTL3 敲低组(P<0.05).HQC能不同程度降低IL-1β、IL-6、IL-8 水平(P<0.05).结果表明,HQC对AA大鼠有明显改善作用;METTL3 在AA大鼠滑膜组织和AA-FLS中表达显著升高,这可能是诊断和治疗RA的潜在靶点;HQC通过METTL3-SFRP4/Wnt/β-catenin信号通路改善RA,具有明显的抗炎和抗风湿作用.

目的 基于分泌Frizzled相关蛋白2(secreted frizzled-related protein 2,SFRP2)-Wnt/β-catenin信号通路探讨催乳颗粒(Cuiru Keli,CRKL)治疗产后缺乳的效果及其作用机制.方法 通过向分娩后第3天的雌鼠灌胃2 mL 1.6 mg/mL甲磺酸溴隐亭来建立产后缺乳大鼠模型.将产仔时间差小于48 h的雌性大鼠随机分为7组:正常组(不造模,不给药);模型组;CRKL低剂量组(模型组+3 g/kg CRKL);CRKL中剂量组(模型组+6 g/kg CRKL)、CRKL高剂量组(模型组+9 g/kg CRKL);阳性药组(模型组+3 mg/kg多潘立酮);NC组(模型组+生理盐水);每组6只.除正常组和模型组外,其余5组按分组药物和剂量连续灌胃给药,每天1次,共10 d.取7组大鼠,测量10 d仔鼠总窝质量变化、HE染色观察乳腺病理变化.取除阳性对照组之外的6组大鼠,HE染色观察垂体病理变化,检测血清中PRL含量(ELISA)、乳腺组织(mammary tissue,MT)中PRLR的表达(免疫组化染色)、MT中乳汁合成相关基因mRNA的表达(RT-qPCR),然后以网络药理学和分子对接研究CRKL对产后缺乳的治疗作用和机制,特别是其是否通过SFRP2-Wnt/β-catenin信号通路治疗产后缺乳;再通过检测相关通路基因(RT-qPCR)和蛋白(Western blot)进行验证.然后进行细胞实验验证:取鉴定后的大鼠乳腺上皮细胞(rat mammary epithelial cell,RMEC),将RMEC分为4组:正常组(原代培养的RMEC,不处理)、SFRP2过表达组(原代培养的RMEC+SFRP2过表达载体)、SFRP2过表达+CRKL组(SFRP2过表达组+10%含药血清)、阴性对照组(原代培养的RMEC+空载体).RT-qPCR检测过表达SFRP2后CRKL对于乳汁合成相关基因FASN、CSN2和GLUT1 mRNA表达的影响.结果 与模型组相比,低、中、高剂量的CRKL均可以提高仔鼠10 d体质量增加量(P<0.05或P<0.01),均能有效增加产后缺乳大鼠泌乳量(P<0.01),增加乳腺小叶的面积,增加腺泡腔的大小和填充量,并促进产后缺乳大鼠催乳素的分泌和表达(P<0.05或P<0.01),显著促进产后缺乳大鼠乳腺乳脂、乳蛋白和乳糖合成基因的表达(P<0.05或P<0.01).网络药理学表明,Wnt信号通路可能是CRKL治疗产后缺乳的关键通路.分子对接结果表明CRKL和CCND1、SFRP2具有良好的结合能力.与模型组相比,低、中、高剂量的CRKL均抑制体内SFRP2基因的表达(P<0.01),激活了产后缺乳大鼠乳腺中的Wnt/β-catenin信号通路中CCND1、c-Myc的基因和蛋白的表达(P<0.05或P<0.01).细胞实验表明,过表达SFRP2后,与正常组相比,乳汁合成相关基因FASN、CSN2和GLUT1的mRNA水平也降低(P<0.01).加入含药血清后,上述基因的表达上调(与SFRP2过表达组相比,P<0.01).结论 CRKL通过SFRP2-Wnt/β-catenin信号通路治疗产后缺乳,SFRP2可能成为产后缺乳诊断和治疗的新靶点.这揭示了CRKL治疗产后缺乳的新机制,并促进了其临床推广.

目的 探讨miR-27a在结直肠癌中的表达,并分析其靶向调控分泌型卷曲相关蛋白 1(SFRP1)对人结直肠癌细胞HCT116 生物学行为的影响.方法 实时荧光定量 PCR(qRT-PCR)检测结直肠癌组织及癌旁正常组织中 miR-27a和SFRP1 mRNA的表达情况;Western blot检测结直肠癌组织及癌旁正常组织中SFRP1 蛋白表达水平;运用TargetScan预测软件及双荧光素酶报告基因实验检测 miR-27a 对SFRP1 的靶向调控作用;将 miR27a 模拟物(miR-27a mim-ic)、miR-27a抑制物(miR-27a inhibitor)及阴性对照(NC)转染至HCT116 细胞中;采用qRT-PCR测定各组细胞中miR-27a和SFRP1 mRNA的表达水平;运用四唑盐(MTT)比色法检测各组细胞增殖情况;Transwell实验评估各组细胞侵袭和迁移能力;Western blot检测各组细胞中SFRP1、Wnt/β-cate-nin信号通路中的关键因子Wnt4 和β-catenin的蛋白表达水平.结果 与癌旁正常组织相比,miR-27a在结直肠癌组织中高表达,而SFRP1 在结直肠癌组织中低表达(P<0.05);TargetScan预测软件和双荧光素酶报告基因实验表明miR-27a靶向调控SFRP1;与NC组相比,miR-27a mimic组miR-27a表达水平升高,细胞增殖、侵袭和迁移能力增强,SFRP1蛋白表达降低,Wnt4 和β-catenin蛋白表达增加(P<0.05);与miR-27a mimic 组相比,miR-27a inhibitor 组细胞内 miR-27a表达下降,细胞增殖、侵袭和迁移能力降低,SFRP1 蛋白表达增加,Wnt4 和β-catenin蛋白表达降低(P<0.05).结论 miR-27a能够靶向调控SFRP1,通过上调SFRP1,阻断下游的Wnt/β-catenin信号通路,抑制结直肠癌细胞的增殖、侵袭和迁移等生物学过程,从而发挥抑癌作用.为临床治疗提供了新方向.

[目的]探讨DANCR在人胚胎干细胞(hESC)向内胚层(DE)分化中的作用.[方法]建立体外诱导hESC向DE分化的体系,检测DANCR的表达水平与DE分化的相关性;利用慢病毒体系敲低hESC的DANCR表达水平,将敲低DANCR的hESC进行DE分化;用qPCR和Western blot方法检测DE分子标志物SOX17和FOXA2,以及原条分子标志物Brachyury(T),EOMES,MIXL1和GSC的表达水平;用Dual luciferase reporter assay和qPCR证明在DE分化过程中DANCR与WNT通路的相互作用.[结果]体外诱导hESC向DE分化的体系能够有效模拟体内DE分化,DANCR的表达水平随DE分化进程逐渐下降.建立敲低DANCR的hESC细胞株,DANCR表达水平相比对照组显著降低(P＜0.001).干扰DANCR表达使分化早期的原条分子标志物Brachyury(T),EOMES,MIXL1和GSC,以及分化后期的DE分子标志物 SOX17和FOXA2 的mRNA表达水平相比对照组显著降低(全部P＜0.05).并且,在DE分化过程中,敲低DANCR组的WNT通路的转录活性相比对照组显著降低(P＜0.05),表现为WNT通路下游基因FZD5,FZD8,SFRP1,FRZB和ANKRD6 mRNA表达水平明显减少(P＜0.05).然而,敲低DANCR对TGFβ通路的SMAD2/3和p-SMAD2 蛋白表达水平没有显著影响(P＞0.05).人为激活细胞内β-CATENIN蛋白活性,能够有效回补由于敲低DANCR导致的DE分化缺陷.[结论]DANCR在DE分化过程中逐渐下调并促进DE分化发生,DAN-CR可能通过与WNT通路相互作用参与调控hESC向DE分化.

目的 通过研究分泌型卷曲相关蛋白1(SFRP1)对头颈鳞状细胞癌(HNSC)增殖、迁移的影响及机制,观测头颈鳞状细胞癌在体外的生物学活动,对治疗头颈鳞状细胞癌提出新的治疗方案.方法 使用生物信息学分析SFRP1在肿瘤中的表达水平及与肿瘤侵袭和增殖的相关性,研究头颈鳞状细胞癌与SFRP1的关系.将头颈鳞状细胞癌细胞SCL-1利用转染敲低SFRP1的表达量,使用干扰SFRP1组(small interfering RNA)和对照组(si-NC)进行CCK-8实验分析、划痕实验分析和Transwell实验分析,分别检测细胞增殖、迁移情况.通过Western blotting实验检测SCL-1细胞中Wnt/β-catenin信号转导通路及C-myc、cyclinD1的表达水平.结果 与对照组头颈鳞状癌细胞相比,皮肤癌细胞SFRP1蛋白表达量降低(P＜0.01);对照组头颈鳞状细胞癌组在24h迁移面积比为0.602± 0.019,而空白组为0.419±0.053、对照组为0.435±0.009,si-SFRP1组迁移能力明显高于对照组和空白组0.01);在Transwell实验中,24 h后si-SFRP1组侵袭的细胞数为(723.333±2.048)个,而空白组为(332.002± 9.930)个、对照组为(343.332±32.504)个,si-SFRP 1组侵袭能力明显高于对照组和空白组(P＜0.01);SCL-1中敲低SFRP1通过Wnt/β-catenin及下游C-myc、cyclinD1表达水平升高(P＜0.01).通过生物信息学数据统计分析,发现敲低SFRP1蛋白,可促进头颈鳞状细胞癌的增殖,对临床分析有一定的指导作用.结论 SFRP1在头颈鳞状细胞癌细胞内低表达,同时通过Wnt/β-catenin信号转导通路促进细胞的增殖和迁移能力.

目的 基于网络药理学及体外实验探究矮地茶治疗骨质疏松症(osteoporosis,OP)的作用机制.方法 使用TCMSP、GeneCards数据库筛选矮地茶治疗骨质疏松症的有效成分及关键靶点(疾病靶点与药物活性成分靶点的交集);使用Cytoscape 3.7.1软件构建"中药-活性成分-交集靶点-疾病"网络;使用STRING数据库构建关键靶点蛋白质-蛋白质相互作用(protein-pro-tein interaction,PPI)网络;通过DAVID数据库对关键靶点进行GO分析和KEGG信号通路富集分析.体外实验使用矮地茶醇提物干预成骨诱导的ST-2细胞,通过碱性磷酸酶染色(alkaline phosphatase,ALP)、RT-qPCR、Western blot等检测其对成骨分化的影响并验证网络药理学信号通路预测结果.结果 共获得槲皮苷、山柰酚、射干醇A、丹皮酚、肉桂醛等193个矮地茶主要活性成分;预测出82个矮地茶与OP的关键靶点,这些关键靶点主要参与调控雌激素信号通路、凋亡、Wnt/β-catenin信号通路等.体外实验显示,矮地茶能有效提高ST-2细胞成骨转录因子表达(P<0.05),同时上调Wnt/β-catenin信号通路关键蛋白β-catenin的表达(P<0.05),并下调通路抑制因子Sfrp1的mRNA水平(P<0.05).结论 矮地茶可通过多靶点、多通路治疗OP,主要与Wnt/β-catenin信号通路有关.

目的 探讨分泌型卷曲相关蛋白5(SFRP5)在肾小管上皮细胞上皮—间质转化(EMT)中的作用及机制.方法 体外以转化生长因子(TGF)-β1刺激人近端肾小管上皮细胞系HK-2细胞,给予SFRP5与细胞共孵育,应用Western Blot法及RT-qPCR检测细胞中的EMT指标[E-钙黏蛋白(E-cadherin)和α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)]的mRNA和蛋白表达水平,Western Blot法检测纤维化指标[Fibronectin(Fn)和Collagen Ⅰ(Col-Ⅰ)]的蛋白水平;并检测Wnt/β-catenin信号通路中细胞质中磷酸化β-catenin或细胞核中活化β-catenin蛋白水平,TOP/FOP-Flash荧光素酶试验评估β-catenin激活介导的转录及下游靶基因c-Myc和cyclin D1的mRNA水平.结果 TGF-β1刺激后上皮细胞固有E-cadherin水平下降,而a-SMA、Fn和Col-Ⅰ表达增多(P＜0.05);胞质中磷酸化(p-S37位点)β-catenin减少且核内β-catenin水平增加,TOP/FOP比率上升,靶基因c-Myc和cyclin D1转录增加(P＜0.05).加入SFRP5共培养细胞后,上述EMT及纤维化指标变化被逆转,异常激活的Wnt/β-catenin通路中各标志物被抑制,再加入SFRP5特异性中和抗体后SFRP5的抑制及保护作用被取消(P＜0.05).结论 本研究首次发现SFRP5可以减轻TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞EMT和纤维化,其机制与抑制异常激活的Wnt/β-catenin信号通路相关,这可能成为临床诊治及延缓慢性肾脏病进展的新靶点.