目的 探讨蛋白激酶R样内质网激酶(PERK)-真核细胞起始因子2α(eIF2α)-活化转录因子4(ATF4)介导的内质网应激通路在磷酸三钙(TCP)磨损颗粒诱导假体周围骨溶解中的作用.方法 取雄性ICR小鼠30只,随机分为3组:假手术组(sham,n=10)、TCP磨损颗粒组(模型组,n=10)和salubrinal干预组(SAL,n=10).采用TCP磨损颗粒诱导小鼠颅骨溶解模型,于术后第2天颅顶局部注射SAL(1 mg/kg),每隔2d1次,持续干预2周.实验结束后处死动物取颅骨和外周血.Western blotting法检测TCP磨损颗粒植入部位周围骨组织中内质网应激分子伴侣葡萄糖调节蛋白78(GRP78)、C/EBP同源蛋白(CHOP)表达水平及PERK-eIF2α-ATF4信号通路的活化情况;HE染色和抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色观察SAL对假体周围骨溶解和破骨细胞形成的影响;Real-time PCR检测SAL对破骨细胞活化相关基因抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)和c-fos的mRNA水平;ELISA法检测SAL对血清中肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素1β(IL-1β)和前列腺素E2(PGE2)水平的影响.结果 TCP磨损颗粒可诱导假体周围骨组织发生内质网应激反应,同时激活PERK-eIF2α-ATF4信号通路,表现为TCP磨损颗粒组小鼠颅骨组织中内质网应激通路蛋白GRP78、CHOP和磷酸化PERK(p-PERK)、磷酸化eIF2α(p-eIF2α)和ATF4蛋白表达均显著上调,而PERK和eIF2α蛋白明显下调(P＜0.05);而颅顶局部注射eIF2α特异性抑制剂SAL可明显阻止TCP磨损颗粒诱导假体周围破骨细胞形成和骨溶解,减少TRAP、MMP-9和cathepsin K的mRNA水平(P＜0.05);同时抑制TNF-α、PGE2和IL4β等炎症因子的产生(P＜0.05).结论 PERK-eIF2α-ATF4介导的内质网应激通路参与调控TCP磨损颗粒诱导的小鼠颅骨溶解;抑制该信号通路可减轻TCP磨损颗粒诱导的假体周围骨溶解和关节松动.

目的:研究磷酸三钙(TCP)磨损颗粒是否能诱导小鼠颅骨假体周围骨细胞损伤,并探讨其作用机制.方法:36只雄性ICR小鼠随机分为3组(n=12):假手术组(Sham)、模型(TCP)组和3-甲基腺嘌呤(3-MA)组,采用TCP磨损颗粒30 mg置于小鼠颅骨中缝骨膜外缝合皮肤构建小鼠颅骨溶解模型.3-MA处理组小鼠于术后第2天颅顶皮下注射自噬的特异性抑制剂3-MA(1.0 mg/kg),2d1次,2周后处死动物取血清和颅骨.Micro-CT分析各组小鼠颅骨骨密度(BMD)、骨体积分数(BVF)和骨吸收孔(porosity)数;HE染色和流式细胞术检测各组假体周围骨细胞活性及凋亡情况;ELISA法检测各组血清中骨细胞特征蛋白牙本质基质蛋白(DMP-1)和骨硬化蛋白(SOST)水平;Western blot法检测各组假体周围骨细胞中DMP-1、SOST和自噬关键分子Beclin-1及微管相关蛋白1轻链3(LC-3)等蛋白的表达.结果:与Sham组比较,TCP组假体周围骨细胞活性明显降低,骨细胞死亡及凋亡显著增加(P＜0.05),血清SOST水平及其蛋白表达明显增加,而血清DMP-1水平及其蛋白表达显著减少(P＜0.05),Beclin-1表达增加,LC-3Ⅰ向LC-3Ⅱ转换明显增加;与TCP组比较,3-MA组假体周围骨细胞损伤明显加重,骨细胞凋亡显著增加(P＜0.05).结论:TCP磨损颗粒可通过激活凋亡和自噬而诱导假体周围骨细胞损伤,促进假体周围骨溶解和关节无菌性松动.

目的 探讨c-Jun氨基末端激酶(JNK)介导的细胞凋亡和自噬是否参与调控磷酸三钙(TCP)磨损颗粒诱导假体周围骨细胞死亡.方法 取雄性ICR小鼠36只,随机分为3组:正常对照组(control,n=12)、TCP磨损颗粒组(模型组,n=12)和SP6000125组(n=12).采用TCP磨损颗粒30 mg置于颅骨顶后缝合皮肤构建小鼠颅骨溶解模型,SP6000125组小鼠于术后第2天颅顶注射JNK通路特异性抑制剂SP600125(1.0 mg/kg),每3日1次.持续干预2周后处死小鼠取颅骨.Calcein-AM探针标记和HE染色观察各组假体周围骨细胞形态和活性变化;通过酶消化法获取假体周围骨细胞,应用流式细胞术检测假体周围骨细胞凋亡情况;Western blotting法检测假体周围骨细胞中Bcl-2、Bax、磷酸化JNK (p-JNK)、Beclin-1和微管相关蛋白1轻链3(LC-3)等蛋白的表达变化.结果 与control组比较,TCP组假体周围骨细胞活性明显降低,空骨陷窝比例显著增加,骨细胞凋亡明显(P＜0.05),JNK通路被活化,p-JNK蛋白表达明显上调(P＜0.05);自噬相关蛋白Beclin-1和LC-3表达显著上调,且LC-3Ⅰ向LC-3Ⅱ转换明显增加(P＜0.05);与TCP组比较,SP600125组假体周围骨细胞凋亡显著减少、自噬被明显抑制(P＜0.05).结论 JNK介导的细胞凋亡和自噬参与调控TCP磨损颗粒诱导的假体周围骨细胞死亡,促进假体周围骨溶解.

目的:研究氧化应激在磷酸三钙(TCP)磨损颗粒诱导假体周围骨细胞凋亡和自噬中的作用.方法:36只雄性ICR小鼠随机分为3组:正常组、TCP磨损颗粒(TCP)组和N-乙酰半胱氨酸(NAC)组,每组12只.TCP组和NAC组小鼠采用TCP磨损颗粒30 mg置于小鼠颅骨中缝骨膜外缝合皮肤构建小鼠颅骨溶解模型,NAC组小鼠于术后第2天颅顶皮下注射抗氧化剂NAC(1.0 mg/kg),2天1次.2周后处死动物取血清和颅骨.应用HE染色观察小鼠假体周围骨细胞活性;ELISA法检测血清中牙本质基质蛋白1(DMP-1)和硬化蛋白(SOST)等骨细胞特征蛋白水平;TUNEL和DCFH-DA染色经流式细胞术检测假体周围骨细胞凋亡和活性氧(ROS)含量的变化;化学比色法检测假体周围骨细胞中丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活性;Western blot法检测小鼠假体周围骨细胞自噬关键分子Beclin-1和微管相关蛋白1轻链3(LC-3)等蛋白的表达变化.结果:与正常组比较,TCP组小鼠假体周围骨细胞死亡、功能损伤及骨细胞凋亡显著增加(P＜0.05),骨细胞中MDA和ROS含量明显升高,而SOD活性明显降低(P＜0.05),自噬相关蛋白Beclin-1和LC-3表达显著上调,LC-3I向LC-3II转换明显增加(P＜0.05);与TCP组比较,NAC组假体周围骨细胞死亡、凋亡及自噬的活化均被明显抑制(P＜0.05).结论:氧化应激参与调控TCP磨损颗粒诱导的假体周围骨细胞凋亡和自噬.

目的:探讨氧化应激对磷酸三钙(TCP)磨损颗粒诱导的假体周围骨溶解的影响及其作用机制.方法:36只雄性ICR小鼠随机分为3组(n=12):假手术(Sham)组、TCP磨损颗粒(TCP)组和N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)组.将TCP磨损颗粒30 mg包埋于小鼠颅骨顶部构建假体周围骨溶解模型,于术后第2天颅顶骨膜局部注射NAC(1.0 mg/kg),隔日1次,持续2周后处死动物采血、取颅骨.抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色观察小鼠颅骨假体周围骨溶解情况;ELISA和化学比色法检测血清中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)、白介素-6(IL-6)和总抗氧化能力(T-AOC)含量及超氧化物歧化酶(SOD)活性;Western blot检测假体周围骨组织中内质网应激标志蛋白葡萄糖调节蛋白78(GRP78)、蛋白激酶R样内质网激酶(PERK)、磷酸化PERK(p-PERK)、真核细胞翻译起始因子2α(eIF2α)和磷酸化eIF2α(p-eIF2α)的表达.结果:与Sham组比较,TCP组小鼠血清TNF-α、IL-1β和IL-6水平及假体周围骨溶解面积显著增加(P＜0.05),T-AOC含量和SOD活性明显降低(P＜0.05),GRP78蛋白质表达、p-PERK/PERK和p-eIF2α/eIF2α值显著升高.与TCP组比较,NAC组小鼠血清TNF-α、IL-1β和IL-6水平及骨溶解面积明显减少(P＜0.05),血清T-AOC含量和SOD活性明显增加(P＜0.05),GRP78蛋白质表达、p-PERK/PERK和p-eIF2α/eIF2α值明显降低.结论:抑制氧化应激可阻止TCP磨损颗粒诱导的假体周围骨溶解,其机制可能与PERK/eIF2α通路的失活有关.

目的:研究原花青素对磷酸三钙(TCP)磨损颗粒诱导小鼠颅骨溶解的保护作用,并探讨其机制.方法:48只雄性ICR小鼠,随机分为假手术(Sham)组、TCP磨损颗粒(TCP)组、原花青素(0.2 mg/kg,1 mg/kg,5 mg/kg)组,每组12只.将TCP磨损颗粒30 mg包埋于小鼠颅骨顶部构建假体周围模型,于术后第2日颅顶局部注射原花青素,隔日1次.2周后处死小鼠采血、取颅骨.抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色和HE染色观察假体周围骨溶解和破骨细胞生成情况;实时荧光定量PCR检测假体周围骨组织中破骨细胞调控基因TRAP、capthesin K、c-Fos和NFATc1的mRNA水平;化学比色法检测血清中丙二醛(MDA)和总抗氧化能力(T-AOC)含量及超氧化物歧化酶(SOD)活性;Western blot法检测小鼠假体周围骨组织中自噬标志蛋白Beclin-1和微管相关蛋白1轻链3(LC-3)表达变化.结果:与Sham组比较,TCP组假体周围骨溶解面积、破骨细胞生成及其调控基因mRNA水平显著增加(P<0.05),血清MDA含量均明显升高、T-AOC水平和SOD活性明显降低(P<0.05),假体周围骨组织中Beclin-1和LC-3均表达显著上调、LC-3I向LC-3II转换明显增加(P<0.05).与TCP组比较,原花青素组假体周围骨溶解面积、破骨细胞生成及其上述调控基因、血清MDA含量明显减少(P<0.05),血清T-AOC含量和SOD活性显著增加(P<0.05)且Beclin-1和LC-3等蛋白表达及LC-3I向LC-3II转换也明显下调.结论:原花青素对TCP磨损颗粒所致的假体周围骨溶解具有明显保护作用,其机制可能与减轻氧化应激反应和自噬的活化密切相关.

目的:研究原花青素(PC)对磷酸三钙(TCP)磨损颗粒诱导的骨细胞氧化损伤的影响,并探讨其可能的作用机制.方法:将TCP磨损颗粒(0.1 g/L)与小鼠长骨MLO-Y4骨细胞共孵育构建骨细胞体外损伤模型,实验分为4组:正常对照(control)组、TCP组、PC(10μmol/L)组和PC(50μmol/L)组.应用Calcein-AM染色和MTT等方法检测骨细胞活力;ELISA检测细胞培养上清液中牙本质基质蛋白1(DMP-1)、骨硬化蛋白(SOST)及白细胞介素1β(IL-1β)水平;流式细胞术定量分析骨细胞凋亡情况;化学比色法检测骨细胞中丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活性,以及细胞培养上清液中乳酸脱氢酶(LDH)释放量;Western blot法检测骨细胞中NOD样受体蛋白3(NLRP3)、含CARD的凋亡相关斑点样蛋白(ASC)、cleaved caspase-1和IL-1β蛋白水平的变化.结果:与control组比较,TCP组MLO-Y4细胞的损伤、凋亡率及MDA含量显著增加(P<0.05),SOD活性显著降低(P<0.05),NLRP3、ASC、cleaved caspase-1和IL-1β蛋白水平显著上调,上清液中IL-1β和LDH的水平明显增加(P<0.05);与TCP组比较,PC组MLO-Y4细胞的损伤明显减轻,凋亡率显著降低(P<0.05),NLRP3、ASC、cleaved caspase-1和IL-1β的蛋白水平显著下调(P<0.05),IL-1β和LDH水平明显降低(P<0.05).结论:PC可明显抑制TCP磨损颗粒诱导的骨细胞氧化损伤,其机制可能与减轻NLRP3炎症小体的活化和细胞焦亡相关.

目的:研究佛手苷内酯(BP)对磷酸三钙(TCP)磨损颗粒诱导骨细胞损伤的影响,并阐明其可能作用机制.方法:将TCP磨损颗粒与小鼠骨细胞MLO-Y4细胞共孵育48 h建立骨细胞体外损伤模型,随机分为正常对照(Control)组、TCP磨损颗粒(TCP,0.1 mg/ml)组、佛手苷内酯(1μmol/L)组、佛手苷内酯(5μmol/L)组和佛手苷内酯(20μmol/L)组.MTT法和Calcein-AM染色检测各组骨细胞活性和形态改变;Hoechst 33342染色和流式细胞术分析各组骨细胞凋亡情况;实时荧光定量PCR检测各组骨细胞特征蛋白牙本质基质蛋白-1(DMP-1)、骨硬化蛋白(SOST)、成纤维细胞生长因子23(FGF23)的mRNA水平;Western blot法检测各组骨细胞中内质网应激标志蛋白葡萄糖调节蛋白78(GRP78)、蛋白激酶R样内质网激酶(PERK)、磷酸化PERK(p-PERK)、真核细胞翻译起始因子2α(eIF2α)、磷酸化eIF2α(p-eIF2α)、活性转录因子(ATF4)和C/EBP同源蛋白(CHOP)等的表达及caspase-3的活化变化.结果:与Control组比较,TCP组骨细胞的活性和DMP-1的mRNA水平显著降低(P<0.05),骨细胞凋亡率及SOST、FGF23的mRNA水平显著增加(P<0.05),GRP78、ATF4和CHOP等蛋白质表达、p-PERK/PERK值和p-eIF2α/eIF2α值显著升高;与TCP组比较,佛手苷内酯组骨细胞损伤明显减轻,骨细胞凋亡率显著减少(P<0.05),GRP78、ATF4和CHOP等蛋白质表达、p-PERK/PERK值和p-eIF2α/PERK值也明显下降(P<0.05).结论:佛手苷内酯可明显抑制TCP磨损颗粒所致的骨细胞损伤,其机制可能与减弱TCP磨损颗粒诱导的内质网应激反应及P E RK通路的活化密切相关.

目的:观察佛手苷内酯对磷酸三钙(TCP)磨损颗粒所致假体周围骨溶解的影响,探讨其可能作用机理.方法:60只雄性ICR小鼠随机分为5组(每组n=12):假手术组(Sham组)、TCP磨损颗粒组(TCP组)、佛手苷内酯5 mg/kg组、佛手苷内酯10 mg/kg组和佛手苷内酯20 mg/kg组.TCP磨损颗粒30 mg包埋于小鼠颅骨顶部建立小鼠假体周围骨溶解模型,Sham组小鼠仅进行原位缝合,不包埋颗粒.Sham组和佛手苷内酯组小鼠分别于术后第2天颅顶局部注射生理盐水和佛手苷内酯,隔日1次.2周后处死动物采血、取颅骨.采用抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色和HE染色观察小鼠颅骨假体周围骨溶解和破骨细胞生成情况;化学比色法检测血清中TRAP和组织蛋白酶K(cathepsin K)活性及乳酸脱氢酶(LDH)含量;ELISA法检测血清中肿瘤坏死因子-alpha(TNF-α)、白介素-1beta(IL-1β)、白介素(IL)-18和核因子-κB受体活化因子配体(RANKL)的水平;western blot检测假体周围骨组织中炎症小体活化相关蛋白Nod样受体蛋白3(NLRP3)和凋亡相关斑点样蛋白(ASC)及细胞焦亡标志蛋白切割型半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1(cleaved caspase-1)和IL-1β等的表达.结果:与Sham组比较,TCP组小鼠假体周围骨溶解面积和破骨细胞生成显著增加(P<0.05)、血清中TRAP和cathepsin K活性及RANKL、TNF-α、IL-1β、IL-18和LDH水平明显升高(P<0.05),NLRP3、ASC、cleaved caspase-1和IL-1β等蛋白表达显著上调(P<0.05);与TCP组比较,佛手苷内酯组小鼠假体周围骨溶解面积和破骨细胞生成、血清中TRAP和cathepsin K活性及RANKL、TNF-α、IL-1β、IL-18和LDH水平明显减少(P<0.05),NLRP3、ASC、cleaved caspase-1和IL-1β等蛋白表达也呈明显下调(P<0.05).佛手苷内酯对TCP磨损颗粒诱导的上述检测指标上调的抑制作用具有一定的剂量依赖性(P<0.05).结论:佛手苷内酯可通过减弱NLRP3炎症小体活化及细胞焦亡从而阻止TCP磨损颗粒所致的假体周围骨溶解和破骨细胞生成.

目的 观察重楼皂苷Ⅰ (PPI)对磷酸三钙(TCP)磨损颗粒诱导的成骨细胞损伤的影响,并探讨其调控机制.方法 通过消化法从SD大鼠颅骨中获得原代成骨细胞,应用碱性磷酸酶(ALP)染色鉴定成骨细胞.TCP磨损颗粒(0.1 mg/mL)与成骨细胞共孵育48 h制备成骨细胞损伤模型,实验随机分为对照组、模型组和PPI(30、100 μg/mL)组.CCK-8和化学比色法分别测定成骨细胞活力和上清液中乳酸脱氢酶(LDH)水平;实时荧光定量PCR法检测成骨细胞中ALP、Ⅰ型胶原(CollagenⅠ)和Runt相关转录因子2(RUNX2) mRNA水平;Annexin-V/PI染色经流式细胞术定量分析成骨细胞凋亡情况;应用茜素红S染色观察成骨细胞矿化结节形成;Western blotting法检测成骨细胞中Bcl-2、Bax、cleaved Caspase-3、Atg5、p62和微管相关蛋白1轻链3 (LC-3)蛋白的表达.结果 与对照组比较,模型组成骨细胞活性降低,特征蛋白ALP、CollagenⅠ、RUNX2 mRNA水平及矿化结节形成显著减少,LDH释放量、细胞凋亡和Bax、cleaved Caspase-3、Atg5和LC-3等蛋白表达及LC-3II/LC-3I值明显增加,而Bcl-2和p62蛋白表达显著减少;与模型组比较,PPI各组成骨细胞活性升高,ALP、Collagen Ⅰ和RUNX2 mRNA水平和矿化结节形成明显增加,LDH释放和细胞凋亡显著减少,Bax、cleaved Caspase-3、Atg5和LC-3蛋白表达及LC-3II/LC-3I值也明显减少,而Bcl-2和p62蛋白表达显著增加.结论 PPI可通过抑制自噬的活化而减轻TCP磨损颗粒诱导的成骨细胞损伤.