目的 建立基于TaqMan探针的非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)E301R基因荧光定量PCR(fluo-rescent quantitative polymerase chain reaction,qPCR)检测方法,并进行验证,以期应用于临床样本中ASFV的检测.方法 通过对ASFVE301R基因序列进行分析,选择基因保守区设计特异性引物和TaqMan探针.PCR扩增E301R基因片段,克隆至pCAGGS载体,构建质粒标准品,建立基于TaqMan探针的qPCR检测方法,并验证方法的线性范围、精密性、特异性、敏感性及准确性.采用建立的方法检测92份临床样本,并与商品化ASFV荧光PCR试剂盒检测结果进行比较.另采用建立的方法对E301R基因转录动力学进行分析.结果 质粒标准品在1.6×(101～108)拷贝/μL范围内,与Ct呈良好的线性关系,线性回归方程为:y=-3.239 x+40.774,R2=0.994;重复性及中间精密性验证CV均＜2％;除 ASFV外,猪瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and re-spiratory syndrome virus,PRRSV)、伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)及猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)均未出现扩增曲线;最低可稳定检出1.6× 101拷贝/μL的质粒标准品;浓度为1.6× 102和1.6× 101拷贝/μL质粒标准品的加标回收率在90％～110％之间.建立的方法与商品化ASFV荧光PCR试剂盒对92份临床样本检测结果的符合率为96.7％(Kappa=0.932,P=1.000).E301R基因可能为ASFV感染的中期转录基因.结论 建立的基于TaqMan探针的qPCR检测方法具有良好的精密性、特异性、敏感性及准确性,可用于临床样本中ASFV的检测.

目的 建立同时检测猪用疫苗中牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)和非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)2种病原的双重荧光PCR方法,并进行验证及初步应用.方法 根据NCBI中收录的BVDV 5'UTR和ASFV VP72基因序列,分别设计1对特异性引物和1条TaqMan探针,建立一种能同时检测BVDV和ASFV的双重荧光PCR方法.对建立的方法进行灵敏度、特异性和精密性验证.采用建立的方法分别检测猪伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)活疫苗和猪瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)活疫苗(76批次)以及添加 BVDV 和重组质粒pMD-VP72的猪PRV活疫苗(各5瓶)中的BVDV和ASFV,并按照《中华人民共和国兽药典》三部(2020版)和中华人民共和国农业农村部公告第172号规定的方法分别对BVDV和ASFV进行复核检测.结果 建立的双重荧光PCR法最低可检测浓度为4.2拷贝/μL的BVDV重组质粒和浓度为8.7拷贝/μL的ASFV重组质粒;不与其他常见病原体发生交叉反应;重复性和试验间精密性检测的变异系数(CV)均不高于2％.结论 本实验建立的双重荧光PCR方法灵敏度高,特异性强,精密性好,可用于猪用疫苗中外源病毒的快速检测及猪用疫苗等生物制品的质量控制.

目的 探讨结直肠癌组织中Janus激酶2(JAK2)基因突变和T细胞因子3(TCF3)蛋白表达与临床病理特征及预后的相关性,为结直肠癌病情和预后早期评估提供实验室参考指标.方法 回顾性分析2016年1月～2021年4月收治且保留结直肠癌及癌旁组织蜡块的50例结直肠癌患者资料,收集患者的基本资料,TNM分期、淋巴结转移等临床病理特征及3年生存预后.对患者的结肠癌及癌旁组织蜡块进行检测,采用Taqman荧光探针法检测结肠癌组织JAK2基因rs2230724位点AA、AG和GG等基因型分布情况,通过免疫组化法检测结肠癌及癌旁组织TCF3蛋白阳性表达率.比较不同临床病理特征患者的基本资料、JAK2 rs2230724基因突变和TCF3蛋白表达情况,Logistics回归模型分析结肠癌临床病理特征的影响因素.采用Kaplan-Meier生存曲线分析比较结直肠癌组织JAK2基因突变和TCF3蛋白表达患者的生存预后,采用Cox回归模型分析影响结直肠癌患者预后的危险因素.结果 结肠癌组织TCF3蛋白阳性表达率均高于癌旁组织(P＜0.05).TNM Ⅲ期结肠癌患者的年龄、BMI、结肠癌组织JAK2基因rs2230724位点GG型占比和TCF3蛋白阳性表达率均高于TNM Ⅰ～Ⅱ期患者(P＜0.05);存在淋巴结转移结肠癌患者的年龄、BMI、吸烟率、结肠癌组织JAK2基因rs2230724位点GG型占比和TCF3蛋白阳性表达率均高于无淋巴结转移患者(P＜0.05);Logistics回归模型分析结果显示,结肠癌TNM分期、淋巴结转移等临床病理特征的影响因素均为年龄、结肠癌组织JAK2基因rs2230724位点突变情况和TCF3蛋白阳性表达率(P＜0.05).Kaplan-Meier生存曲线分析结果显示,结肠癌组织JAK2基因rs2230724位点GG型和TCF3蛋白阳性患者均具有更高的累计全因死亡率(P＜0.05).单因素和多因素Cox回归模型分析结果显示,影响结直肠癌患者预后的独立危险因素有JAK2基因rs2230724位点GG型、TCF3蛋白阳性表达、TNM Ⅲ期、淋巴结转移和年龄等.结论 结直肠癌组织中JAK2基因rs2230724位点GG型占比和TCF3蛋白表达均与其临床病理特征及预后相关,可作为结直肠癌临床病理特征评估及预后预测参考指标.

目的:建立一种人星状病毒TaqMan实时荧光定量RT-PCR(real-time reverse transcription-polymerase chain reaction)快速检测方法。方法:根据人星状病毒 ORF1 b基因的保守序列设计扩增引物和特异性荧光探针，建立星状病毒TaqMan实时荧光定量RT-PCR快速检测方法，并对该方法的特异性、灵敏度和稳定性进行评价，同时应用该方法对实际临床样本中的星状病毒进行检测。 结果:所建立的人星状病毒TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测方法具有良好的特异性和稳定性，灵敏度可达10 2拷贝/μl，对星状病毒临床样本检测后，检出率达100%。 结论:本文所建立的人星状病毒TaqMan实时荧光定量RT-PCR法具有简单快速、灵敏度高、特异性强、稳定性好的特点，可应用于临床星状病毒的病原检测和流行病学调查。

鼠疫是由鼠疫耶尔森菌（以下简称鼠疫菌）引起的一种烈性传染病，发病急、传播快且病死率极高。历史上发生过3次鼠疫大流行，导致上亿人口死亡。近20年来全球鼠疫疫情呈上升趋势，2000 - 2018年，世界卫生组织（WHO）共收到来自美洲、非洲和亚洲21个国家报告的2万多起鼠疫病例 [1]。我国动物间鼠疫一直较为活跃，且除个别年份外，几乎每年都有人间鼠疫发生。2019年11月，北京市首先出现2例内蒙古自治区输入性肺鼠疫病例，随后内蒙古自治区又报道2例腺鼠疫病例，提示这一甲类传染病仍对人们的生命安全具有极大的潜在威胁 [2,3,4]。链霉素是WHO鼠疫手册 [5]和我国《鼠疫诊疗方案（试行）》（卫办应急发[2011]第18号） [6]中治疗鼠疫的首选药物。但值得注意的是，2021年Dai等 [7]发现国内1株鼠疫菌因编码核糖体蛋白S12的rpsL基因第128 bp位点的碱基发生了突变，从而产生了对链霉素的高度耐药性。为此，本研究应用基于TaqMan-MGB荧光探针的实时荧光PCR法（简称MGB荧光探针法），选取鼠疫流行较为严重的玉树藏族自治州（以下简称玉树州）鼠疫自然疫源地内分离的鼠疫菌，检测链霉素耐药位点rpsL基因第128 bp位点碱基的突变情况，判断当地菌株的耐药情况，为鼠疫疫情的防控提供参考。

目的:探讨载脂蛋白(apolipoprotein，apo)C1基因 (APOC1)rs4420638A/G和－317H1/H2位点多态性与中国妇女子痫前期(pre-eclampsia，PE)发生的相关性及其对临床和代谢指标的影响。 方法:本研究包括289例PE患者和824例无妊娠并发症的对照孕妇。采用Taqman荧光探针和聚合酶链反应-限制性片段长度多态性方法分别测定 APOC1 rs4420638A/G和－317H1/H2位点多态性，采用酶法和PEG增强免疫比浊法分别测定血脂和apo水平。 结果:APOC1基因rs4420638A/G和－317H1/H2位点基因型频率与等位基因频率在PE组和对照组之间差异无统计学意义( P>0.05)。但是，携带rs4420638位点G等位基因的PE患者有更高的血清甘油三酯、非高密度脂蛋白-胆固醇、apoB水平以及apoB/apoA1比值( P<0.05)。携带－317H1/H2位点H2等位基因的PE患者有更小的分娩孕周( P<0.05)。 结论:APOC1基因rs4420638和－317H1/H2位点多态性与PE患者血浆脂蛋白代谢异常有关。未发现这两个基因多态性与中国妇女PE发生的风险相关联。

目的:探讨ZNA （ZIP Nucleic Acid）探针的PCR性能及其在沙眼衣原体（CT）核酸定量检测中的研究。方法:使用CT阳性质粒，比较偶联不同ZIP数量的ZNA探针的PCR扩增曲线差异；比较ZNA探针与29mer普通Taqman探针（DNA长探针）、20mer普通Taqman探针（DNA短探针）、MGB探针在PCR扩增曲线、反复冻融稳定性及低浓度质粒检出率的差异；使用CT阳性临床样本，比较ZNA探针与DNA长探针、DNA短探针、MGB探针扩增曲线差异及低浓度样本检出率的差异。结果:（1）偶联5个ZIP单位的ZNA探针Ct值和荧光值最优，与偶联1个ZIP的探针相比：Ct值提升1.34 （灵敏度提升2.37倍），荧光值提升30%。（2）偶联5个ZIP的ZNA探针的扩增效率是优选的普通Taqman探针和MGB探针的2.14~2.64倍，荧光值高17%~90%。（3）四组探针冻融稳定性结果显示，ZNA探针的稳定性最佳，低浓度（1×10 4拷贝/mL）的Ct值偏离最小（CV%= 1.4），优于DNA长探针、DNA短探针、MGB探针（CV%= 1.7~3.7）。（4）用35例CT临床样本比较四组探针（DNA长探针、DNA短探针、MGB探针、ZNA探针）的PCR扩增性能，相对于其他三组探针，ZNA探针的扩增灵敏度分别提升1.60倍、0.99倍和1.06倍，且Ct值一致性分析结果显示，ZNA探针对临床样本的检出性能提升更优。（5）使用低浓度质粒模板（分别为200、100、50和10拷贝/mL）比较四组探针的扩增灵敏度，ZNA探针的检出率均优于DNA长探针、DNA短探针、MGB探针；在最低浓度10拷贝/mL时，其他三组探针的检出率只有15%~20%，ZNA探针仍有30%。（6）在20例不同低浓度（分别为200、150、100和50拷贝/mL）临床样本中ZNA探针检出率最高，分别为100%、95%、90%和70%。 结论:偶联5个ZIP的ZNA探针的扩增效率、荧光值、冻融稳定性、临床样本的扩增性能及低浓度样本检出灵敏度都优于普通Taqman探针和MGB探针，ZNA探针可作为一种设计灵活和合成易得的新探针技术，在基因表达领域可进一步提升检测的灵敏度及低浓度样本的检出率。

目的:建立一种快速检测新型冠状病毒N亚基因组（SgN）的方法，探讨其在新型冠状病毒肺炎病例及环境样本中的应用价值。方法:根据全球共享流感数据库（GISAID）公布的新型冠状病毒全基因组序列设计SgN特异性引物和探针，优化退火温度、引物与探针浓度等反应条件，建立新型冠状病毒SgN荧光定量PCR检测方法，绘制标准曲线，评价该方法的灵敏性、重复性和特异性。采用建立的病毒SgN荧光定量PCR检测方法检测21份环境和351份临床样本，并选取25份SgN阳性样本进行病毒分离以评估该检测方法的应用效果。结果:SgN的引物和探针对新型冠状病毒具有良好特异性。初步建立的病毒SgN荧光定量PCR检测方法最低检测限为1.5×10 2copies/ml，变异系数小于1%。372份样本的gRNA阳性率为97.04%（361/372），gRNA阳性样本中阳性环境样本和阳性临床样本的SgN阳性率分别为36.84%（7/19）和49.42%（169/342）。其中野生型毒株样本的SgN阳性率及拷贝数均比德尔塔（Delta）毒株低。在25份SgN阳性样本中，采样时间在5 d内的12份样本均分离到病毒；13份采样时间在12 d以上的样本未发生细胞病变。 结论:成功建立了一种检测新型冠状病毒SgN的荧光定量PCR方法，该方法的灵敏度、特异性和重复性均较好。

目的:建立实时荧光定量PCR方法检测布鲁氏菌基因组内IS711转座酶基因（orfA基因）的拷贝数，并应用于布鲁氏菌种与生物型的鉴定。方法:构建基于Taqman探针法实时荧光定量PCR技术的orfA基因拷贝数的检测体系。设计bcsp31基因和orfA基因的引物和探针，应用实时荧光定量PCR方法同时检测同一菌株相同DNA浓度下的bcsp31基因和orfA基因含量，获得2个基因的循环数（CT值），再根据bcsp31基因和orfA基因CT值的差异，换算出待检测布鲁氏菌菌株基因组内orfA基因的拷贝数。同时，将布鲁氏菌16M菌株DNA进行2倍递减稀释，验证检测体系的稳定性。结果:当16M菌株DNA浓度相差2倍时，实时荧光定量PCR方法同时检测bcsp31基因和orfA基因，测得的CT值差值均值均为1.00，95%置信区间为0.95~1.05，标准差为0.17，变异系数为0.17。应用该检测体系检测30株布鲁氏菌菌株DNA中orfA基因的拷贝数，发现羊种生物1~3型菌株分别有6、9和7个拷贝数；猪种生物2型菌株有10个拷贝数，与其他4个猪种生物型（1、3~5）菌株拷贝数不同；绵羊附睾种菌株有37个拷贝数；8个牛种生物型（1~7、9）菌株拷贝数稳定在5~6个。结论:成功建立了一种检测布鲁氏菌orfA基因拷贝数的实时荧光定量PCR方法，该方法能够鉴定部分布鲁氏菌种与生物型菌株。

目的:开发和评估一种快速、简单和经济的替代测序的Omicron变异株荧光定量RT-PCR(RT-qPCR)。方法:针对SARS-CoV-2 ORF1ab保守区域、Omicron变异株S基因高频共同突变位点设计引物和TaqMan探针，建立Omicron株RT-qPCR检测方法，用经全基因组测序确定型别的样本进行验证，并对该方法的特异度和敏感度进行评估。结果:本研究建立的RT-qPCR分型法可以将Omicron变异株与包括早期A型流行株、Alpha和Delta变异株在内的SARS-CoV-2毒株进行区分，结果与全基因组测序结果一致，符合率为100.00%(28/28)；与其他6种呼吸道病毒及柯萨奇病毒A组16型无交叉反应；该方法RNA标准品在10 9~10 3拷贝/μl之间呈良好的线性关系，相关系数 R2均大于0.99，检测敏感度为10 3拷贝/μl。 结论:本研究设计的针对Omicron变异株的RT-qPCR敏感度高且特异度好，在任何可以进行PCR检测的实验室中都容易开展，可极大地促进对Omicron变异株的传播监测。