目的:建立一种人星状病毒TaqMan实时荧光定量RT-PCR(real-time reverse transcription-polymerase chain reaction)快速检测方法。方法:根据人星状病毒 ORF1 b基因的保守序列设计扩增引物和特异性荧光探针，建立星状病毒TaqMan实时荧光定量RT-PCR快速检测方法，并对该方法的特异性、灵敏度和稳定性进行评价，同时应用该方法对实际临床样本中的星状病毒进行检测。 结果:所建立的人星状病毒TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测方法具有良好的特异性和稳定性，灵敏度可达10 2拷贝/μl，对星状病毒临床样本检测后，检出率达100%。 结论:本文所建立的人星状病毒TaqMan实时荧光定量RT-PCR法具有简单快速、灵敏度高、特异性强、稳定性好的特点，可应用于临床星状病毒的病原检测和流行病学调查。

鼠疫是由鼠疫耶尔森菌（以下简称鼠疫菌）引起的一种烈性传染病，发病急、传播快且病死率极高。历史上发生过3次鼠疫大流行，导致上亿人口死亡。近20年来全球鼠疫疫情呈上升趋势，2000 - 2018年，世界卫生组织（WHO）共收到来自美洲、非洲和亚洲21个国家报告的2万多起鼠疫病例 [1]。我国动物间鼠疫一直较为活跃，且除个别年份外，几乎每年都有人间鼠疫发生。2019年11月，北京市首先出现2例内蒙古自治区输入性肺鼠疫病例，随后内蒙古自治区又报道2例腺鼠疫病例，提示这一甲类传染病仍对人们的生命安全具有极大的潜在威胁 [2,3,4]。链霉素是WHO鼠疫手册 [5]和我国《鼠疫诊疗方案（试行）》（卫办应急发[2011]第18号） [6]中治疗鼠疫的首选药物。但值得注意的是，2021年Dai等 [7]发现国内1株鼠疫菌因编码核糖体蛋白S12的rpsL基因第128 bp位点的碱基发生了突变，从而产生了对链霉素的高度耐药性。为此，本研究应用基于TaqMan-MGB荧光探针的实时荧光PCR法（简称MGB荧光探针法），选取鼠疫流行较为严重的玉树藏族自治州（以下简称玉树州）鼠疫自然疫源地内分离的鼠疫菌，检测链霉素耐药位点rpsL基因第128 bp位点碱基的突变情况，判断当地菌株的耐药情况，为鼠疫疫情的防控提供参考。

目的:开发用于甲型流感病毒快速分型的Taqman低密度芯片(Taqman low density array，TLDA)，可以同时开展甲型流感病毒通用、H1-H16及N1-N9亚型高通量快速鉴定，适用于流感样病例及禽流感标本中甲型流感病毒的快速分型鉴定。方法:设计甲型流感病毒通用、H1-16亚型、N1-9亚型的引物探针，并将其预先定制在TLDA反应芯片上；优化TLDA退火温度；用多种亚型的甲型流感病毒核酸进行10倍梯度稀释，结合微滴式数字PCR定量方法评价TLDA检测灵敏度；用乙型流感病毒、腺病毒、呼吸道合胞等其他多种常见的呼吸道病毒验证该TLDA检测特异性，同时选用多种已经明确分型的甲型流感病毒评价该TLDA的特异性和有效性；采集16例流感样病例标本及24例禽流感外环境标本用该芯片开展检测。结果:该TLDA的最佳退火温度为60 ℃；针对甲型流感病毒H1N1、H3N2、H5N6、H7N9和H9N2，其检测灵敏度为1.52~8.00拷贝/μl；能特异性检测甲型流感病毒，与其他常见呼吸道病毒无交叉反应，并能精准鉴定多种甲型流感病毒的亚型；应用该方法检测16例流感样病例标本和24例禽流感外环境监测标本，均可分型。结论:基于TLDA技术建立的甲型流感病毒高通量快速分型检测方法具有较好的灵敏度和特异性，适用于流感样病例和禽流感标本的病原快速检测，特别是对目前用常规商业化试剂尚无法鉴定的新型甲型流感病毒能够进行快速的亚型筛查与鉴定。

目的:探讨5-羟色胺1A(5-HTR1A)rs6295位点、5-羟色胺2A(5-HTR2A)rs6311位点基因多态性与选择性5-羟色胺再摄取抑制剂(SSRIs)抗抑郁疗效的关系。方法:选择2018年5月至2020年10月烟台市心理康复医院收治的150例抑郁症患者，均采用SSRIs抗抑郁治疗8周。根据治疗8周后汉密尔顿抑郁量表(HAMD)评分将患者分为有效组(HAMD评分较治疗前下降≥50%，85例)和无效组(HAMD评分较治疗前下降<50%，65例)。采集外周静脉血，TaqMan探针SNP基因分型技术检测5-HTR1A rs6295、5-HTR2A rs6311位点基因多态性，分析其与SSRIs抗抑郁疗效的关系。结果:两组5-HTR1A rs6295位点等位基因G、C分布、基因型分布差异无统计学意义( P>0.05)。5-HTR2A rs6311位点等位基因C、T分布、基因型分布差异均具有统计学意义( P<0.05)。5-HTR2A rs6311位点基因CC型患者对SSRIs抗抑郁疗效敏感度高于TT型患者( OR＝2.139，95% CI：1.612~9.354)，C等位基因抑郁症患者对SSRIs抗抑郁疗效敏感度高于T等位基因患者( OR＝2.926，95% CI：1.512~13.265)。5-HTR1A rs6295位点不同基因分型患者治疗期间HAMD评分差异无统计学意义( P>0.05)，5-HTR2A rs6311位点基因CC型患者治疗2、4、6、8周时的HAMD评分低于TT型和CT型( P<0.05)，TT型和CT型之间差异无统计学意义( P>0.05)。 结论:5-HTR2A rs6311位点基因多态性可能与SSRIs抗抑郁疗效有关，携带CC基因型可能是对SSRIs抗抑郁治疗敏感人群。

目的:探究内质网氨基肽酶1（endoplasmic reticulum aminopeptidase 1， ERAP1）是否为子痫前期发病的遗传易感基因，以及 ERAP1参与子痫前期发病的分子机制。 方法:回顾性选择2018年9月至2021年4月在青岛大学附属医院、枣庄市妇幼保健院等6家山东省地级市三甲医院的990例子痫前期患者（病例组）和1 240例健康孕妇（对照组）。收集所有孕妇的外周血样本，提取DNA，通过Taqman探针聚合酶链反应技术进行rs30187、rs27044及rs469783位点的基因分型；并在构建 ERAP1野生型质粒的基础上使用点突变法构建2种错义变异质粒：rs30187（c.1583A>G）、rs27044（c.2188C>G），将不同的转染分子转染至Htr8细胞中，检测ERAP1的表达水平，并通过Transwell迁移实验、Transwell侵袭实验、细胞划痕实验和细胞增殖实验检测不同转染对细胞功能的影响，根据转染分子的不同，分为以下6组：敲低对照组、敲低组、过表达对照组、过表达组、变异1组及变异2组。采用两独立样本 t检验、秩和检验和 χ 2检验进行统计学分析。 结果:（1）rs30187位点的遗传学分布（基因型： χ 2=29.25；等位基因： χ 2=4.68）、rs27044位点的基因型分布（ χ 2=28.95）、rs469783位点的遗传学分布（基因型： χ 2=7.01，等位基因： χ 2=6.45）在病例组和对照组间差异有统计学意义（ P值均<0.05）。病例组中rs30187和rs27044位点均是隐性基因CC的频率更高（ χ 2值分别为20.82和19.97， P值均<0.05），而rs469783位点的显性基因中CC基因型的频率更低（ χ 2=5.82， P=0.016）。（2）细胞转染后，与敲低对照组相比，敲低组ERAP1的表达水平明显下降（mRNA：0.5±0.1与1.0±0.0， t=7.49；蛋白：0.4±0.1与0.7±0.1， t=2.81； P值均<0.05）；划痕48 h后，敲低组细胞迁移率明显下降［（16.5%±1.8%）与（23.8%±2.4%）， t=3.33， P=0.031］；细胞培养24 h后，敲低组Transwell细胞数量明显下降（423.7±21.3与499.0±24.6， t=3.29， P=0.031）。转染变异1组和变异2组后，与过表达组相比，ERAP1的mRNA和蛋白表达也均明显下降，Transwell小室细胞穿过的数量明显下降，划痕48 h后细胞迁移率均表现出下降趋势［变异1组： P=0.004，变异2组：（21.1±4.6）%与（28.3±1.1）%， t=2.10， P=0.099］。转染过表达组至细胞后，与过表达对照组相比，ERAP1的mRNA和蛋白表达明显上升，细胞的增殖能力增强，细胞划痕48 h后迁移率升高，24 h穿过Transwell小室的细胞数量增多，细胞侵袭能力增强（ P值均<0.05）。 结论:ERAP1基因rs30187、rs27044和rs46978与子痫前期易感性相关，rs30187和rs27044位点上子痫前期患者CC基因型携带者更多，而rs469783位点上健康孕妇CC基因型的携带者更多。ERAP1可能通过影响滋养层细胞的迁移侵袭能力参与子痫前期的发病。

目的:建立实时荧光定量PCR方法检测布鲁氏菌基因组内IS711转座酶基因（orfA基因）的拷贝数，并应用于布鲁氏菌种与生物型的鉴定。方法:构建基于Taqman探针法实时荧光定量PCR技术的orfA基因拷贝数的检测体系。设计bcsp31基因和orfA基因的引物和探针，应用实时荧光定量PCR方法同时检测同一菌株相同DNA浓度下的bcsp31基因和orfA基因含量，获得2个基因的循环数（CT值），再根据bcsp31基因和orfA基因CT值的差异，换算出待检测布鲁氏菌菌株基因组内orfA基因的拷贝数。同时，将布鲁氏菌16M菌株DNA进行2倍递减稀释，验证检测体系的稳定性。结果:当16M菌株DNA浓度相差2倍时，实时荧光定量PCR方法同时检测bcsp31基因和orfA基因，测得的CT值差值均值均为1.00，95%置信区间为0.95~1.05，标准差为0.17，变异系数为0.17。应用该检测体系检测30株布鲁氏菌菌株DNA中orfA基因的拷贝数，发现羊种生物1~3型菌株分别有6、9和7个拷贝数；猪种生物2型菌株有10个拷贝数，与其他4个猪种生物型（1、3~5）菌株拷贝数不同；绵羊附睾种菌株有37个拷贝数；8个牛种生物型（1~7、9）菌株拷贝数稳定在5~6个。结论:成功建立了一种检测布鲁氏菌orfA基因拷贝数的实时荧光定量PCR方法，该方法能够鉴定部分布鲁氏菌种与生物型菌株。

目的:探讨ZNA （ZIP Nucleic Acid）探针的PCR性能及其在沙眼衣原体（CT）核酸定量检测中的研究。方法:使用CT阳性质粒，比较偶联不同ZIP数量的ZNA探针的PCR扩增曲线差异；比较ZNA探针与29mer普通Taqman探针（DNA长探针）、20mer普通Taqman探针（DNA短探针）、MGB探针在PCR扩增曲线、反复冻融稳定性及低浓度质粒检出率的差异；使用CT阳性临床样本，比较ZNA探针与DNA长探针、DNA短探针、MGB探针扩增曲线差异及低浓度样本检出率的差异。结果:（1）偶联5个ZIP单位的ZNA探针Ct值和荧光值最优，与偶联1个ZIP的探针相比：Ct值提升1.34 （灵敏度提升2.37倍），荧光值提升30%。（2）偶联5个ZIP的ZNA探针的扩增效率是优选的普通Taqman探针和MGB探针的2.14~2.64倍，荧光值高17%~90%。（3）四组探针冻融稳定性结果显示，ZNA探针的稳定性最佳，低浓度（1×10 4拷贝/mL）的Ct值偏离最小（CV%= 1.4），优于DNA长探针、DNA短探针、MGB探针（CV%= 1.7~3.7）。（4）用35例CT临床样本比较四组探针（DNA长探针、DNA短探针、MGB探针、ZNA探针）的PCR扩增性能，相对于其他三组探针，ZNA探针的扩增灵敏度分别提升1.60倍、0.99倍和1.06倍，且Ct值一致性分析结果显示，ZNA探针对临床样本的检出性能提升更优。（5）使用低浓度质粒模板（分别为200、100、50和10拷贝/mL）比较四组探针的扩增灵敏度，ZNA探针的检出率均优于DNA长探针、DNA短探针、MGB探针；在最低浓度10拷贝/mL时，其他三组探针的检出率只有15%~20%，ZNA探针仍有30%。（6）在20例不同低浓度（分别为200、150、100和50拷贝/mL）临床样本中ZNA探针检出率最高，分别为100%、95%、90%和70%。 结论:偶联5个ZIP的ZNA探针的扩增效率、荧光值、冻融稳定性、临床样本的扩增性能及低浓度样本检出灵敏度都优于普通Taqman探针和MGB探针，ZNA探针可作为一种设计灵活和合成易得的新探针技术，在基因表达领域可进一步提升检测的灵敏度及低浓度样本的检出率。

目的:探讨载脂蛋白(apolipoprotein，apo)C1基因 (APOC1)rs4420638A/G和－317H1/H2位点多态性与中国妇女子痫前期(pre-eclampsia，PE)发生的相关性及其对临床和代谢指标的影响。 方法:本研究包括289例PE患者和824例无妊娠并发症的对照孕妇。采用Taqman荧光探针和聚合酶链反应-限制性片段长度多态性方法分别测定 APOC1 rs4420638A/G和－317H1/H2位点多态性，采用酶法和PEG增强免疫比浊法分别测定血脂和apo水平。 结果:APOC1基因rs4420638A/G和－317H1/H2位点基因型频率与等位基因频率在PE组和对照组之间差异无统计学意义( P>0.05)。但是，携带rs4420638位点G等位基因的PE患者有更高的血清甘油三酯、非高密度脂蛋白-胆固醇、apoB水平以及apoB/apoA1比值( P<0.05)。携带－317H1/H2位点H2等位基因的PE患者有更小的分娩孕周( P<0.05)。 结论:APOC1基因rs4420638和－317H1/H2位点多态性与PE患者血浆脂蛋白代谢异常有关。未发现这两个基因多态性与中国妇女PE发生的风险相关联。

目的:研究支气管哮喘(哮喘)患者白细胞介素17(IL-17)基因多态性与激素干预疗效的关系。方法:本研究为横断面研究。采用随机抽样方法，选取2018年5月至2020年5月三二〇一医院呼吸与危重症医学科收治的84例哮喘患者作为研究对象。患者均接受激素治疗，记录治疗效果。以TaqMan MGB探针技术对IL-17A和IL-17F进行基因分型，采用非条件logistic分析IL-17各基因型分布与治疗效果的关系。结果:84例患者中2例治疗期间被剔除，显效36例，有效27例，无效19例。总有效例数63例，总有效率为75.00%。不同疗效哮喘患者性别、年龄、体质量指数、病程、病情程度及发病季节比较，差异均无统计学意义( P值均>0.05)。非条件logistic分析显示IL-17F基因rs763780位点CT基因型较TT基因型和CC基因型患者治疗无效风险增加1.69倍(95% CI：12.23~2.34， P<0.001)，IL-17A基因rs3748067位点GA基因型较GG基因和AA基因型治疗无效风险增加2.45倍(95% CI：1.54~3.91， P<0.001)。rs763780位点CT基因型患者疗效低于TT基因型和CC基因型的风险增加1.27倍(95% CI：1.01~1.59， P＝0.043)，rs3748067位点GA基因型患者治疗效果低于GG基因型和AA基因型的风险增加1.93倍(95% CI：1.53~2.45， P<0.001)。 结论:IL-17基因多态性与哮喘激素治疗效果相关。IL-17A基因rs3748067位点和IL-17F基因rs763780位点SNP与激素治疗效果相关。rs3748067位点GA基因型和rs763780位点CT基因型可降低激素治疗效果。

目的:建立一种快速检测新型冠状病毒N亚基因组（SgN）的方法，探讨其在新型冠状病毒肺炎病例及环境样本中的应用价值。方法:根据全球共享流感数据库（GISAID）公布的新型冠状病毒全基因组序列设计SgN特异性引物和探针，优化退火温度、引物与探针浓度等反应条件，建立新型冠状病毒SgN荧光定量PCR检测方法，绘制标准曲线，评价该方法的灵敏性、重复性和特异性。采用建立的病毒SgN荧光定量PCR检测方法检测21份环境和351份临床样本，并选取25份SgN阳性样本进行病毒分离以评估该检测方法的应用效果。结果:SgN的引物和探针对新型冠状病毒具有良好特异性。初步建立的病毒SgN荧光定量PCR检测方法最低检测限为1.5×10 2copies/ml，变异系数小于1%。372份样本的gRNA阳性率为97.04%（361/372），gRNA阳性样本中阳性环境样本和阳性临床样本的SgN阳性率分别为36.84%（7/19）和49.42%（169/342）。其中野生型毒株样本的SgN阳性率及拷贝数均比德尔塔（Delta）毒株低。在25份SgN阳性样本中，采样时间在5 d内的12份样本均分离到病毒；13份采样时间在12 d以上的样本未发生细胞病变。 结论:成功建立了一种检测新型冠状病毒SgN的荧光定量PCR方法，该方法的灵敏度、特异性和重复性均较好。