目的 探讨氯喹干预表皮生长因子受体-酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKI)肺癌耐药细胞系的作用机制.方法 选取EGFR-TKI耐药的3种细胞系A549、H1960、H1975及EGFR-TKI敏感的细胞系PC9,采用Cell Counting Kit-8 (CCK8)法检测4种细胞系的生长活性,免疫蛋白印迹(Western blot)检测各细胞自噬蛋白表达量及哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)活性.采用EGFR-TKI特罗凯及自噬溶酶体抑制剂氯喹干预细胞生长,观察细胞活性及自噬表达变化.结果 Westernblot检测4种细胞系磷酸化的S6蛋白表达阳性;伴有EGFR-TKI耐药的A549、H1650、H1975细胞内自噬蛋白P62相对表达量减少,EGFR TKI敏感的肺癌细胞PC9中P62的相对表达量增多.CCK8法检测表明特罗凯可明显抑制PC9细胞的生长活性,对A549、H1650、H1975细胞系的生长则无明显抑制作用;进一步采用mTOR抑制剂Torin2作用于肺癌细胞,发现Torin2对PC9的生长抑制作用较明显,对其他3种细胞的生长无明显抑制作用.采用氯喹作用于肺癌4种细胞系,Western blot检测其未显著改变磷酸化S6蛋白的相对表达量,但显著抑制4种细胞系的生长活性,并以PC9与A549的抑制作用尤为明显.CCK8法检测表明氯喹与特罗凯的联合作用明显抑制PC9、A549和H1975的增殖,但对H1650的生长抑制作用较弱.结论 EGFR-TKI耐药细胞系中存在mTOR活化并伴自噬表达增强,但采用Torin2未改变自噬表达及肺癌细胞生长活性.氯喹能明显抑制EGFR-TKI肺癌耐药细胞系的生长活性,氯喹联合EGRI-TKI能协同抑制细胞生长,自噬抑制剂联合EGFR-TKI可作为未来克服EGFR-TKI耐药的治疗方案之一.

Ovarian cancer is one of the most lethal malignant tumors in women.The family with sequence similarity 83,member D (FAM83D) plays an important role in several cancers,but its function and underlying mechanism in ovarian cancer remain unknown.To investigate the role of FAM83D in ovarian cancer,the expression of FAM83D was determined by immunohistochemistry in tissue microarray slide.Cellular proliferation and invasion were detected by 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine assays and transwell invasion assays.The correlations between FAM83D and autophagy were detected by western blot analysis and confocal microscopy.Western blot analysis was used to identify the protein expression of FAM83D,phosphoinositide 3-kinase (PI3K),protein kinase B (AKT),mammalian target of rapamycin (mTOR) and Sequestosome 1 (P62).Tumorigenesis in nude mice was used to explore the function of FAM83D in vivo.We found high expression level of FAM83D in ovarian cancer tissues as compared to the normal ovarian tissues.Knockdown of FAM83D in SKOV3 cells enhanced autophagy and inhibited the proliferation and invasion in vitro,whereas ectopic expression of FAM83D in A2780 cells exerted an opposite effect.Mechanistically,overexpression of FAM83D activated the PI3K/AKT/mTOR pathway,and Torin1 could suppress FAM83D-induced cell proliferation and invasion.In vivo,overexpression FAM83D promoted tumor growth.Overall,FAM83D promoted ovarian cancer cell invasion and proliferation,while inhibited autophagy via the PI3K/AKT/mTOR signaling pathway.Our results suggest that FAM83D may be a candidate oncogene in ovarian cancer,which provides a fresh perspective of FAM83D in ovarian cancer.

目的:研究哺乳动物雷帕霉素(mammalian target of rapamycin,mTOR)新型小分子抑制剂Torin-2对人小细胞肺癌NCI-H446细胞增殖及凋亡的影响并探讨其机制.方法:体外培养并取对数生长期人小细胞肺癌NCI-H446细胞,分别给予不同浓度Torin-2或1 μmol/L处理不同时间,然后于镜下观察细胞离巢凋亡,通过克隆形成实验检验细胞生长抑制,采用MTS比色法测定吸光度值并计算相对细胞活性,流式细胞术检测细胞周期,免疫印迹法检测mTOR、p-mTOR(Ser2448)、p-Akt(Ser473)、Cyclin-B1、Cyclin-D1、Cyclin-E1、Cleaved Caspase-3等相关蛋白表达.结果:与对照组相比,Torin-2可有效抑制小细胞肺癌NCI-H446细胞增殖及相对细胞活性(P＜0.05);诱导细胞周期阻滞(P＜0.05);抑制p-mTOR、p-Akt磷酸化激活,降低Cyclin-D1、Cyclin-E1等细胞周期蛋白表达并诱导Cleaved Caspase-3蛋白激酶切割激活.结论:Torin-2可能通过抑制Akt-mTOR相关信号通路和激活凋亡相关蛋白诱导人小细胞肺癌NCI-H446细胞增殖抑制并促进其凋亡.

目的 对mTOR抑制剂Torin2合成方法进行探索及优化.方法 以对溴苯胺作为起始原料,通过氨基键合、合环、氯化、键合3-氨基三氟甲苯环、氧化、合环和Suzuki反应得到目标产物.采用正交实验对关键中间体3、8和终产物合成条件进行了优化.结果 与结论中间体和目标化合物结构经MS和1H NMR数据确认,目标化合物的反应总收率从3％提升至18％,无需柱色谱分离,适合工业化生产.

目的 探索一种新的二代哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)抑制剂9-(6-氨基-3-吡啶基)-1-[3-(三氟甲基)苯基]苯并[H]-1,6-萘啶-2(1H)-酮(Torin2)对人甲状腺乳头状癌(PTC)细胞生物学行为的影响,以期为临床靶向治疗PTC提供新的理论依据.方法 对人PCT的TPC-1细胞株和正常甲状腺Nthy-ori-3细胞株运用不同浓度Torin2,分别采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测细胞增殖能力,流式细胞仪分析细胞周期、凋亡情况,划痕愈合实验分析细胞迁移能力.结果 ① 与用药前相比,Nthy-ori-3细胞株均无明显变化;②各浓度(100、200、400 nmol/L)Torin2作用于TPC-1细胞24、48、72 h后,细胞增殖抑制率上升,差异有统计学意义(P<0.001),且随作用时间延长(24、48、72 h)和浓度增加,对细胞增殖抑制作用增强;③各浓度(100、200、400 nmol/L)Torin2作用于TPC-1细胞24、48 h后,G1期细胞比例逐渐增加,S期细胞比例逐渐下降,且具有时间和浓度依赖性,差异有统计学意义(P<0.001);④各浓度(100、200、400 nmol/L)Torin2作用于TPC-1细胞24、48 h后,细胞的凋亡率亦上升,呈现浓度依赖效应,差异有统计学意义(P<0.001);⑤ 各浓度(100、200、400 nmol/L)Torin2均可抑制TPC-1细胞的迁移,且随浓度的增加抑制能力越强,差异有统计学意义(P<0.001).结论 Torin2可抑制TPC-1细胞的增殖及迁移、阻滞细胞周期、诱导细胞凋亡,并随着Torin2浓度的增加和作用时间延长而增强.

目的 探讨哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路在3,5-二乙氧基羰基-1,4-氢-尿嘧啶(DDC)诱导的胆管损伤中的作用.方法 24只雌性C57BL/6J小鼠随机分为N-甲基呲咯烷酮(NMP)组、mTOR抑制剂(Torin1)处理组(Tor-in1组)、NMP+DDC组、Torin1+DDC组,每组6只小鼠.DDC组给予3 w 0.1％DDC饲料喂养,4组小鼠均在造模第1天通过腹腔注射的方式给予NMP或Torin1处理,每2 d注射1次,连续3 w.血清学检测肝功能变化情况;苏木素-伊红(HE)和Mas-son染色检测胆管增生、炎性细胞浸润及肝脏纤维化程度;免疫组织化学法检测肝脏(Ki67)和细胞角蛋白(CK19)的表达;qRT-PCR检测肝组织炎症相关基因白细胞介素(IL)-6、单核细胞趋化蛋白(MCP)-1、IL-10、精氨酸(Arg)1的表达;Western印迹检测mTOR信号通路活化表达情况.结果 与NMP组和Torin1组相比,NMP+DDC组血清谷丙转氨酶(ALT)、碱性磷酸酶(ALP)、总胆红素(TBIL)均明显升高,肝脏炎症细胞浸润、胆管增生及肝纤维化病变严重,IL-6、MCP-1和Arg1 mRNA表达明显升高,IL-10明显下降.而Torin1处理后,IL-6和MCP-1 mRNA表达明显下调,IL-10和Arg1 mRNA的表达明显升高.West-ern印迹检测结果显示NMP+DDC组p-mTOR、p-蛋白激酶B(Akt)、p-p65的表达相比于NMP组和Torin1组明显升高,而注射Torin1则抑制该信号通路的活化.结论 mTOR/AKT/核因子(NF)-κB信号通路参与DDC诱导小鼠胆管损伤的发生发展,抑制该信号通路可以减轻肝胆管的损伤.