目的 基于乳酸乳球菌(Lactococcus lactis,L.lactis)诱导表达系统制备呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial vi-rus,RSV)口服疫苗,并对其免疫原性进行分析.方法 将构建的质粒pUC57-Pre F与pNZ8149分别经Nco Ⅰ和Kpn Ⅰ双酶切,酶切产物经T4 DNA连接酶连接后获得重组质粒pNZ8149-Pre F,电转化至感受态L.lactis NZ3900,经乳糖培养基筛选获得非分泌型重组L.lactis NZ3900/pNZ8149-Pre F,以nisin A为诱导剂诱导表达,经Western blot和免疫荧光标记对其表达产物进行分析;将雌性BALB/c小鼠随机分为PBS、L.lactis NZ3900/pNZ8149、L.lactis NZ3900/pNZ8149-Pre F组,15只/组,每只口服500 μL,于第1、2天进行初次免疫,第16、17天进行加强免疫,第14和28天经小鼠下颌取血并分离脾脏细胞,ELSIA法检测重组L.lactis NZ3900/pNZ8149-Pre F诱导的体液和黏膜免疫应答水平,ELISpot法检测重组L.lactis NZ3900/pNZ8149-Pre F诱导的细胞免疫应答水平.结果 重组L.lactis NZ3900/pNZ8149-Pre F经PCR及测序鉴定,证明构建正确;抗原蛋白Pre F特异性地表达在L.lactis NZ3900中,相对分子质量约 50 000;初次免疫后第 14 和 28天,与 PBS 和L.lactis NZ3900/pNZ8149组相比,L.lactis NZ3900/pNZ8149-Pre F组小鼠血清Pre F-特异性IgG抗体效价、肠洗液中特异性分泌型IgA抗体以及脾脏细胞中IFNγ和IL-4分泌水平均明显升高,且差异均有统计学意义(t=-30.268～-3.087,P均＜0.05).结论 基于L.lactis诱导表达系统构建的RSV 口服疫苗具有较强的免疫原性,为研发RSV黏膜疫苗提供了参考,也为开发其他病毒或细菌口服疫苗提供了新的研究策略及方法.

VI型分泌系统(Type VI secretion system,T6SS)是革兰阴性菌中的一种重要的分泌系统,可参与细菌的致病性,并与生物膜的形成、识别异己和应激反应以及细菌耐药性的获得有关.溶血素共调节蛋白(hemolysin co-regulated protein,Hcp)是T6SS的核心组成部分,构成其内管结构,形成六聚环允许效应物质通过,并可保护效应物质避免其被降解.对Hcp蛋白功能的探讨及阐述T6SS的作用机制至关重要.研究发现,Hcp是一种在不同细菌中具有多样功能的分泌蛋白,如可影响细菌的运动能力、黏附能力、在靶细胞内定植的水平、参与细菌间竞争的能力、在动植物宿主内定殖的能力以及影响细菌的生物膜形成等.现将T6SS的核心组分Hcp的研究进展作一简明的概述,从而为全面认识T6SS的功能并深入探讨其作用机制提供参考依据.

[目的]研究副溶血弧菌群体感应(quorum sensing,QS)系统核心调控子AphA和OpaR对calR基因以及CalR对Ⅵ型分泌系统l(type VI secretion system 1,T6SS1;vp1386-1420)相关基因的转录调控关系.[方法]提取副溶血弧菌野生株(wild-type,WT)和调控子基因突变株的总RNA,采用实时定量PCR (quantitative real-time PCR,qPCR)研究调控子对靶基因的转录调控关系;采用引物延伸实验研究靶基因的转录起始位点,并根据产物的丰度判断调控子对靶基因的调控关系;将靶基因的启动子区克隆入pHRP309质粒的β-半乳糖苷酶基因上游,构建LacZ重组质粒,并将该重组质粒转入WT和调控子基因突变株中,获得LacZ菌株,通过LacZ报告基因融合实验进一步研究调控子对靶基因的调控关系.PCR扩增靶基因的上游调控区DNA序列,并纯化His-重组调控子蛋白,通过凝胶阻滞实验(electrophoretic mobility shift assay,EMSA)研究His-重组蛋白对靶基因调控区DNA序列是否具有直接的结合作用,若有结合作用,则进一步采用DNase I足迹实验研究具体的结合位点.[结果]在细菌生长密度(OD600)从 0.05依次增加到1.20时,CalR的表达水平呈梯度升高特征;QS系统在低细胞密度下的核心调控子AphA对calR基因的转录没有调控作用,而高细胞密度下的核心调控子OpaR对calR基因的转录具有间接的激活作用.此外,在非诱导条件下,CalR直接结合到vp1388-1390、vp1393-1406、vp1400-1406和vp1409-1407启动子区DNA序列上促进它们的转录.[结论]OpaR间接激活CalR的表达,而CalR是非诱导条件下维持T6SS1基础表达所必需的调控子.

目的:了解痰液及血液来源铜绿假单胞菌III型分泌系统(T3SS)和VI型分泌系统(T6SS)的基因分布特性及其与耐药的相关性.方法:收集2016年至2018年温州医科大学附属第一医院住院患者中不同标本来源的铜绿假单胞菌共92株(痰液来源61株,血液来源31株);PCR法检测菌株T3SS效应蛋白基因exoS、exoT、exoU、exoY、pscC和T6SS效应蛋白基因tssB1、tse1、tse2、tse3、tssB2、pldA、tssB3、pldB的携带情况;琼脂稀释法检测菌株对临床常用抗菌药物的敏感性;统计分析不同感染与分泌系统基因携带情况的关联性,并进一步分析不同基因与耐药的关系.结果:痰液及血液来源的菌株中T3SS蛋白基因exoT以及T6SS蛋白基因tssB1、tse2、tssB2、pldB的检出率均高达90％以上,痰液来源菌株T3SS蛋白基因exoU的携带率(32.8％)显著高于血液来源菌株的携带率(9.7％),差异有统计学意义(P<0.05),其对亚胺培南的耐药率也显著高于血液来源菌株(P<0.05);Spearman相关性分析结果表明exoU和pldA之间存在正相关(r=0.474,P<0.01);携带不同T3SS及T6SS基因的菌株对临床常用抗菌药物亚胺培南、环丙沙星、头孢他啶、阿米卡星的耐药率差异无统计学意义(P>0.05).结论:T6SS效应蛋白基因pldA与T3SS效应蛋白基因exoU具有较强的正相关性,常同时存在于铜绿假单胞菌中;痰液和血液来源铜绿假单胞菌T3SS效应蛋白编码基因exoU的携带率和对亚胺培南的耐药率存在明显差异,提示我们要及时检测T6SS效应蛋白基因pldA在菌株中的分布,关注菌株致病特性,并关注痰液来源菌株的毒力及耐药性情况,为临床用药及治疗提供策略.