目的:研究河弧菌群体感应调控子AphA对Ⅵ型分泌系统VflT6SS2功能活性的调控机制。方法:采用Western Blot检测河弧菌野生株、 aphA缺失株（Δ aphA）和 aphA回补株中VflT6SS2标志性组件溶血素共调节蛋白（Hcp）的表达和分泌。采用实时荧光定量PCR和启动子- lux 融合冷光系统检测野生株和Δ aphA中VflT6SS2核心基因簇和附属基因簇代表基因 tssB2 、hcp（ tssD2）和 vgrG（ tssI2）以及群体感应调控子HapR的mRNA 相对表达量和启动子活性。采用定点突变实验结合启动子活性测定确定AphA在 tssD2b启动子区的调控结合位点；采用电泳迁移率位移测定（EMSA）确定AphA与 hapR启动子的结合。 结果:Δ aphA中 tssB2 、hcp（ tssD2）、 vgrG（ tssI2）和 hapR的mRNA相对表达量及Hcp蛋白的表达分泌明显高于野生株。VflT6SS2核心基因簇 、tssD2a 、tssI2a和 hapR的启动子活性在Δ aphA中均高于野生株，而 tssD2b启动子活性则低于野生株。 tssD2a和 tssD2b的启动子序列分析显示-335 bp~-229 bp区差异较大，在 tssD2b中该区域存在2个潜在AphA结合位点，将其中的保守位点ATG替换为CGA， tssD2b启动子活性明显降低。EMSA结果显示，AphA与 hapR启动子直接结合。 结论:AphA在转录水平直接抑制 hapR的表达，间接参与对VflT6SS2核心基因簇和附属基因簇的调控。AphA对 tssD2a和 tssD2b呈现相反的调控模式，AphA可直接与 tssD2b启动子区（-335 bp~-229 bp）结合正向调控 tssD2b的表达。

目的 原核表达、纯化霍乱弧菌溶血素共调节蛋白(hemolysin coregulatory protein,Hcp),并制备其多克隆抗体.方法 PCR扩增霍乱弧菌Hcp基因并克隆入pET28a载体中构建重组表达载体;将重组载体pET28a-hcp转化E coil BL21(DE3)中,进行表达条件优化及表达形式鉴定.获取可溶性Hcp蛋白行Ni-NTA柱纯化,纯化的Hcp蛋白免疫BALB/c小鼠以制备多克隆抗体,并用间接酶联免疫吸附试验(ELISA)检测抗体效价,以评估其免疫原性.再以Western blot法分析抗体对霍乱弧菌Hcp蛋白的特异性识别.结果 重组载体pET28a-hcp的酶切片段与预期相符,测序结果与GenBank数据库中hcp基因序列一致,成功构建pET28a-hcp重组质粒,重组质粒经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达相对分子量为28kD的目的蛋白;经Ni-NTA柱纯化后获得较纯的Hcp蛋白,免疫小鼠可获得效价为1∶512 000的抗Hcp多克隆抗体(anti-Hcp);Western blot鉴定结果显示anti-Hcp具有识别霍乱弧菌Hcp蛋白的特异性.结论 成功获得可溶形式表达的Hcp蛋白,免疫小鼠后获得高效价的抗Hcp多克隆抗体,为后续研究Hcp蛋白在非O1/非O139群霍乱弧菌T6SS致病过程中的作用奠定了基础.

目的 探讨乙型肝炎病毒(HBV)通过自分泌运动因子(ATX)/溶血磷脂酸(LPA)信号对糖稳态的损伤作用及相关机制.方法 利用基因芯片数据库分析HBV对ATX表达的影响.Western blotting检测HBV细胞株HepG2215、稳定表达HBV反式调节蛋白HBx和PreS2的HBx-HepG2和PreS2-HepG2细胞、对照组HepG2细胞的ATX蛋白表达水平.双萤光素酶报告基因检测HBx和PreS2对ATX启动子作用.构建稳定表达HBx和Pre-S2的小鼠分泌胰岛素细胞HBx-NIT、PreS2-NIT,检测两者对胰岛素分泌的影响.利用rAAV8-1.3HBV经尾静脉注射C57BL/6小鼠复制HBV小鼠模型,NC为注射同体积生理盐水的C57BL/6小鼠.小鼠按2 g/kg腹腔注射葡萄糖进行糖耐量试验(GTT).采用液相色谱-质谱联用法、酶联免疫吸附试验和血糖分析仪分别检测小鼠血清LPA、血清胰岛素和血糖浓度.结果 HepG2215细胞ATX蛋白相对表达量高于HepG2(P＜0.05).PreS2与ATX启动子共转染组萤光素酶活性高于ATX启动子转染组(P＜0.05),HBX与ATX启动子共转染组的萤光素酶活性高于ATX启动子转染组(P＜0.05).HBx-HepG2细胞ATX蛋白相对表达量高于HepG2细胞(P＜0.05),PreS2-HepG2细胞高于HepG2细胞(P＜0.05).添加不同浓度LPA后NIT细胞胰岛素分泌表达量比较,差异有统计学意义(P＜0.05).1～3 μmol/L LPA相对表达量与胰岛素分泌呈负相关(r=-0.990,P＜0.05).HBx-NIT细胞添加Ki16425前的胰岛素水平低于NIT细胞(P＜0.05),PreS2-NIT细胞低于NIT细胞(P＜0.05).NIT、HBx-NIT和PreS2-NIT细胞添加Ki16425后的胰岛素水平较添加前高(P＜0.05).实验组血清LPA相对表达量、平均空腹血糖浓度、注射葡萄糖后的60、120 min平均血糖浓度和血糖浓度曲线下面积(AUC)平均值较对照组高(P＜0.05).实验组注射葡萄糖后15 min血清胰岛素浓度、血清胰岛素水平的AUC值较对照组低(P＜0.05).用HBV小鼠GTT血糖AUC绘制的ROC曲线显示,曲线面积为 0.770(95％CI:0.556,0.984),特异性为 60.00％(95％CI:0.122,0.738),敏感性为 90.00％(95％CI:0.555,0.998).用HBV小鼠空腹血糖浓度绘制的ROC曲线显示,曲线面积为0.865(95％CI:0.703,1.027),特异性为80.00％(95％CI:0.444,0.975),敏感性为60.00％(95％CI:0.262,0.878).实验组胰岛β细胞功能指数、胰岛素敏感指数均小于对照组,胰岛素抵抗指数大于对照组(P＜0.05).结论 HBV反式调节蛋白HBx和Pre-S2上调ATX的表达,增强ATX/LPA信号,导致胰岛素分泌抑制,糖耐量异常,糖稳态受损.

目的 观察炎调方调节Ras同源基因家族成员A(RhoA)/Rho激酶(ROCK)信号通路对急性胰腺炎(AP)大鼠肠屏障损伤的影响.方法 将84只大鼠随机分为对照组、模型组、炎调方低剂量组、炎调方高剂量组、乌司他丁组、溶血磷脂酸(LPA)组、炎调方+LPA组,每组12只.除对照组外,其他组构建AP大鼠模型.造模成功后立即进行给药处理,每6小时给药1次,共4次.ELISA法检测大鼠血清中淀粉酶、脂肪酶、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)、D-乳酸、二胺氧化酶(DAO)水平;HE染色检测大鼠胰腺组织和回肠组织病理变化;免疫组化染色检测大鼠回肠组织中ZO-1、Occludin蛋白平均光密度;Western blotting检测回肠组织中RhoA、ROCK1、ROCK2蛋白表达.结果 与对照组比较,模型组大鼠胰腺组织和回肠组织病理损伤严重,淀粉酶、脂肪酶、TNF-α、IL-6、D-乳酸、DAO水平及RhoA、ROCK1、ROCK2蛋白表达升高,ZO-1、Occludin蛋白平均光密度降低(P＜0.05);与模型组比较,炎调方低剂量组、炎调方高剂量组、乌司他丁组大鼠胰腺组织和回肠组织病理损伤减轻,淀粉酶、脂肪酶、TNF-α、IL-6、D-乳酸、DAO水平及RhoA、ROCK1、ROCK2蛋白表达降低,ZO-1、Occludin蛋白平均光密度升高,LPA组对应指标变化趋势与上述相反(P＜0.05);与炎调方高剂量组比较,炎调方+LPA组大鼠胰腺组织和回肠组织病理损伤加剧,淀粉酶、脂肪酶、TNF-α、IL-6、D-乳酸、DAO水平及RhoA、ROCK1、ROCK2蛋白表达升高,ZO-1、Occludin蛋白平均光密度降低(P＜0.05).结论 炎调方可能通过抑制RhoA/ROCK信号通路改善AP大鼠炎症反应及肠屏障损伤.

目的 探讨番茄红素(LYC)调节RAS同源基因家族成员A(RhoA)/Rho相关激酶(ROCK)信号通路对氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导的脑血管内皮细胞(EC)凋亡的影响.方法 未做任何处理的人脑微血管内皮细胞(HBMECs)设为NC组;采用ox-LDL处理的HBMECs分为ox-LDL组、LYC组(0.5 μmol/L的LYC处理HBMECs)、溶血磷脂酸(LPA)组(5 μmol/L RhoA/ROCK 信号通路激活剂 LPA 处理 HBMECs)、LYC+LPA 组(0.5 μmol/L 的 LYC 以及 5 μmol/L LPA 共同处理HBMECs);处理24 h后用于后续实验.采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测HBMECs细胞因子水平;CCK-8法检测HBMECs增殖;流式细胞术检测HBMECs凋亡率;Western blot检测细胞血小板内皮细胞黏附分子-1(CD31)、平滑肌(SM)22a、BCL-2相关X蛋白(Bax)、B细胞淋巴瘤/白血病-2蛋白(Bcl-2)、裂解的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(cleaved-Caspase-3)、RhoA/ROCK通路相关蛋白表达.结果 与NC组相比,ox-LDL组单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)、白细胞介素(IL)-6、血管内皮细胞黏附分子 1(VCAM-1)、HBMECs 凋亡率、Bax、cleaved-Caspase-3、SM22a、RhoA、ROCK1 蛋白水平升高,OD 值、Bcl-2、CD31蛋白水平下降,差异有统计学意义(P＜0.05);与ox-LDL组相比,LYC组MCP-1、IL-6、VCAM-1、HBMECs凋亡率、Bax、cleaved-Caspase-3、SM22a、RhoA、ROCK1蛋白水平降低,OD值、Bcl-2、CD31蛋白水平升高,差异有统计学意义(P＜0.05),而LPA组趋势相反;LPA减弱了 LYC对ox-LDL诱导的HBMECs凋亡的改善作用.结论 LYC可能通过抑制RhoA/ROCK信号通路来减轻HBMECs凋亡.

VI型分泌系统(Type VI secretion system,T6SS)是革兰阴性菌中的一种重要的分泌系统,可参与细菌的致病性,并与生物膜的形成、识别异己和应激反应以及细菌耐药性的获得有关.溶血素共调节蛋白(hemolysin co-regulated protein,Hcp)是T6SS的核心组成部分,构成其内管结构,形成六聚环允许效应物质通过,并可保护效应物质避免其被降解.对Hcp蛋白功能的探讨及阐述T6SS的作用机制至关重要.研究发现,Hcp是一种在不同细菌中具有多样功能的分泌蛋白,如可影响细菌的运动能力、黏附能力、在靶细胞内定植的水平、参与细菌间竞争的能力、在动植物宿主内定殖的能力以及影响细菌的生物膜形成等.现将T6SS的核心组分Hcp的研究进展作一简明的概述,从而为全面认识T6SS的功能并深入探讨其作用机制提供参考依据.

溶血尿毒综合征(hemolytic uremic syndrome,HUS)是一类以微血管性溶血性贫血、血小板减少和急性肾衰竭三联征为主要表现的临床综合征,按病因可分为典型HUS和非典型HUS.典型HUS又称腹泻相关性HUS,主要是志贺毒素大肠杆菌引起的HUS (STEC-HUS );非典型HUS(atypical hemolytic uremic syndrome,aHUS)是指补体旁路调节蛋白的异常.补体调控蛋白包括H因子、I因子、B因子、C3、膜辅蛋白(membrane cofactor pro-tein,MCP)及血栓调节蛋白(thrombomodulin,THBD )等.分为先天性及获得性.随着近几年对HUS发病的认识,对于病因的治疗大大改善了患儿的预后.

目的 探讨铜绿假单胞菌中Ⅵ型分泌系统(T6SS)和群体感应(QS)系统在铜绿假单胞菌生物被膜形成中的作用.方法 将铜绿假单胞菌生物被膜阳性的模式菌株PAO1制备成生物被膜菌和浮游菌.采用实时荧光定量PCR法检测菌株中T6SS相关溶血素共调节蛋白(Hcp)基因Hcp1、Hcp2和Hcp3,QS系统相关基因LasR,胞外多糖相关多糖合成位点基因A(PslA)和菌膜基因A(PelA),以及Ⅳ型菌毛基因(PilA)和鞭毛蛋白基因(FliC)的表达水平.采用独立样本t检验比较PAO1生物被膜菌与浮游菌中上述基因表达的差异.结果 PAO1生物被膜菌PslA、PelA、PilA和FliC基因的相对表达量均明显高于浮游菌,分别为浮游菌的714、274、604和42倍(P均<0.05),提示制备的PAO1生物被膜菌形成了具有鞭毛和菌毛结构的成熟生物被膜.PAO1生物被膜菌Hcp1、Hcp2、Hcp3和LasR基因的相对表达量均明显高于浮游菌,分别为浮游菌的1045、11268、6654和1226倍(P均<0.05),提示T6SS和QS系统与PAO1菌生物被膜的形成有关.结论 铜绿假单胞菌中T6SS和QS系统可能参与生物被膜形成,其具体调控机制有待进一步研究.

[背景]沙门氏菌是一种重要的人畜共患病原菌,可引起广泛的胃肠炎以及伤寒、副伤寒,其致病机制一直未被阐明.基因敲除技术在研究沙门氏菌致病性方面发挥了重要作用,然而目前的敲除技术仍存在费时、成功率低的问题.研究发现鼠伤寒沙门氏菌含有Ⅵ型分泌系统,其组成成分之一溶血素共调节蛋白 (Hemolysin-coregulated protein,Hcp) 可能在其致病过程中发挥了重要作用.[目的]拟通过对3个编码Hcp蛋白的基因进行敲除,在鼠伤寒沙门氏菌中建立一套方便快捷的重组系统,从而用于沙门氏菌致病性的研究.[方法]以pKD4为模板,扩增两端带有目的基因同源序列的卡那霉素抗性基因片段,将片段导入含重组酶系统的目的菌,重组后再导入质粒pCP20消除抗性基因片段,达到无痕敲除的效果.[结果]对3个单独的hcp基因及其组合进行了敲除,得到了所需的基因缺失株,并总结出了一些实验过程中可能遇到的问题的解决方案.[结论]Red重组系统可用于鼠伤寒沙门菌的基因敲除,通过优化同源片段的长度、PCR模板浓度、L-阿拉伯糖加入时间、实验过程中的温度等实验条件,提高Red重组系统在沙门氏菌中的重组效率.此方法简单、快速,重组效率高,值得推广.

目的 纯化铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)溶血素共调节蛋白(Hemolysin co-regulated protein,Hcp)并制备抗血清. 方法 从NCBI网站查到铜绿假单胞菌Hcp蛋白序列,采用Signal IP 4.1预测定位及信号肽情况;登录Swiss model网站预测三级结构情况;登录www.iedb.org网站预测其B细胞表位.根据Hcp基因序列设计特异性引物,以铜绿假单胞菌基因组DNA为模板,PCR扩增Hcp基因,经双酶切后连到pET28a.将重组质粒pET28a-Hcp转化大肠埃希菌BL21 (DE3),然后用IPTG诱导重组Hcp蛋白表达.使用镍柱亲和层析法纯化目的蛋白.用Hcp蛋白免疫BALB/c小鼠,ELISA法检测抗血清效价. 结果 Hcp定位在细菌细胞浆,无信号肽,6个单体蛋白组成一个环状的中空结构,含有多个B细胞表位.构建的表达质粒pET28a-Hcp能表达23.9×103大小的Hcp蛋白,镍柱层析后得到高纯度的Hcp蛋白,重组Hcp蛋白诱导的抗体效价大于1∶10 240. 结论 成功重组表达铜绿假单胞菌Hcp蛋白及高滴度的抗血清,为研究Hcp的功能奠定了实验基础.