目的 以忍冬Lonicera japonica八氢番茄红素脱氢酶(phytoene desaturase,PDS)基因为标记基因,利用ZMBJ-CMV载体建立基于病毒诱导的忍冬基因沉默体系.方法 以忍冬为材料,通过选取同源性较高的片段设计PDS基因的特异性引物,克隆出片段长度为135 bp的序列作为目的基因片段,经双酶切后与黄瓜花叶病毒载体连接构建VIGS重组载体,转化根癌农杆菌后,侵染忍冬幼苗.此外,还对农杆菌吸光度(A)值和侵染方法对PDS基因沉默效率的影响进行了比较.结果 被侵染植株叶片PDS基因表达水平显著降低,叶绿素和类胡萝卜素含量显著下降,叶片出现白化表型.结论 建立了以ZMBJ-CMV载体诱导的忍冬基因沉默体系,农杆菌A值为0.8、注射后再进行真空浸润,能够提高忍冬目标基因的沉默效率,为开展忍冬关键基因的功能研究提供了技术支撑.

病毒诱导基因沉默(Virus-induced gene silencing,VIGS)技术为缺乏稳定遗传转化体系的植物进行基因功能分析提供了可能,为解决缺少稳定遗传转化体系的植物进行基因功能验证的需求,以单子叶植物溪荪(Iris sanguinea)为材料,克隆IsPDS基因的特异性片段并构建其VIGS重组载体pTRV2-IsPDS,通过注射法侵染溪荪叶片,结果显示:pTRV1和pTRV2-IsPDS的菌液OD600调至1.8～2.0后重悬,重悬液OD600调至0.8～1.0,通过注射器叶脉注射方式侵染溪荪叶片效果最佳.在室外温度为15～20℃的下午6～8时进行,用1 mL注射器针头扎伤溪荪叶片外表皮,沿着平行脉缓慢注射重悬液1 mL至溪荪叶片维管束中,14 d左右会出现明显的白化表型.在出现表型变化的植株和空载组中均检测到TRV1和TRV2的病毒载体,白化植株的IsPDS表达量显著低于对照组.侵染液配制中通过提高携带病毒载体的农杆菌的浓度提高侵染效率,且接种后无需遮光.

病毒诱导的基因沉默(virus-induced gene silencing,VIGS)技术已广泛用于植物基因功能研究,以烟草脆裂病毒(tobacco rattle virus,TRV)为载体的沉默体系介导大豆基因沉默效率有待明确,采用无缝克隆技术构建TRV-VIGS沉默体系,探索不同接种方法对大豆靶基因在不同组织间的沉默效率,为大豆基因功能研究提供依据.以八氢番茄红素去饱和酶(phytoene desaturase,GmPDS)及泛素连接酶(GmATL3)基因为靶基因,将含有pTRV1 和重组载体菌液采用注射、灌根(agroinoculation)、注射与灌根相结合 3 种方法分别接种大豆中黄 13,接种 28 d观察沉默表型现象,并使用RT-qPCR技术检测根部与叶部基因相对表达量,明确不同方法沉默效果.注射接种的大豆叶边缘及叶内出现黄化褪绿,灌根接种与注射加灌根接种的叶片表面出现褪绿斑点及褶皱褪绿表型.RT-qPCR结果表明,3 种接种方法对沉默GmPDS效果接近 100%;注射接种对GmATL3 的沉默效率在叶部为 80%-95%,根部为 40%-60%;灌根与注射加灌根接种,根部沉默效率为 70%-90%,叶部沉默效率为 15%-50%.不同接种方法产生不同程度沉默表型,且对不同内源基因沉默效率不同.接种方法对不同组织沉默效率存在差异,注射方法对叶片沉默效率最高,注射加灌根结合的方法对根部沉默效率最高.

三角梅是紫茉莉科灌木,具有较高的观赏价值,是研究花色叶色调控的理想材料.建立快速高效的基因验证体系,是三角梅基因功能研究的关键.以三角梅'金心双色'品种为材料,选用八氢番茄红素脱氢酶基因(PDS)为指示基因,探索不同接种部位和基因片段长度对烟草脆裂病毒(TRV)诱导三角梅叶片内源PDS mRNA沉默效果的影响,建立适用于三角梅的病毒诱导基因沉默体系(VIGS).结果表明,摩擦注射嫩叶法相比顶端嫩茎沉默效果更明显;基因沉默片段长度在 336 bp和 457 bp均可诱导PDS基因沉默,后者效果更加明显.初步构建了三角梅VIGS体系,为后续基因功能研究提供了技术参考.

编码苯基香豆满苄基醚还原酶(phenylcoumaran benzylic ether reductase,PCBER)的基因PCBER属于PIP亚家族,是苯丙烷代谢途径中参与木脂素合成的关键基因.该研究构建了棉花GhPCBER基因的植物过表达载体并转化拟南芥,同时构建了VIGS(virus induced gene silencing,病毒诱导的基因沉默)载体转化棉花,采用实时荧光定量PCR技术对GhPCBER基因在不同组织中的表达进行分析;对野生型和转基因植株茎叶组织中的木质素和木脂素含量进行测定分析.结果表明:(1)成功构建了GhPCBER植物过表达载体pGWB17-GhPCBRE以及基因沉默重组载体pTRV2-GhPCBER;经遗传转化获得6株转棉花GhPCBER基因抗性拟南芥植株,同时获得15株GhPCBER基因沉默棉花植株(5株为一组).(2)PCR检测表明,6株转基因拟南芥均为过表达株系,其中株系1、2、3相对表达量更高,且在茎、叶组织中的表达量分别较野生型提高了7～14倍和6～16倍,表明GhPCBER基因成功在拟南芥中过表达;GhPCBER基因沉默棉花植株的茎、叶组织中的表达量分别比野生型棉株约下降12％和26％,表明烟草脆裂病毒(TRV)体系(pTRV2-GhPCBER)成功抑制了GhPCBER基因的表达.(3)转GhPCBER基因拟南芥茎、叶中木质素和木脂素含量较野生型均显著降低;GhPCBER基因沉默棉花植株茎、叶中木质素和木脂素含量较野生型均极显著降低;组织化学染色观察发现GhPCBER基因沉默棉花植株茎秆颜色明显比野生型染色浅,也证明沉默基因棉花植株茎秆中的木质素含量减少.(4)苯丙烷代谢通路中8个相关基因的实时荧光定量PCR分析发现,过表达或抑制GhPCBRE基因均会导致苯丙烷代谢途径发生重新定向.

八氢番茄红素脱氢酶(phytoene desaturase,PDS)是类胡萝卜素进行生物合成途径中的关键酶.为了深入探究金鱼草PDS基因的功能,该研究以‘马里兰’金鱼草(Antirrhinum majus ‘Maryland True Pink')为材料,对其PDS基因(AmPDS)全长序列及蛋白结构进行分析,并克隆了AmPDS基因片段;采用qRT-PCR技术检测AmP-DS基因在不同时期及部位的相对表达水平,利用VIGS技术验证AmPDS基因功能,用紫外分光法测定叶片中各类色素含量.结果 显示:(1)成功克隆AmPDS基因片段(500 bp);AmPDS基因eDNA全长1 743 bp,编码580个氨基酸;其蛋白分子量为64.75 kD,理论等电点6.66;同源比对分析显示AmPDS基因与芝麻(Sesamum indicum)的序列相似性最高.(2) qRT-PCR分析表明,AmPDS基因在全株均有表达,且在全盛期花朵的上瓣和叶片中表达量最高.(3)构建pTRV2-AmPDS载体,建立了金鱼草的VIGS沉默体系,AmPDS基因沉默效率约为53％,与阴性对照相比叶片中各类色素含量均显著降低.研究认为,AmPDS基因是金鱼草类胡萝卜素生物合成途径中的关键基因,可作为金鱼草VIGS沉默体系的指示基因,为后续研究金鱼草其他基因功能奠定基础.

发育生物学实验是大多数本科院校的一门独立课程,在学生的知识结构与认知体系中占有非常重要的地位.从学科自身特点出发,在基础性实验课程的基础上,以植物花器官发育的机理研究为切入点,以模式植物本氏烟草(Nicotiana benthamiana)为材料,选取ABC模型中任何一类基因,运用VIGS的实验方法,设计3个单元的综合性实验,旨在提高发育生物学实验的教学质量与学习效果,使学生理解花器官发育的分子机理,培养学生的实验动手能力与科研创新能力.

随着基因组序列信息的激增,生物科学研究进入大数据时代,但如何对基因组信息进行功能注释成为了一个重要的研究目标.病毒诱导的基因沉默(virus-induced gene silencing,VIGS)技术作为一种强大的工具,可以针对缺乏稳定遗传转化体系的林木物种进行基因功能分析,已经被用来研究了多个植物生长发育过程中的关键基因.该技术利用植物先天抗病毒防御机制,通过把目的基因片段插入病毒载体中进而在植物体内产生小干扰RNA,使该植物内源基因的转录物成为被降解的靶标,从而导致目的基因的表达量下调.系统综述了VIGS技术的优势、局限性、以及相应的解决方案,同时还讨论了VIGS在林木科学研究中的应用,最后探究了VIGS作为探究和表征植物基因功能的有力工具的最新改进方案和未来前景.

小报春是报春花科报春花属的二年生草本花卉,具有较高的观赏价值和园林应用前景,是研究花柱二型的理想材料,建立快速高效的报春花属基因功能验证技术,是小报春基因功能研究中的关键问题.以小报春为材料,以八氢番茄红素脱氢酶(PDS)基因作为标记基因,探索TRV病毒载体在小报春中的最佳侵染对象、侵染液配方、菌液浓度和侵染方式,建立适用于小报春的VIGS体系.结果表明,用含有200μmol/L乙酰丁香酮(AS)、10 mmol/L MgCl2和10 mmol/L乙磺酸缓冲液(MES)的浸染液,将含有pTRV1和pTRV2-PfPDS的菌液OD600值均调至1.0等体积混合后通过叶背注射方式侵染小报春,以TRV病毒载体上的引物对处理后的植株叶片进行PCR,在出现表型变化的植株和空载组中均检测到TRV1和TRV2的病毒载体,白化植株的PfPDS表达量显著低于空载组和对照组.建立的VIGS体系侵染效率达60％,沉默表型可持续12个月之久,并能在小报春植株的各部位(从叶片到萼片)均起到沉默作用.建立了小报春基因沉默体系,由于沉默效果持续时间长,所有基因都可以利用这一方法进行功能验证.