目的:分析1例晚期婴儿型异染性脑白质营养不良病(metachromatic leukodystrophy，MLD)患儿芳基硫酸酯酶A(arylsulfatase A，ARSA)编码基因的变异情况。方法:应用Sanger测序方法检测 ARSA基因第1～8共8个外显子序列。用PubMed Protein BLAST分析ARSA的跨种属保守性；应用Ucsf chimera软件对正常结构及变异结构的ARSA进行蛋白质3D结构建模及比对来分析变异所致的蛋白二级结构的丧失及蛋白空间结构的改变；应用PolyPhen-2、Mutation Taster及SIFT软件对新变异进行功能预测。 结果:患儿携带 ARSA基因第3外显子c.467G>A(p. Gly156Asp)和第5外显子c.960G>A(p. Trp320*)复合杂合变异。c.467G>A(p. Gly156Asp)变异经PolyPhen-2、Mutation Taster、SIFT及PROVEAN预测软件预测为可能有害变异，同时经PubMed Protein BLAST分析ARSA第156位Gly在各种属间均高度保守，该氨基酸改变可导致编码的ARSA功能发生障碍；c.960G>A(p. Trp320*)变异经Ucsf chimera软件进行蛋白3D结构建模分析发现，该变异可导致编码蛋白空间结构严重变形，原有功能丧失。 结论:ARSA基因c.467G>A(p. Gly156Asp)和c.960G>A(p. Trp320*)复合杂合变异可能为该患儿罹患MLD的致病原因，基因变异检测结果可以为家系的遗传咨询和产前诊断提供依据。

目的:分析一例青少年型异染性脑白质营养不良病(metachromatic leukodystrophy ，MLD)患儿的芳基硫酸酯酶A(arylsulfatase A， ARSA)基因的变异情况。 方法:收集先证者的临床资料，采集先证者及其他家系成员的外周静脉血样并提取基因组DNA。通过全外显子组测序确定可疑致病变异后，应用Sanger测序在该家系中进行验证。通过氨基酸多序列比对和蛋白三维模型预测对变异的致病性进行分析。结果:患者携带 ARSA基因c.257G>A(p.R86Q)和c.467del(p.G156Afs*6)复合杂合变异，其中c.467del(p.G156Afs*6)移码变异为尚未报道的致病变异。氨基酸多序列比对表明c.257G>A(p.R86Q)变异位点在各种属间高度保守。经蛋白三维结构建模分析发现变异体c.467del(p.G156Afs*6)蛋白构象发生变化导致原有功能的丧失。 结论:本研究发现新的基因变异位点，扩宽了MLD的变异谱，有助于进一步了解基因型与表型之间的关系，加深对于该病的认识。

患儿　男，4岁半，第1胎。2岁前生长发育正常，2岁时无明显诱因出现进行性抬头不稳，头略后仰，翻身不能，拉起反射阳性，双侧膝腱反射活跃，双侧巴宾斯基征阳性，四肢肌张力高。头部磁共振成像(MRI)平扫可见胼胝体压部及双侧侧脑室后角旁白质区对称分布片状异常信号，为T1WI呈稍低信号，T2WI级压水压脂像呈稍高信号(图1)。双侧额、颞叶脑沟略增宽。提示髓鞘发育不良。临床诊断为脑白质发育不良，于我院康复科规律康复治疗。4岁时无明显诱因出现抽搐，发作表现为双眼上翻，凝视，口周发绀，四肢僵直，意识丧失。视频脑电检测可见背景弥漫性慢波，清醒期前头部偶见棘波散发。抽搐发生后立即就诊于我院，复查头部MRI可见双侧侧脑室旁白质区见对称性大片异常信号，T1WI呈稍低信号，T2WI级压水压脂像呈稍高信号(图2)。胼胝体体积变小，部分脑沟增宽。2个月前时患儿复查未出现其他系统异常表现，检测外周血白细胞芳香基硫酸酯酶A(arylsulfatase，ARSA)活性结果为32.6nmol/mg.17h(正常参考值217~360 nmol/mg.17h)。明确诊断为晚婴型异染性脑白质营养不良(metachromatic leukodystrophy，MLD)。父母体健，非近亲婚配，否认癫痫及遗传病家族史。其母现孕15周，于本中心行遗传咨询及产前诊断。

异染性脑白质营养不良(Metachromatic leukodystro-phy,MLD)是一种罕见的因芳基硫酸酯酶A(Arylsulfatase A,ARSA)基因或鞘脂激活蛋白原(Prosaposin,PSAP)基因突变导致脑白质和周围神经脱髓鞘性病变的常染色体隐性遗传性溶酶体贮积病,发病率为0.4～1.6/10万,常表现为进行性运动、认知功能及精神障碍等.青少年型MLD早期可能以精神心理症状首诊,影像学表现无特异性,易被误诊.本研究将1例青少年型MLD报道如下.

目的 建立可同时测定尿中 11 种羟基多环芳烃(hydroxy-polycyclic aromatic hydrocarbons,OH-PAHs)的超高效液相色谱串联质谱分析(ultra-high performance liquid chromatography tandem with mass spectrometry,UPLC-MS/MS)法.方法 尿液样品在 pH=5.5 条件下,在 37℃水浴中经 β-葡萄糖苷酸酶—芳基硫酸酯酶避光水解 16 h,3.0 mL正己烷萃取、涡旋、离心,取上层有机相,重复萃取两次,合并萃取液,氮吹至近干,再复溶于 20%乙腈水溶液中.流动相为水和 10%异丙醇甲醇溶液,梯度洗脱模式洗脱,CORTECS C18 色谱柱分离,ESI-模式测定尿液中 11 种羟基多环芳烃浓度,内标法定量分析.结果 11 种羟基多环芳烃线性关系良好,相关系数(r)均大于 0.997.方法 的检出限为 0.01～0.10 ng/mL;日间回收率为 79.8%～97.3%,精密度为 1.9%～4.7%(n=3);日内回收率为 78.6%～92.3%,精密度为 3.7%～7.1%(n=3).结论 该方灵敏度高,准确可靠,适用于人群中多种羟基多环芳烃的监测.

目的:通过定点突变初步表征绿脓杆菌芳香硫酸酯酶(Pseudomonas Aeruginosa arylsulfatase,PAAS)序列-活性关系,识别通过迭代饱和突变提高突变体比活性的合适位点.方法:分析PAAS活性中心三维构象初步识别催化相关位点;定点突变获得突变体,重组表达后Ni2+-NTA亲和纯化,表征其酶学性质.结果:与野生型相比,R55、M72、G138、D317、K375等位点用常见氨基酸替换/突变都显著降低其催化活性;R55、D317和K375等突变显著降低底物选择性和/或热稳定性,而M72和G138突变主要改变其催化活性.结论:M72和G138适合作为通过迭代饱和突变实施定向进化的候选位点.

目的 建立去磷脂快速萃取-超高效液相色谱-串联质谱法(UPLC-MS/MS)测定人体血液中双酚A水平的检测方法.方法 人体血液样本在酸性条件下通过酶解(β-葡萄糖醛酸酶/硫酸酯酶)和去磷脂固相萃取相结合的方法进行前处理,采用美国五氟苯基液相色谱柱(100mm×3.0mm,2.7μm)分离后,于电喷雾负离子源(ESI-)和多反应监测(MRM)模式下进行测定.结果 双酚A在0.1～ 100 ng/mL质量浓度范围内线性关系良好,R2＞0.999,检出限(LOD)为0.05 ng/mL,定量限(LOQ)为0.15 ng/mL.在0.5、5、50 ng/mL加标水平下,平均回收率为87.3％～112.1％.日内和日间精密度分别为3.3％ ～ 8.2％,4.9％ ～ 10.7％ (n =6).结论 该方法灵敏度高、重现性好、回收率高、操作简单,可作为人体血液中双酚A快速检测方法.

目的 对60例惊厥及发育落后且有头颅磁共振成像(MRI)改变的患儿进行基因筛查,并分析芳香基硫酸酯酶A(ARSA)基因突变者临床表现及头颅MRI表现.方法 收集患儿血样,提取基因组DNA,采用第2代测序技术对60例怀疑异染性脑白质营养不良(MLD)患儿进行基因检测,并对基因阳性患儿的基因型与临床表型及头颅MRI表现进行分析.结果 60例患儿中,15例存在基因突变,携带7种ARSA基因突变位点,其中3种与MLD相关,分别为c.1178C＞G,c.1055A＞G,c.883G＞A,而另外4个位点属于单核苷酸多态性(SNP),1例仅携带SNP,其中14例携带致病突变.3种突变为已知致病突变,以c.1055A＞G(53.33％)、c.1178C＞ G(40.00％)多见.c.1055A＞G突变者8例,迟发型5例,其中3例晚期婴儿发作型中,1例同时携带c.1178C＞G基因突变;8例均有发育落后,脑积水1例,癫(痫)5例;c.1178C＞G突变者6例,均为晚期婴儿发作型,均有发育落后,其中癫(痫)4例,c.883G＞A突变患儿1例,为晚期婴儿发作型,其首发症状为双耳耳聋,精神发育迟滞.3种不同基因突变类型头颅MRI表现无明显差异.结论 明确了14例MLD患者的基因诊断,c.1178C＞G与c.883G＞A常为晚期婴儿发作型,c.1055A＞G为迟发型,各基因型头颅MRI表现差异无统计学意义.

[目的]海单胞菌Marinomonas sp.FW-1是1株经验证可以获得高活性芳基硫酸酯酶的菌株.为深入研究FW-1菌株产芳基硫酸酯酶机制,进一步筛选高活性的芳基硫酸酯酶基因片段,有必要解析FW-1菌株的全基因组序列信息.[方法]本研究采用高通量测序技术对FW-1进行全基因组测序,使用相关软件对测序数据进行基因组装、基因预测与功能注释、COG聚类分析等.结合异源表达的方法对其不同基因片段所产生的芳基硫酸酯酶活性进行分析.[结果]全基因组测序结果表明该基因组大小为3964876 bp,GC含量为44.03％,编码3590个蛋白基因,含有78个tRNA和25个rRNA操纵子.从全基因组测序结果中找到22个可能具有芳基硫酸酯酶活性的基因,对其中4个进一步异源表达后发现FW-1中至少含有的3个具有芳基硫酸酯酶活性的基因,其均含有芳基硫酸酯酶的特异性氨基酸基团C-X-P-X-R基团.[结论]本研究首次报道了1株含有多个芳基硫酸酯酶基因序列的菌株FW-1的全基因组序列,分析了基因组的基本特征,为芳基硫酸酯酶的进一步应用提供了思路.

目的 比较随机引物与精确引物PCR扩增实施绿脓杆菌芳香硫酸酯酶(Pseudomonas aeruginosa arylsulfatase,PAAS)定点饱和突变的整体效率及成本,以建立高效实用的定点饱和突变方案.方法 以大肠杆菌碱性磷酸酶(Escherichia coli alkaline phosphatase,ECAP)与PAAS融合表达质粒为模板,分别用针对PAAS目的位点的随机引物、精确引物等量混合物及单个精确引物,进行全质粒PCR扩增构建定点饱和突变体库;碱裂解细胞后高通量测定PAAS突变体与ECAP活性比值进行筛选,比较3种定点饱和突变建库方案需筛选的单克隆数量、所获突变体种类、整体耗时、整体成本及影响因素.结果 用随机引物PCR对M72位定点饱和突变有明显密码子偏好性,筛选超600个单克隆仅获得10种预期突变体,但对G138位定点饱和突变未见明显的密码子偏好性且筛选不到150个单克隆获得18种预期突变体;精确引物等量混合物对M72位实施定点饱和突变,筛选不超过190个克隆成功获得19种预期突变体;单个精确引物对M72位逐个PCR实施定点饱和突变,仅各筛选2个单克隆就获得19种预期突变体.单个精确引物逐个PCR实施定点突变所获饱和突变体库完整,需筛选的单克隆数最少,总耗时和总成本最低;相比之下,用随机引物和精确引物等量混合物实施定点饱和突变时,所需筛选的单克隆数、整体耗时及成本均显著增加.结论 解析序列-活性关系时,用单个精确引物逐个PCR实施定点饱和突变有显著整体成本和效率优势;仅筛选阳性突变体时,用精确引物等量混合物进行PCR建库在成本和效率上更有优势.