构建靶向人ezrin增强子关键区的CRISPR/Cas9载体并检测其基因敲除功能.设计2个gRNA,分别靶向人ezrin增强子关键区的上、下游.合成gRNA寡核苷酸序列,连接至质粒pX459构建重组质粒pX459-sgRNA-EL和pX459-sgRNA-ER.将鉴定正确的CRISPR/Cas9重组质粒共转染至食管癌EC109细胞中,提取细胞基因组DNA,针对gRNA靶位点两侧进行PCR扩增和亚克隆测序分析.经限制性内切酶酶切和测序鉴定表明,CRISPR/Cas9重组质粒构建正确.在共转染重组质粒的细胞基因组DNA中检测到ezrin增强子关键区的缺失.成功构建了靶向人ezrin增强子关键区的CRISPR/Cas9载体,能够实现目标序列的定向敲除.

目的 探讨淋巴细胞趋化因子(lymphotactin,XCL1)对人乳腺癌MCF-7细胞的表柔比星药物敏感性及侵袭转移能力的影响.方法 根据是否进行表柔比星及XCL1干预,将MCF-7细胞分为4组:对照组(MCF-7 NC),表柔比星单药组(MCF-7 E),XCL1单药组(MCF-7 XCL1),联合干预组(MCF-7 XCL1+E).用细胞计数试剂盒8(CCK-8)及平板克隆实验观察XCL1干预后MCF-7细胞对表柔比星药物敏感性的影响.用Transwell法观察XCL1对MCF-7细胞侵袭转移能力的影响,并用免疫荧光法检测对照组和XCL1单药组埃兹蛋白(ezrin)及磷酸化埃兹蛋白(p-ezrin)的表达.用Western blot实验检测4组E钙黏蛋白(E-cadherin)、ezrin及p-ezrin的表达水平.细胞生长抑制率的比较采用析因设计的方差分析,2组均数比较采用t检验,多组均数比较采用单因素方差分析,两两比较用LSD法.结果 经XCL1处理2周后,表柔比星对MCF-7细胞的抑制作用降低(组间比较F=23.780,P<0.001;不同浓度比较,F=160.602,P<0.001;浓度因素和分组之间无交互作用,F=1.565,P=0.208).XCL1刺激MCF-7细胞后,各组(MCF-7 NC、MCF-7 XCL1、MCF-7 E和MCF-7 XCL1+E)细胞克隆形成率分别为(15.63±0.61)％、(19.47±1.94)％、(7.77±0.71)％和(12.37±1.55)％,差异有统计学意义(F=41.925,P<0.001).迁移实验中MCF-7 XCL1组的细胞穿膜数高于MCF-7 NC组(180.00±20.42比88.00±7.00,t=-7.382,P=0.002),侵袭实验中MCF-7 XCL1组的细胞穿膜数也高于MCF-7 NC组(176.33±8.02比90.33±12.90,t=-9.808,P=0.001).免疫荧光实验发现XCL1刺激后的MCF-7细胞中p-ezrin蛋白表达明显升高(MCF-7 XCL1:1.08±0.12,MCF-7 NC:0.65±0.11,t=-4.528,P=0.011).Western blot检测发现,4组比较E-cadherin和p-ezrin表达的差异均有统计学意义(F=6.317、48.517,P均<0.050),ezrin表达差异无统计学意义(F=0.868,P=0.497).与MCF-7 NC组比较(1.10±0.09),MCF-7 E组、MCF-7 XCL1组和MCF-7 XCL1+E组E-cadherin表达均降低(0.65±0.22、0.67±0.14、0.71±0.11,P均<0.050);与MCF-7 NC组比较(0.37±0.07),MCF-7 XCL1组和MCF-7 XCL1+E组p-ezrin表达升高(0.93±0.10、1.28±0.15、P均<0.050).结论 XCL1可能通过增强ezrin蛋白磷酸化来增强乳腺癌MCF-7细胞的侵袭转移能力,同时降低其对表柔比星的药物敏感性.

目的:探讨ezrin增强子敲除对食管癌Eca-109细胞ezrin基因表达、细胞增殖和迁移的影响.方法:将靶向ezrin增强子上、下游的CRISPR/Cas9重组质粒共转染食管癌Eca-109细胞,经嘌呤霉素筛选,获得敲除ezrin增强子的细胞株Eca-C2.用qPCR和Western blotting分别检测敲除ezrin增强子的Eca-C2细胞中ezrin mRNA和蛋白的表达,用蛋白芯片技术检测MAPK通路相关蛋白的表达,用WST-1法和细胞划痕愈合实验分别检测ezrin增强子敲除对Eca-C2细胞增殖和迁移能力的影响.结果:成功构建稳定敲除ezrin增强子的食管癌细胞株Eca-C2;与对照细胞相比,ezrin增强子敲除细胞ezrin mRNA和蛋白的表达水平均明显降低(均P＜0.05).Eca-C2细胞中17种被检测的MAPK通路相关蛋白中有9种(AKT、CREB、GSK3b、MKK6、mTOR、P38、P53、P70S6K和RSK1)表达下调,ezrin增强子敲除后细胞的增殖和迁移能力受到明显抑制(均P＜O.05).结论:在人食管癌Eca-109细胞中,敲除ezrin增强子可明显抑制细胞的增殖和迁移.

目的 ezrin基因在胰腺癌中过表达,其上游序列对于基因表达具有重要作用.文章拟敲除胰腺癌细胞ezrin基因转录调控区,鉴定其基因编辑gRNA靶位点.方法 将携带ezrin基因上游片段的报告基因表达载体瞬时转染胰腺癌细胞Panc-1,采用双荧光素酶报告基因检测系统,鉴定ezrin转录调控区.使用在线软件预测ezrin转录调控区上下游gRNA靶位点,构建基因编辑重组质粒pX459-sgRNA-L和pX458-sgRNA-R.将重组质粒共转染Panc-1细胞,针对gRNA靶位点进行基因组DNA的PCR扩增和亚克隆测序分析,鉴定ezrin转录调控区的靶向敲除.向转染重组质粒的Panc-1细胞中加入嘌呤霉素初步筛选,采用水溶性四氮唑盐法检测细胞增殖能力.结果 荧光素酶报告基因检测结果显示,Panc-1细胞中ezrin基因-1297/-1186片段对SV40启动子和ezrin启动子具有转录增强作用.亚克隆测序结果显示,携带ezrin转录调控区gRNA靶位点序列的重组质粒共转染至Panc-1细胞,细胞基因组DNA出现片段缺失,位于gRNA-L和gRNA-R靶位点之间.细胞增殖实验结果显示,转染重组质粒的Panc-1细胞,其增殖能力显著受到抑制.胰腺癌Panc-1细胞ezrin基因-1297/-1186为转录调控区,其上游gRNA-L和下游gRNA-R序列可作为基因编辑靶点.结论 实现了ezrin转录调控区的靶向敲除,Panc-1细胞增殖能力的抑制有可能与ezrin转录调控区的敲除有关.

目的:研究半枝莲石油醚提取物对EGF诱导的人三阴性乳腺癌细胞株(MDA-MB-231)Ezrin和RhoA蛋白表达的影响,探讨其抑制三阴性乳腺癌细胞增殖、分化的作用机制.方法:溶剂萃取法获得半枝莲石油醚提取物,通过Agilent HPLC-ESI-Q-TOF-MS MassHunter软件分析,于PubChem数据库中获取半枝莲石油醚提取物熊果酸的分子对接信息.采用分子对接技术对半枝莲石油醚提取物中熊果酸与RhoA蛋白受体的对接进行可视化分析.为探讨其抑制肿瘤细胞的分化、增殖机制,取对数生长期细胞分为7组,用含2％胎牛血清培养液进行饥饿培养24 h,给予30 ng/mL EGF分别干预30 min、24 h后,分别给予相应药物培养30 min,采用Western blotting法检测各组MDA-MB-231细胞中RhoA、p-RhoA及Ezrin蛋白表达情况.结果:质谱分析显示,半枝莲石油醚提取物中主要包括长链脂肪酸和萜类成分.生物信息分子对接发现,熊果酸是半枝莲调控RhoA的有效活性成分.Western blotting结果显示,EGF诱导MDA-MB-231细胞30 min及24 h后p-RhoA和Ezrin蛋白相对表达量均明显升高(P<0.05);经Fa-sudil和半枝莲石油醚提取物干预30 min后,MDA-MB-231细胞p-RhoA和Ezrin蛋白相对表达量均明显降低(P<0.05);7组MDA-MB-231细胞RhoA蛋白相对表达量比较,差异均无统计学意义(P>0.05).EGF可能以RhoA蛋白磷酸化的形式参与下游蛋白信号调控,增强肿瘤癌细胞中Ezrin蛋白表达,进而促进癌细胞侵袭和转移.结论:熊果酸是半枝莲调控RhoA的有效活性成分.半枝莲石油醚提取物可通过RhoA信号通路抑制MDA-MB-231细胞的增殖、转移和分化,进而对人三阴性乳腺癌起到治疗作用.

目的 研究白藜芦醇对鼻咽癌细胞侵袭、迁移能力的影响及其分子机制.方法(1)不同浓度白藜芦醇处理鼻咽癌CNE2细胞24、36、48 h,CCK8实验检测白藜芦醇对CNE2细胞增殖的抑制作用,确定适宜的浓度和时间以进行后续实验;(2)不同浓度白藜芦处理鼻咽癌CNE2细胞24 h:Transwell实验检测鼻咽癌细胞的侵袭、迁移能力;Western Blot实验检测与鼻咽癌转移相关的蛋白的表达水平;免疫荧光实验检测鼻咽癌细胞中NF-κB/p65的核转位情况;(3)裸鼠足掌皮下注射鼻咽癌CNE2细胞建立鼻咽癌原发灶模型,不同剂量白藜芦醇灌胃,观察腘窝淋巴结肿大情况,HE染色和免疫组织化学染色检测裸鼠腘窝淋巴结的转移情况.结果(1)CCK8实验发现,白藜芦醇对鼻咽癌CNE2细胞的增殖具有抑制作用,且作用呈浓度和时间依赖性(24,40μmol/L,48 hμmol/L,P<0.01;24,80μmol/L及以上,36,40μmol/L及以上,P<0.001;36 h,20μmol/L,P<0.05,36,40μmol/L及以上P<0.001);(2)Transwell实验发现:白藜芦醇能抑制鼻咽癌CNE-2细胞的侵袭迁移能力,随着白藜芦醇浓度的增高,对鼻咽癌CNE2细胞侵袭迁移能力的抑制作用增强(24,40μmol/L,48,10μmol/L,P<0.01,24,80μmol/L及以上,P<0.001;36,20μmol/L:P<0.05,36,40μmol/L及以上,48,20μmol/L及以上,P<0.001);(3)Western Blot检测发现,随着白藜芦醇浓度增高:EMT相关蛋白E-cadherin的表达水平上升(20、40μmol/L,P<0.01,80μmol/L,P<0.001);基质金属蛋白酶MMP9、MMP2的表达水平明显下调(MMP2,20μmol/L,P<0.05,40、80 mol/L,P<0.001;MMP9,10、20 mol/L,P<0.05,40、80 mol/L,P<0.01);转移相关蛋白Hsp27、Ezrin的磷酸化水平下调(Hsp27,20、40μmol/L,P<0.05;80μmol/L,P<0.01;Ezrin 40μmol/L,P<0.05;80μmol/L,P<0.01);随着白藜芦醇浓度增高:基质金属蛋白酶MMP9、MMP2的表达水平明显下调;EMT相关蛋白E-cadherin的表达水平上升;转移相关蛋白Ezrin、Hsp27的磷酸化水平下调;免疫荧光实验发现:白藜芦醇能抑制NF-κB/p65的核转位,且抑制作用呈浓度依赖性;(4)动物实验发现,白藜芦醇灌胃对荷瘤小鼠的体重无明显影响,但明显减轻瘤侧腘窝淋巴结的肿大程度(体积,50、100 mg/kg,P<0.05;重量50 mg/kg,P<0.05;100 mg/kg,P<0.01).结论 组织学检测显示,白藜芦醇灌胃明显抑制了鼻咽癌细胞由足掌皮下成瘤部位向腘窝淋巴结的转移且抑制作用呈浓度依赖性.白藜芦醇可抑制鼻咽癌CNE2细胞的转移能力,其对鼻咽癌转移能力的抑制作用可能与降低鼻咽癌转移相关蛋白Ezrin和Hsp27的磷酸化水平、抑制NF-κB/p65的核转位,进而抑制EMT、降低MMP2和MMP9的表达水平有关.