JIB-04(Jumonji histone demethylase inihibitor,JIB-04)是一种泛组蛋白赖氨酸去甲基化酶抑制剂,可抑制多种肿瘤发生发展,但其具体机制仍不清楚.本文以肝癌细胞HepG2和Huh7为研究对象,探讨了 JIB-04对肝癌细胞的增殖影响,并揭示其可能的分子机制.CCK-8和EDU检测细胞增殖实验显示,JIB-04明显抑制肝癌细胞HepG2和Huh7活力,且具有浓度依赖性,其半数抑制浓度分别为0.7689 μmol/L及0.7392 μmol/L.流式细胞术检测细胞内ROS水平变化,结果显示,JIB-04可显著激活细胞内ROS的累积.通过谷胱甘肽(glutathione,GSH)检测试剂盒和脂质过氧化物检测试剂盒分别检测细胞内GSH和脂质过氧化物丙二醛(malondialdehyde,MDA)水平发现,在2 μmol/L JIB-04处理下,HepG2和Huh7细胞内GSH分别下降88.4％和80.7％,而脂质过氧化物分别升高4.75倍和9.25倍.通过qRT-PCR和Western印迹分析发现,JIB-04显著降低铁死亡相关因子GPX4和SLC7A11的mRNA水平和蛋白质水平,同时铁死亡相关通路蛋白质MDM2明显下调,P53蛋白水平明显上调.机制研究显示,JIB-04可以使赖氨酸特异性去甲基化酶KDM4C的蛋白质水平下调约58％和51％.通过ChIP检测发现,在JIB-04处理肝癌细胞后MDM2基因启动子区域H3K9me3分别提高了 2.19倍和2.14倍,同时qRT-PCR证明,JIB-04处理肝癌细胞后MDM2 mRNA水平显著下调.综上所述,本研究初步揭示了 JIB-04可下调特异性去甲基化酶KDM4C的表达,进而影响MDM2基因启动子区域H3K9me3甲基化水平抑制MDM2基因表达,减少MDM2蛋白与P53蛋白结合,P53蛋白水平表达上调,同时,铁死亡相关蛋白质SLC7A11和GPX4的表达下调,导致细胞内GSH耗竭、ROS与脂质过氧化物积累,最终导致细胞发生铁死亡.

目的 探讨ALKBH5在卵巢子宫内膜异位囊肿中的作用及其机制.方法 收集2022-01-01-10-10青岛市中心医院5例行卵巢子宫内膜异位囊肿剥除术患者的囊肿组织和正常子宫内膜组织,通过蛋白质印迹实验和实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)实验检测组织中ALKBH5蛋白和mRNA的表达,并在卵巢子宫内膜异位囊肿组织中分离培养子宫内膜间质细胞(EESCs).应用转染小干扰RNA敲低ALKBH5的表达,通过细胞计数盒8(CCK8)、克隆形成实验和Transwell实验验证ALKBH5对EESCs增殖、迁移和侵袭能力的影响,通过脉管形成实验验证ALKBH5对血管生成能力的影响.通过检测谷胱甘肽(GSH)和铁离子含量验证ALKBH5对EESCs铁死亡的影响,通过透射电镜观察ALKBH5对细胞的亚细胞结构的影响,通过qRT-PCR实验和蛋白质印迹实验验证ALKBH5对BECN1表达的影响,通过RIP和MeRIP实验明确ALKBH5是否通过m6A去甲基化修饰调控BECN1的表达.采用Student t检验进行统计学分析.结果 蛋白质印迹实验结果显示,ALKBH5蛋白在卵巢子宫内膜异位囊肿组织中的表达明显高于正常子宫内膜组织.qRT-PCR结果显示,ALKBH5 mRNA在正常子宫内膜组织中的相对表达量为1.000±0.058,在卵巢子宫内膜异位囊肿组织中的相对表达量为2.270±0.044,t=17.56,P＜0.001.CCK8实验结果显示,在72 h时siNC组和siALKBH5组的光密度值分别为1.575±0.000和0.957±0.000,t=23.05,P＜0.001.克隆形成实验结果显示,siNC组和 siALKBH5 组形成的克隆数分别为 75.330±3.712 和 22.670±1.764,t=12.82,P＜0.001.Transwell 实验结果显示,siNC组和siALKBH5组迁移细胞数分别为196.700±8.819和77.000±5.859(t=11.30,P＜0.001),侵袭细胞数分别为62.000±2.309和18.330±2.028(t=14.21,P＜0.001).脉管形成实验结果显示,siNC组和siALKBH5组形成的脉管数分别为 73.330±4.667 和 19.330±1.764,t=10.82,P＜0.001.GSH 含量检测结果显示,siNC 组和 siALKBH5组GSH相对含量分别为1.067±0.088和0.430±0.025,t=6.942,P＜0.001.铁离子含量检测结果显示,siNC组和siALKBH5组铁离子相对含量分别为1.000±0.058和2.773±0.059,t=21.43,P＜0.001.透射电镜观察到敲低ALKBH5后细胞的线粒体和内质网结构破坏和溶解.蛋白质印迹实验结果显示,敲低ALKBH5显著促进BECN1蛋白的表达.qRT-PCR结果显示,siNC组和siALKBH5组BECN1 mRNA相对表达量分别为1.033±0.067和3.277±0.043,t=28.21,P＜0.001.RNA免疫沉淀实验结果显示,IgG组和ALKBH5组BECN1相对富集量分别为1.073±0.101和79.980±3.695,t=21.35,P＜0.001.甲基化RNA免疫沉淀实验结果显示,siNC组和siALKBH5组m6A+BECN1 相对富集量分别为 1.007±0.052 和 2.453±0.098,t=13.01,P＜0.001.结论 ALKBH5 通过介导 m6A 去甲基化抑制BECN1的表达而抑制EESCs铁死亡,促进卵巢子宫内膜异位囊肿的进展.

目的:探讨N6-甲基腺苷(m6A)去甲基化酶ALKBH5在人肝癌中的表达及其对抗肿瘤免疫的影响.方法:采用免疫组织化学染色(IHC)检测50例肝细胞癌(HCC)样本中ALKBH5的表达;采用x2检验分析其与临床特征之间的关系;采用Kaplan-Meier法分析其与患者生存之间的关系;采用GSEA、GO、KEGG和Re-actome通路富集分析预测ALKBH5潜在的作用机制;利用TIMER、TISIDB数据库分析ALKBH5 mRNA与免疫细胞浸润及免疫检查点分子之间的关系.结果:ALKBH5在HCC组织中低表达,并且在肿瘤直径＞5 cm、有包膜浸润、ES分级Ⅲ/Ⅳ级的HCC组织中的表达更低,ALKBH5低表达组患者总生存(OS)和无进展生存(PFS)较差;基因富集分析显示ALKBH5可能参与免疫相关通路,ALKBH5与CD4+T、CD8+T、DC、NK等免疫细胞的浸润相关,与PD-1/L1和CTLA4的表达呈正相关.结论:ALKBH5可能通过影响抗肿瘤免疫促进肝癌恶性进展,导致患者预后不良.

目的:探讨转录因子CCCTC结合因子(CTCF)对翼状胬肉中B淋巴细胞瘤-2基因( Bcl-2)表达的调控及其分子机制。 方法:纳入2017年6月至2019年2月在长沙市第一医院眼科行翼状胬肉切除联合自体角膜缘干细胞移植术治疗的原发性翼状胬肉患者22例，术中收集翼状胬肉组织作为翼状胬肉组；同期纳入因结膜裂伤、眼球破裂伤或眼球穿通伤就诊的眼外伤患者20例，取眼外伤修复手术过程中切取的少量正常结膜组织作为正常结膜组。分别采用实时荧光定量PCR和Western blot法检测各组样本中CTCF及Bcl-2的表达水平；采用亚硫酸氢盐处理后测序法(BSP)检测各组样本中Bcl-2启动子DNA甲基化水平。分离并培养翼状胬肉成纤维细胞，使用波形蛋白抗体进行免疫组织化学鉴定成纤维细胞。将分离培养的细胞分成2个组，CTCF干扰组转染CTCF干扰质粒，对照组转染对照质粒。采用实时荧光定量PCR法和Western blot法检测CTCF、Bcl-2表达水平；采用细胞计数试剂盒8检测各组培养12、24和48 h细胞增生活性；采用BSP检测各组样本中Bcl-2启动子DNA甲基化水平。比较各组各指标差异，采用Pearson线性相关分析探讨翼状胬肉组织中Bcl-2 mRNA与CTCF蛋白及 Bcl-2基因启动子甲基化水平的相关性。 结果:翼状胬肉组CTCF mRNA及蛋白相对表达水平分别为7.23±3.34和0.92±0.21，明显高于正常结膜组的1.10±0.44和0.28±0.07，差异均有统计学意义( t＝－8.136、－13.025，均 P<0.01)。翼状胬肉组Bcl-2 mRNA及蛋白相对表达水平分别为10.27±4.64和0.95±0.27，高于正常结膜组的1.10±0.41和0.32±0.14，差异均有统计学意义( t＝－8.789、－10.782，均 P<0.01)。翼状胬肉组CTCF蛋白相对表达量与Bcl-2 mRNA相对表达量呈显著正相关( r＝0.746， P<0.01)。翼状胬肉组Bcl-2启动子区DNA甲基化水平为0.65±0.09，低于正常结膜组的0.83±0.06，差异有统计学意义( t＝7.408， P<0.01)。翼状胬肉组Bcl-2启动子DNA甲基化水平与Bcl-2 mRNA相对表达量呈显著负相关( r＝－0.635， P<0.01)。CTCF干扰组CTCF及Bcl-2 mRNA相对表达水平为0.37±0.03和0.53±0.06，明显低于对照组的1.02±0.06和0.99±0.07，差异均有统计学意义( t＝20.035、9.029，均 P<0.01)；CTCF干扰组CTCF及Bcl-2蛋白相对表达水平为0.23±0.06和0.56±0.07，低于对照组的0.52±0.05和0.92±0.12，差异均有统计学意义( t＝6.914、4.719，均 P<0.01)。CTCF干扰组转染后12、24和48 h细胞活力分别为0.10±0.01、0.17±0.01和0.38±0.04，低于对应时间点对照组的0.12±0.01、0.29±0.01和0.85±0.06，差异均有统计学意义( t＝3.718、18.350、15.621，均 P<0.01)。CTCF干扰组Bcl-2启动子DNA甲基化水平为0.75±0.04，明显高于对照组的0.61±0.03，差异有统计学意义( t＝－4.472， P<0.05)。 结论:翼状胬肉中CTCF高表达，其可能通过下调启动子DNA甲基化水平介导Bcl-2异常表达。

目的:探讨类甲基转移酶3（METTL3）通过促进叉头框蛋白O（FOXO）3的N6-甲基腺苷修饰（m6A）及其表达参与糖尿病诱导的内皮细胞凋亡的机制。方法:构建晚期糖基化终末产物（AGE）诱导的人主动脉内皮细胞（HAEC）损伤模型，将HAEC分为6组：细胞对照组、细胞AGE组、细胞对照+阴性对照小干扰RNA（siRNA）组、细胞AGE+阴性对照siRNA组、细胞AGE+ FOXO3 siRNA组、细胞AGE+ METTL3 siRNA组，每组设置3个平行组。采用甲基化RNA免疫沉淀测序（MeRIP-Seq）及生物信息学技术检测并分析其m6A修饰谱，采用RNA结合蛋白免疫沉淀（RIP）检测 FOXO3 mRNA的m6A修饰水平，采用流式细胞术检测细胞凋亡，采用实时荧光定量PCR（RT-PCR）检测 FOXO3 mRNA表达水平，Western blotting法检测FOXO3和METTL3蛋白水平。6只6周龄载脂蛋白E基因敲除雄性小鼠按随机数字表法分为单纯动脉粥样硬化组和糖尿病动脉粥样硬化组，每组均为3只。通过Western blotting检测小鼠FOXO3、METTL3蛋白表达，采用免疫荧光共定位检测小鼠FOXO3、METTL3在内皮细胞中的表达。采用两独立样本 t检验进行组间比较。 结果:与细胞对照组相比，细胞AGE组的总m6A修饰及FOXO3的m6A修饰显著升高（ P<0.001），FOXO3和METTL3的蛋白表达显著升高（ P<0.05）。与单纯动脉粥样硬化组相比，糖尿病动脉粥样硬化组小鼠主动脉斑块区域内皮细胞的FOXO3和METTL3的蛋白表达显著升高（ P<0.05）。与细胞AGE+阴性对照siRNA组相比，细胞AGE+ FOXO3 siRNA组的凋亡显著降低（ P<0.01）。与细胞AGE+阴性对照siRNA组相比，细胞AGE+ METTL3 siRNA组FOXO3的m6A修饰（ P<0.001）及FOXO3蛋白表达均显著下降（ P<0.05），且凋亡显著降低（ P<0.001）。 结论:AGE诱导的HAEC中m6A修饰发生了显著变化，METTL3通过促进 FOXO3 mRNA的m6A修饰并调控其表达，从而参与糖尿病诱导的血管内皮细胞凋亡。

目的:探讨外周血Runt相关转录因子2（Runt associated transcription factor 2，RUNX2）基因甲基化及表达水平与乳腺癌新辅助化疗敏感性的相关性。方法:纳入2021年1月至2022年6月于济宁医学院附属医院首次接受全程新辅助化疗并进行手术切除治疗的90例女性乳腺癌患者作为研究对象，同时纳入同期于我院进行体检的90名健康女性作为对照组。采用亚硫酸盐转化法检测所有研究对象的外周血RUNX2基因甲基化水平，采用荧光定量PCR反应检测所有研究对象的外周血RUNX2基因mRNA表达水平。将乳腺癌患者经新辅助化疗后的效果分为敏感和不敏感组。结果:乳腺癌患者外周血RUNX2基因甲基化阳性率为41.11%（37/90），显著低于对照组64.44%（58/90），差异有统计学意义（ χ2=9.83， P=0.002）；乳腺癌患者的外周血RUNX2基因mRNA表达水平为1.73±0.24，显著高于对照组1.19±0.18，差异有统计学意义（ t=5.22， P<0.001）。乳腺癌患者外周血RUNX2基因甲基化阳性患者的基因mRNA表达水平为1.26±0.20，显著低于RUNX2基因甲基化阴性患者1.84±0.26，差异有统计学意义（ t=4.98， P<0.001）。乳腺癌新辅助化疗敏感者的外周血RUNX2基因甲基化阳性率为49.28%（34/69），显著高于不敏感者14.29%（3/21），差异有统计学意义（ χ2=8.14， P=0.004）。新辅助化疗敏感者的外周血RUNX2基因mRNA表达水平为1.62±0.17，显著低于不敏感者2.09±0.22，差异有统计学意义（ t=5.28， P<0.001）。ROC曲线结果显示外周血RUNX2基因mRNA表达水平预测乳腺癌新辅助化疗效果的灵敏度和特异度分别为85.7%和85.5%。 结论:外周血RUNX2基因甲基化及表达水平与乳腺癌新辅助化疗敏感性有关，可作为预测乳腺癌新辅助化疗疗效的标志物。

N 6-甲基腺嘌呤（m 6A）甲基化修饰是真核信使RNA（mRNA）中最常见的内部转录修饰，为一种动态可逆的调控修饰，调控因子包括甲基转移酶、去甲基化转移酶和m 6A识别蛋白。近年来相关研究发现，m 6A甲基化修饰在肿瘤的发生发展过程中发挥着重要的作用。本文就m 6A甲基化修饰及其调控因子的相关概念、在消化道肿瘤中的研究进展、对预后的评估价值及治疗耐药等方面进行综述。

目的:探索葡萄糖对滋养层细胞系HTR8/SVneo细胞Akt2基因甲基化和mRNA水平的影响及早孕期外周血Akt2 mRNA水平与孕前体质指数（BMI）和妊娠期糖尿病（GDM）的关系。方法:（1）构建GDM孕妇子宫内高血糖环境细胞模型，按培养液的葡萄糖浓度分为2.5、5.0、10.0、25.0、40.0 mmol/L 5组；使用实时荧光定量PCR技术检测Akt2 mRNA水平，质谱检测Akt2基因启动子区域的甲基化水平。（2）收集2014年12月至2016年7月在北京大学第一医院分娩的60例孕妇的早孕期外周血，根据其孕前BMI及有无GDM分为4组：超重非GDM组、超重GDM组、肥胖非GDM组和肥胖GDM组。实时荧光定量PCR技术检测4组孕妇早孕期外周血中Akt2 mRNA水平。结果:（1）随培养液中葡萄糖浓度的升高，Akt2 mRNA水平显著升高，呈浓度依赖性（ P均<0.05）。与25.0 mmol/L组相比，5.0 mmol/L组Akt2基因启动子区域的甲基化位点胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤二核苷酸（CpG）10、CpG23、CpG24.5，2.5 mmol/L组Akt2基因启动子区域CpG23、CpG24.5位点，10.0 mmol/L组Akt2基因启动子区域CpG10位点，均出现显著的甲基化水平的改变（ P均<0.05）；与5.0 mmol/L组相比，40.0 mmol/L组Akt2基因启动子区域CpG10位点出现显著的甲基化水平的改变（ P<0.05）。（2）与超重非GDM组［1.04（0.90~1.26）］比较，超重GDM组［2.10（1.85~2.28）］和肥胖GDM组［1.68（0.82~2.43）］Akt2 mRNA水平均升高，差异均有统计学意义（ P均<0.05）。与肥胖GDM组［1.68（0.82~2.43）］比较，超重GDM组［2.10（1.85~2.28）］Akt2 mRNA水平较高，肥胖非GDM组［1.00（0.71~2.17）］Akt2 mRNA水平较低，但差异均无统计学意义（ P均>0.05）。 结论:葡萄糖可能通过改变Akt2基因启动子区域的甲基化状态，从而影响Akt2 mRNA水平，且这种变化可能在GDM孕妇的早孕期已经出现，特别是在孕前BMI较低的孕妇中。

目的:研究甲基转移酶样蛋白14（METTL14）在卵巢上皮性癌（卵巢癌）组织中的表达及其临床意义，探讨上调和下调METTL14表达对卵巢癌细胞系A2780、SKOV3细胞增殖、侵袭和迁移的影响。方法:（1）组织标本检测：选取2019年12月—2020年11月在广西医科大学附属肿瘤医院行手术治疗的20例卵巢癌患者的新鲜癌组织标本，收集同期因子宫肌瘤行子宫及双侧附件切除术的15例患者的新鲜正常卵巢组织标本作为对照，免疫组化法检测卵巢癌与正常卵巢组织中METTL14蛋白表达的差异。另收集2014年1月—2019年10月在广西医科大学附属肿瘤医院行手术治疗的121例卵巢癌患者的癌组织蜡块，免疫组化法检测卵巢癌组织中METTL14蛋白的表达，并分析METTL14蛋白表达与卵巢癌患者临床病理特征及预后的关系。（2）细胞实验：分别使用慢病毒载体、小分子干扰RNA（siRNA）技术，构建上调、下调METTL14表达的卵巢癌A2780、SKOV3细胞系，并采用逆转录（RT）-实时荧光定量PCR（qPCR）技术和蛋白印迹（western blot）法分别验证其METTL14 mRNA和蛋白的表达。后续的细胞实验分为5组，LV-METTL14组（转染慢病毒载体上调METTL14表达）及其对照LV-NC组（转染阴性对照慢病毒空载体），si-METTL14组（转染si-METTL14-2下调METTL14表达）及其对照si-NC组（转染阴性对照siRNA），以及空白组（未转染）。采用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）法检测各组卵巢癌细胞中N-6甲基腺嘌呤（m6A）修饰水平的变化，分别采用活细胞计数（CCK-8）法、划痕实验以及穿膜（transwell）小室侵袭和迁移实验检测各组卵巢癌细胞增殖、愈合以及侵袭和迁移能力的变化。结果:（1）20份卵巢癌组织中METTL14蛋白的免疫组化总评分为（6.2±3.7）分，显著高于15份正常卵巢组织［（3.3±2.5）分； t=-2.64， P=0.012］。121例卵巢癌患者中，METTL14蛋白高表达（免疫组化总评分≥6分）69例（57.0%，69/121），METTL14蛋白低表达（免疫组化总评分<6分）52例（43.0%，52/121）；METTL14蛋白高表达与METTL14蛋白低表达患者比较，手术病理分期更晚，淋巴结转移率、腹腔转移率、腹水发生率更高，分别比较，差异均有统计学意义（ P均<0.05）；METTL14蛋白高表达患者的总生存率显著低于METTL14蛋白低表达者（ P=0.009）。（2）LC-MS/MS法分析显示，LV-METTL14组A2780和SKOV3细胞中m6A的表达水平分别为0.213±0.024、0.181±0.018，均显著高于LV-NC组（分别为0.109±0.022、0.128±0.020； P均<0.05）；而si-METTL14组A2780和SKOV3细胞中m6A的表达水平分别为0.063±0.012、0.069±0.015，均显著低于si-NC组（分别为0.108±0.014、0.121±0.014； P均<0.05）。CCK-8法检测显示，si-METTL14组SKOV3细胞在培养在36、48、60 h时的吸光度（ A）值均显著低于si-NC组（ P均<0.05）；LV-METTL14组A2780和SKOV3细胞在培养48、60 h时的 A值均显著高于LV-NC组（ P均<0.01）。划痕实验显示，培养24 h，si-METTL14组A2780和SKOV3细胞的迁移率低于si-NC组，LV-METTL14组A2780和SKOV3细胞的迁移率高于LV-NC组，分别比较，差异均有统计学意义（ P均<0.01）。在transwell小室侵袭、迁移实验中，培养24 h，si-METTL14组A2780和SKOV3细胞的穿膜细胞数均少于si-NC组，LV-METTL14组A2780和SKOV3细胞的穿膜细胞数均多于LV-NC组，分别比较，差异均有统计学意义（ P均<0.01）。 结论:METTL14蛋白高表达的卵巢癌患者的预后更差。上调METTL14表达可提高卵巢癌细胞m6A修饰水平，促进卵巢癌细胞的增殖、侵袭和迁移；反之，下调METTL14表达则降低卵巢癌细胞m6A修饰水平，抑制卵巢癌细胞的增殖、侵袭和迁移。

目的:检测妊娠期糖尿病（gestational diabetes mellitus，GDM）孕妇胎盘组织过氧化物酶体增生物激活受体γ共激活因子1α（PGC-1α）基因甲基化水平及mRNA表达水平，并探讨二者与胎儿宫内窘迫的关系。方法:选取2018年7月至2019年12月烟台市烟台山医院产科收治的174例GDM孕妇为研究对象，其中胎儿出现宫内窘迫的78名孕妇作为胎儿宫内窘迫组；胎儿正常出生未出现宫内窘迫的96例孕妇为对照组；另同期选取82名无GDM正常妊娠孕妇作为健康组。亚硫酸氢钠处理DNA后采用直接测序法检测胎盘组织中PGC-1α基因甲基化水平；实时荧光定量PCR（qRT-PCR）法检测胎盘组织中PGC-1α mRNA表达水平；全自动生化分析仪检测甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）水平；分析胎儿发生宫内窘迫孕妇PGC-1α基因甲基化频率与PGC-1α mRNA表达水平的相关性；分析影响胎儿宫内窘迫发生的因素。结果:胎儿宫内窘迫组PGC-1α基因甲基化频率及TG水平[（25.42±7.31）%、（4.72±0.68）mmol/L]高于对照组[（9.26±2.67）%、（4.31±0.64）mmol/L]和健康组[（3.24±1.07）%、（4.33±0.72）mmol/L]，对照组PGC-1α基因甲基化频率高于健康组，差异均有统计学意义（ P<0.05）；胎儿宫内窘迫组PGC-1α mRNA表达水平（0.67±0.16）低于对照组（0.74±0.14）和健康组（1.00±0.27），对照组PGC-1α mRNA表达水平低于健康组，差异均有统计学意义（ P<0.05）；胎儿发生宫内窘迫孕妇PGC-1α基因甲基化频率与PGC-1α mRNA表达水平呈负相关（ r=-0.515、 P<0.05）；PGC-1α基因甲基化是影响胎儿发生宫内窘迫的独立危险因素（ P<0.05），PGC-1α mRNA高表达是胎儿发生宫内窘迫的保护因素（ P<0.05）。 结论:GDM孕妇PGC-1α基因DNA甲基化水平与胎儿宫内窘迫相关，有可能作为胎儿宫内窘迫的基因修饰靶点。