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人蜕膜间充质干细胞来源外泌体对高糖老化人真皮成纤维细胞功能的影响及其可能机制
编辑人员丨1周前
目的:建立人真皮成纤维细胞(HDF)高糖老化模型,探讨人蜕膜间充质干细胞(dMSC)来源外泌体对高糖老化HDF增殖、迁移、凋亡的影响及其可能机制。方法:采用实验研究方法。收集2021年1—3月解放军总医院第四医学中心收治的4例男性包茎患者(18~22岁)环切术后废弃包皮组织,分离培养获取原代HDF。取第6代HDF,按照随机数字表法分为低糖组和高糖组,分别采用低糖完全培养基和高糖完全培养基进行每72小时换液、不传代培养,10 d后取细胞,于接种后24 h,采用β-半乳糖苷酶试剂盒检测细胞衰老情况;于接种后48 h,采用蛋白质印迹法检测细胞衰老相关蛋白p16、p53表达情况;于接种后24、48、72 h,采用细胞计数试剂盒8(CCK-8)法检测细胞增殖情况;于接种后48 h,采用脱氧尿嘧啶核苷(EdU)染色法检测细胞增殖情况,采用流式细胞术检测细胞周期及凋亡情况;于接种后24 h,采用Transwell实验测定细胞迁移能力。取人dMSC培养48~72 h,采用差速高速离心法获取其外泌体,采用透射电子显微镜观察dMSC外泌体形态,采用纳米颗粒追踪分析法检测dMSC外泌体的粒径分布,采用蛋白质印迹法检测dMSC外泌体标志蛋白CD9、肿瘤易感基因101(TSG101)的表达。取dMSC外泌体及前述高糖完全培养基诱导老化的HDF共孵育24 h,采用PKH67试剂盒检测细胞摄取外泌体的情况。取前述高糖完全培养基诱导老化的HDF,同前分为单纯高糖组、高糖+低浓度外泌体组、高糖+高浓度外泌体组,分别于高糖完全培养基中加入等体积的磷酸盐缓冲液、终质量浓度为50 μg/mL dMSC外泌体、终质量浓度为100 μg/mL dMSC外泌体进行常规细胞培养。分组后同前于对应时间点采用CCK-8法和EdU染色法、流式细胞术、Transwell实验分别检测细胞增殖、细胞周期和凋亡及细胞迁移情况。根据前述结果,另取经高糖完全培养基诱导老化的HDF,分为单纯高糖组、高糖+高浓度外泌体组并同前处理。分组培养48 h,采用实时荧光定量反转录PCR法检测单纯高糖组和高糖+高浓度外泌体组细胞衰老相关的微小RNA-145-5p(miR-145-5p)、miR-498、miR-503-5p及其靶基因钙/钙调素依赖性蛋白激酶1D(CAMK1D)、人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源的基因( PTEN基因)和细胞周期蛋白D1的mRNA表达情况。对数据行析因设计方差分析、单因素方差分析、LSD- t检验和独立样本 t检验。 结果:接种后24 h,高糖组HDF β-半乳糖苷酶阳性染色率为(38.4±4.2)%,明显高于低糖组的(16.5±2.2)%( t=4.65, P<0.01)。接种后48 h,高糖组HDF的衰老相关蛋白p16和p53的表达量均明显高于低糖组( t值分别为11.85、3.02, P<0.05或 P<0.01)。接种后24、48、72 h,高糖组HDF的增殖活性均明显低于低糖组( t值分别为4.13、9.90、15.12, P<0.01)。接种后48 h,高糖组HDF的EdU阳性染色率明显低于低糖组( t=3.83, P<0.05)。接种后48 h,高糖组HDF周期的G2/M+S亚群在3个亚群(G0/G1、S和G2/M)的占比明显低于低糖组( t=8.74, P<0.01)。接种后24 h,高糖组HDF穿过Transwell滤膜到达下室的细胞数量为(37±6)个,明显少于低糖组的(74±7)个( t=8.42, P<0.01)。接种后48 h,高糖组HDF凋亡率明显高于低糖组( t=8.48, P<0.01)。dMSC外泌体为边缘清晰、大小分布均匀的杯状或者圆形囊泡,粒径基本处于80~200 nm。dMSC外泌体标志性蛋白CD9、TSG101表达均呈阳性。共孵育24 h,外泌体被HDF摄入胞内,主要分布于细胞核周围。分组培养24、48、72 h,高糖+低浓度外泌体组和高糖+高浓度外泌体组HDF增殖活性均明显高于单纯高糖组( t值分别为6.36、6.10、7.76,8.92、12.17、10.74, P<0.01),高糖+高浓度外泌体组HDF增殖活性均明显高于高糖+低浓度外泌体组( t值分别为7.92、4.82、4.72, P<0.01)。分组培养48 h,与单纯高糖组比较,高糖+低浓度外泌体组和高糖+高浓度外泌体组HDF EdU阳性染色率均明显升高( t值分别为5.32、9.88, P<0.01);与高糖+低浓度外泌体组比较,高糖+高浓度外泌体组HDF EdU阳性染色率显著升高( t=5.27, P<0.01)。分组培养48 h,与单纯高糖组比较,高糖+低浓度外泌体组和高糖+高浓度外泌体组HDF中的G0/G1期亚群占比均显著降低( t值分别为3.81、4.31, P<0.05),G2/M+S亚群占比均明显升高( t值分别为3.81、4.31, P<0.05)。分组培养24 h,与单纯高糖组相比,高糖+低浓度外泌体组和高糖+高浓度外泌体组HDF穿过滤膜的数量均明显增多( t值分别为10.14、13.39 ,P<0.01);与高糖+低浓度外泌体组相比,高糖+高浓度外泌体组HDF穿过滤膜的数量明显增多( t=6.27 ,P<0.01)。分组培养48 h,与单纯高糖组比较,高糖+低浓度外泌体组和高糖+高浓度外泌体组HDF凋亡率均明显降低( t值分别为3.72、5.53, P<0.05或 P<0.01)。分组培养48 h,与单纯高糖组相比,高糖+高浓度外泌体组HDF的miR-145-5p、miR-498 mRNA表达量均明显上升( t值分别为13.03、8.90, P<0.01),miR-503-5p mRNA表达量明显下降( t=3.85, P<0.05);高糖+高浓度外泌体组中HDF的CAMK1D、 PTEN基因mRNA表达量均明显低于单纯高糖组( t值分别为8.83、5.97, P<0.01),细胞周期蛋白D1 mRNA表达量明显高于单纯高糖组( t=4.03, P<0.05)。 结论:人dMSC来源外泌体可显著提高高糖老化HDF的增殖和迁移能力,抑制其凋亡。这可能与HDF内miR-145-5p和miR-498表达增高抑制了CAMK1D和 PTEN基因的表达及miR-503-5p表达下降促进了细胞周期蛋白D1的表达有关。
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编辑人员丨1周前
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微小RNA-25通过肿瘤相关成纤维细胞外泌体促进食管癌细胞的远处转移
编辑人员丨1周前
目的:探讨肿瘤相关成纤维细胞(CAFs)源性外泌体中微小RNA(miR)-25参与促进食管癌细胞转移的作用及机制。方法:获取新鲜食管癌及癌旁组织,通过贴壁法分别获得CAFs和成纤维细胞(NFs),蛋白质印迹法(Western blot)和免疫荧光法检测α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、波形蛋白(Vimentin)的表达进行鉴定。用超速离心法提取CAFs和NFs的外泌体,用Western blot和透射电镜对外泌体进行鉴定,采用荧光实时定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测食管癌组织和癌旁组织中miR-25的表达,结果用配对样本 t检验进行统计学分析。同时用RT-qPCR检测CAFs、NFs和相应外泌体,以及外泌体共培养的食管癌TE-1中miR-25的表达,并将外泌体与TE-1共培养后检测TE-1迁移侵袭能力。Western blot及荧光素酶实验明确miR-25的靶基因,结果用非配对样本 t检验进行统计学分析。 结果:RT-qPCR结果提示,与癌旁组织比较,食管癌组织中高表达miR-25( n=30, t= 3.46, P<0.05);miR-25在CAFs中的表达高于NFs( t=5.37, P<0.05);免疫荧光结果提示,相较于NFs,CAFs中α-SMA、Vimentin荧光信号增强;Western blot结果提示外泌体中表达CD9和TSG101蛋白,且透射电镜鉴定符合外泌体特征;RT-qPCR结果提示,CAFs源性外泌体中miR-25的表达高于NFs外泌体( t=5.45, P<0.05)。Transwell实验表明,NFs外泌体与TE-1共培养组,每视野TE-1迁移细胞数为(202.700±17.840)个,CAFs外泌体与TE-1共培养组为(558.000±19.430)个( t=13.47, P<0.01, n=3);NFs外泌体与TE-1共培养组,每视野TE-1侵袭细胞数为(174.000±10.070)个,CAFs外泌体与TE-1共培养组为(428.000±8.888)个( t=18.91, P<0.01, n=3);miR-NC转染TE-1组,每视野TE-1迁移细胞数为(68.000±2.082)个,miR-25 mimics转染TE-1组为(379.000±6.083)个( t=48.37, P<0.01, n=3);miR-NC转染TE-1组,每视野TE-1侵袭细胞数为(40.000±2.082)个,miR-25 mimics转染TE-1组为(254.000±2.000)个( t=74.13, P<0.01, n=3),进一步荧光素酶报告基因结果显示,过表达miR-25可降低58%的PTEN 3’UTR野生型的荧光素酶活性(野生型: t=7.19, P<0.05),证实miR-25可靶向促进PTEN的表达。 结论:CAFs外泌体miR-25能够通过激活PTEN信号通路,而促进食管癌细胞的远处转移。
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编辑人员丨1周前
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微小RNA-101对胰腺癌PANC1细胞增殖、凋亡和侵袭的影响及其作用机制
编辑人员丨1周前
目的:探讨微小RNA-101(miR-101)对胰腺癌PANC1细胞增殖、凋亡和侵袭的影响及其可能的作用机制。方法:取对数生长期PANC1细胞分为5组,除对照组外,分别为转染miRNA模拟体的阴性对照(mimic-NC)组、转染miRNA-101模拟体(miR-101 mimic)组、转染miRNA抑制剂的阴性对照(inhibitor-NC)组、转染miRNA-101抑制剂(miR-101 inhibitor)组。采用qRT-PCR检测miR-101相对表达水平,MTT法检测细胞增殖率,流式细胞仪检测细胞凋亡率,Transwell实验检测细胞侵袭能力,qRT-PCR和蛋白质免疫印迹法检测IL-6、JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3 mRNA蛋白的相对表达水平,双荧光素酶报告基因法检测miR-101与IL-6的靶向关系。结果:转染48 h后,对照组、mimic-NC组、miR-101 mimic组、inhibitor-NC组、miR-101 inhibitor组PANC1细胞miR101表达水平分别为1.98±0.12、2.01±0.18、6.73±0.23、2.16±0.22、1.34±0.13;增殖率分别为(32.75±2.43)%、(33.17±2.77)%、(15.68±1.17)%、(31.57±2.65)%和(45.75±3.16)%;凋亡率分别为(3.82±0.57)%、(3.54±0.55)%、(28.61±0.78)%、(3.57±0.63)%、(1.03±0.62)%;穿膜细胞数分别为(125.82±3.55)、(132.17±4.28)、(58.83±3.24)、(128.77±5.06)、(248.42±5.64)个/高倍视野。miR-101 mimic组miR101表达水平和凋亡率显著高于对照组和mimic-NC组,增殖率和穿膜细胞数显著低于对照组和mimic-NC组,而miR-101 inhibitor组miR-101表达水平和凋亡率显著低于对照组、inhibitor-NC组、miR-101 mimic组,增殖率和穿膜细胞数显著高于对照组、inhibitor-NC组、miR-101 mimic组。miR-101 mimic组PANC1细胞IL-6、JAK2、STAT3 mRNA和蛋白质表达水平显著低于对照组、mimic-NC组,而miR-101 inhibitor组显著高于对照组、miR-101 mimic组、inhibitor-NC组。以上差异均有统计学意义( P值均<0.001)。双荧光素酶报告基因法检测结果显示,miR-101可靶向作用IL-6。 结论:miR-101能够抑制胰腺癌细胞的增殖和侵袭,促进其凋亡,其机制可能是通过调节IL-6/JAK2/STAT3信号通路发挥作用。
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编辑人员丨1周前
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多发性大动脉炎患者血浆外泌体携带的差异微小RNA和蛋白表达谱分析
编辑人员丨1周前
目的:检测初治多发性大动脉炎(TAK)患者血浆外泌体携带的微小RNA和蛋白,分析其在TAK发病机制中的可能作用。方法:选2020年6月至11月北京协和医院风湿免疫科确诊的初治TAK患者10例,另选与之年龄性别匹配的健康对照者5例,分别通过RNA测序和蛋白质谱技术检测血浆外泌体携带的微小RNA和蛋白,筛选出差异表达的微小RNA和蛋白,并对其进行层次聚类分析、功能、信号通路和结构域富集分析,最终筛选出与血管炎有关的微小RNA和蛋白,探究其在TAK发病机制中的可能作用。统计学采用Fisher精确概率检验或 χ2检验。 结果:TAK患者血浆外泌体携带的差异表达的微小RNA 29个,其中miR-101-3p、miR-122-5p、miR-143-3p、miR-185-3p、miR-192-5p、miR-194-5p、miR-19a-3p、miR-19b-3p、miR-20b-5p、miR-21-5p、miR-22-3p、miR-335-5p、miR-34a-5p、miR-3613-5p、miR-548ad-5p、miR-590-3p、miR-7-5p表达上调,miR-1249-3p、miR-141-3p、miR-199a-5p、miR-199b-5p、miR-200a-3p、miR-200c-3p、miR-204-5p、miR-29c-5p、miR-335-3p、miR-381-3p、miR-4433b-5p、miR-584-5p表达下调。差异表达的蛋白357个,其中236个表达上调,121个表达下调,最终筛选前激肽释放酶、激肽原1、桥粒蛋白。结论:血浆外泌体携带的miR-34a-5p、miR-200c-3p、miR-143-3p、miR-22-3p、miR-21-5p、前激肽释放酶、激肽原1、桥粒蛋白可能通过调节血管生理过程、炎症反应、自身免疫等过程参与TAK的发病机制,具有作为TAK生物标志物和治疗靶点的潜在作用。
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编辑人员丨1周前
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人参皂苷调控间充质干细胞分泌外泌体及对血管新生相关miRNAs表达的影响
编辑人员丨1周前
目的:探讨人参皂苷Rg1(GS-Rg1)调控间充质干细胞分泌外泌体(MSC-Exo)及对血管生成相关微小RNAs(miRNAs)表达的影响。方法:将人脐带血间充质干细胞(hUCBMSCs)分为实验组和对照组,实验组加入终浓度为40 mg/L的GS-Rg1,对照组加入等体积的PBS,均培养24 h。采用透射电子显微镜观察MSC-Exo形态,蛋白免疫印迹法鉴定其特征性表面标志物,二辛丁酸蛋白定量法检测MSC-Exo浓度,反转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测MSC-Exo中8种与血管新生相关miRNAs的表达。结果:培养24 h后,可见呈圆形膜囊泡结构的MSC-Exo。MSC-Exo特征性表面标志物CD9、CD63和TSG101的表达均呈阳性。干预24 h后,实验组与对照组MSC-Exo蛋白浓度分别为(1.080±0.019)μg/μl和(0.881±0.032)μg/μl,差异有统计学意义( P<0.01)。实验组miR-126-3p、miR-21、miR-146a-5p、miR-126b-5p表达显著高于对照组,miR-16-5p表达低于对照组,差异有统计学意义(均 P<0.05)。 结论:GS-Rg1能够促进MSC-Exo的分泌,并能增强Exo内与血管生成相关miRNAs的表达,促进血管新生。
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编辑人员丨1周前
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血浆外泌体miR-214-3p作为葡萄膜黑色素瘤诊断及预后评估生物标志物的研究
编辑人员丨1周前
目的:探讨微小RNA(miR)-214-3p在不同类型葡萄膜黑色素瘤(UM)患者血浆外泌体中的差异性表达,评估其是否可作为UM诊疗的新型分子生物标志物。方法:收集2015年12月至2019年10月于北京同仁医院行眼球摘除术并确诊为UM的患者25例,其中原位梭形细胞型UM组和原位类上皮细胞型UM组各10例,转移型UM组5例(包括1例梭形细胞型UM患者和4例类上皮细胞型UM患者);同期收集10例健康对照者作为健康对照组,抽取所有受试者血液样本,提取血浆外泌体,透射电子显微镜下观察外泌体形态,分析外泌体粒径,Western blot法鉴定外泌体标记蛋白,采用实时荧光定量PCR法测定各组患者血浆外泌体miR-214-3p表达水平。采用差异性检验比较UM患者与健康对照者和不同类型UM患者间的血浆外泌体miR-214-3p的差异表达;通过受试者工作特征(ROC)曲线评价血浆外泌体miR-214-3p对UM的诊断及分型效能。结果:透射电子显微镜下可见,所提取外泌体呈一侧凹陷的半球形结构,直径约100 nm。囊泡粒径大小为(82.0±2.7)nm。Western blot结果显示外泌体特异性标记蛋白TSG101条带均为阳性,阴性标记蛋白Calnexin均呈阴性。健康对照组、原位UM组和转移型UM组血浆外泌体miR-214-3p相对表达量分别为0.86(0.57,1.49)、0.24(0.10,0.67)和0.43(0.23,0.56),原位UM组血浆外泌体miR-214-3p相对表达量较健康对照组明显降低,差异有统计学意义( Z=2.62, P<0.01);ROC曲线对血浆外泌体中miR-214-3p的诊断效能分析显示,血浆外泌体miR-214-3p的AUC为0.795。转移型UM组血浆外泌体miR-214-3p相对表达量较健康对照组明显降低,差异有统计学意义( Z=2.08, P<0.05);原位梭形细胞型UM组和原位类上皮细胞型UM组血浆外泌体miR-214-3p相对表达量分别为0.11(0.07,0.64)和0.46(0.14,0.91),2个组间以及转移型UM组与原位类上皮型UM组间患者血浆外泌体miR-214-3p相对表达量比较差异均无统计学意义(均 P>0.05)。 结论:血浆外泌体miR-214-3p在原位UM患者及转移型UM患者中均显著下降,循环miR-214-3p具有作为UM诊断生物标志物的潜力,但血浆外泌体miR-214-3p缺乏对UM分型的评估能力。
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编辑人员丨1周前
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miR-101-3p通过靶向EIF4G2逆转卵巢癌SKOV3/DDP细胞对顺铂耐药性及其机制研究
编辑人员丨1周前
目的:探讨microRNA-101-3p(miR-101-3p)在卵巢癌顺铂(cisplatin,DDP)耐药中的作用及其机制。方法:购买miR-101-3p模拟物(miR-101-3p mimic)、miR-101-3p抑制剂(miR-101-3p-in)、及其各自的阴性对照RNA(miR-NC mimic和miR-NC inhibitor)。应用定量逆转录聚合酶链反应(real-time reverse transcription-PCR,qRT-PCR)和western blotting检测miR-101-3p和B淋巴瘤momlv插入区1同源物(eukaryotic translation initiation factor 4 gamma 2,EIF4G2)在卵巢癌SKOV3细胞和DDP耐药SKOV3/DDP细胞中的表达水平。用miR-101-3p模拟物和miR-101-3p模拟阴性对照转染SKOV3/DDP细胞。采用CCK-8法检测miR-101-3p模拟物转染后细胞对DDP的敏感性。流式细胞仪检测转染对细胞凋亡的影响。将EIF4G2野生型和突变型荧光素酶报告质粒与miRNA-101-3p模拟物或miRNA-101-3p NC共转染,用双荧光素酶报告系统分析荧光素酶活性。结果:CCK-8法检测结果显示,miR-101-3p在SKOV3/DDP细胞中的表达水平显著低于SKOV3细胞,EIF4G2在SKOV3/DDP细胞中的表达水平显著高于SKOV3细胞。过表达miR-101-3p能够显著提高miR-101-3p mimic组中SKOV3/DDP细胞对DDP的敏感性,其IC50值为8 μmol/L和64 μmol/L,miR-101-3p mimic可抑制SKOV3/DDP细胞活性;AO/EB实验验证过表达miR-101-3p后miR-101-3p mimic能够明显诱导SKOV3/DDP细胞凋亡。Western blotting检测结果表明,miR-101-3p mimic可显著增加B细胞淋巴瘤2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(associated X protein,Bax)及裂解型半胱天冬酶-3的表达水平( t=3.57、3.95、4.17, P值均<0.05)。与miR-NC mimic相比,过表达miR-101-3p后能够明显降低EIF4G2的表达( t=4.15, P<0.05);荧光素酶活性检测数据显示,miR-101-3p的过表达会抑制野生型EIF4G2的荧光素酶活性,但不抑制突变型EIF4G2 3’UTR的荧光素酶活性。 结论:EIF4G2是miR-101-3p的直接作用靶点,MiR-101-3p可能通过靶向调控EIF4G2,调节卵巢癌对DDP的耐药性。
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编辑人员丨1周前
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微小RNA-484靶向肝细胞核因子1A调控食管癌恶性细胞行为的分子机制
编辑人员丨1周前
目的:探讨微小RNA(miRNA,miR)-484靶向肝细胞核因子1A(HNF1A)调控食管癌恶性细胞行为的分子机制。方法:选取河南省人民医院2017年6月至2019年1月手术切除的101例食管癌组织和癌旁组织作为研究对象,采用荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)分析miR-484表达水平;采用慢病毒介导miRNA对照和miR-484在食管癌细胞系Eca109建立miRNA对照组和miR-484组过表达细胞系。采用细胞计数试剂盒(CCK-8)分析两组细胞增殖能力;采用Transwell分析两组细胞迁移能力;采用流式细胞术分析两组细胞凋亡;采用生物信息学和双荧光素酶报告基因分析miR-484靶基因,采用蛋白质免疫印迹法(Western blot)分析靶基因及迁移和凋亡相关蛋白表达。组间比较采用 t检验。 结果:癌旁组织miR-484表达水平(1.09±0.21)高于食管癌组织(0.31±0.17),差异有统计学意义( t=3.117, P<0.05)。miRNA对照组细胞miR-484表达水平(1.21±0.17)低于食管癌组织(3.96±0.35),差异有统计学意义( t=3.117, P<0.05)。miRNA对照组24 h和48 h吸光度( A)值(1.14±0.14、1.93±0.22)高于miR-484组细胞24 h和48 h A值(0.81±0.13、1.48±0.27),差异有统计学意义( t=2.910、2.791, P<0.05),miRNA对照组细胞侵袭数量[(74.03±5.90)个]高于miR-484组细胞侵袭数量[(37.84±3.99)个],差异有统计学意义( t=4.805, P<0.05)。miRNA对照组细胞凋亡比例[(5.09±1.73)%]低于miR-484组细胞[(20.43±4.08)%],差异有统计学意义( t=3.719, P<0.05)。HNF1A是miR-484的靶基因。miRNA对照组细胞HNF1A和Caspase-3蛋白相对表达水平(1.89±0.25、0.63±0.12)低于miR-484组细胞(5.11±0.72、1.06±0.15),差异有统计学意义( t=6.109、2.091, P<0.05)。miRNA对照组细胞FAK蛋白相对表达水平(1.97±0.28)高于miR-484组细胞(1.48±0.21),差异有统计学意义( t=2.018, P<0.05)。 结论:miR-484在食管癌组织中呈低表达,通过影响靶蛋白HNF1A表达水平,参与食管癌细胞增殖、迁移和凋亡等生物学行为。
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编辑人员丨1周前
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外泌体参与调节高磷诱导的大鼠血管平滑肌细胞钙化
编辑人员丨1周前
目的:探究外泌体在高磷诱导的大鼠血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMC)钙化中的调节作用。方法:体外培养VSMC(A7r5细胞),随机分为正常磷组(0.9 mmol/L)、高磷组(2.6 mmol/L)及高磷外泌体诱导组(即高磷组细胞提取的外泌体加入正常培养的VSMC中)。至培养第7天,收集正常磷组、高磷组细胞培养换液过程中获得的培养液,通过超速离心法得到沉淀物,BCA蛋白定量法测定所得沉淀物蛋白含量,分别对所得沉淀物用透射电镜观察沉淀物形态及大小,Western印迹法检测外泌体标志蛋白肿瘤易感基因101蛋白(tumor susceptibility gene 101 protein,TSG101)、CD9;并对外泌体微RNA(microRNA,miRNA,miR)进行提取,实时定量PCR法检测miR-30b、miR-204、miR-211含量。分别培养7 d后,观察高磷外泌体诱导组VSMC对外泌体的摄取过程,观察3组细胞形态,茜素红染色检测细胞钙盐沉积水平,邻甲苯酚络合铜检测细胞钙离子含量,比色法检测细胞碱性磷酸酶含量,Western印迹法检测成骨特异性转录因子(Runx2)蛋白表达情况。结果:(1)VSMC培养液经超速离心法所获沉淀物,经电镜形态学鉴定为外泌体,Western印迹法证实外泌体标志蛋白TSG101、CD9表达阳性。(2)外泌体内富含miRNA,经测定,高磷组外泌体中负向调控Runx2转录的miR-30b、miR-204、miR-211表达较正常磷组明显下调(均 P<0.05)。(3)高磷培养VSMC 7 d后,钙盐沉积明显,与正常磷组相比,钙含量、碱性磷酸酶活性明显增高(均 P<0.05),Runx2表达也明显增高( P<0.05)。(4)将所得高磷组外泌体加入正常培养的VSMC中,外泌体可被VSMC摄取并成功诱导VSMC发生钙化,VSMC钙化指标及Runx2表达水平均明显增高。 结论:高磷诱导VSMC发生钙化,促进Runx2表达增高,其机制可能是借由VSMC释放外泌体传递细胞信号而实现。
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编辑人员丨1周前
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血浆微小核糖核酸-101-3p和微小核糖核酸-141-3p在脓毒症患儿中表达的意义
编辑人员丨1周前
目的:探讨血浆微小核糖核酸-101-3p(miR-101-3p)及微小核糖核酸-141-3p(miR-141-3p)在脓毒症患儿中的表达及其临床意义。方法:选择2016年1月至2019年10月三亚市人民医院收治的153例脓毒症患儿,根据其病情严重程度分为脓毒症非休克组(94例)和脓毒症休克组(59例);根据脓毒症患儿28 d的生存情况,将其分为存活组(107例)和死亡组(46例),另选取60例健康儿童作为健康对照组。采用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)检测所有研究对象血浆miR-101-3p及miR-141-3p表达水平。应用受试者工作特征曲线(ROC)分析血浆miR-101-3p、miR-141-3p及降钙素原(PCT)水平对脓毒症诊断及预后评估的价值。采用 Pearson相关分析脓毒症患儿血浆miR-101-3p及miR-141-3p表达水平与PCT、急性生理和慢性健康Ⅱ(APACHE Ⅱ)评分、序贯器官衰竭评分(SOFA评分)、白细胞计数及C反应蛋白水平的相关性。 结果:脓毒症休克组和脓毒症非休克组血浆miR-101-3p、miR-141-3p及PCT水平均高于健康对照组,差异均有统计学意义(均 P<0.001),且脓毒症休克组血浆miR-101-3p(4.25±1.46比1.86±0.75)、miR-141-3p(3.17±1.08比1.20±0.52)及PCT[(20.75±9.36) μg/L比(5.80±2.40) μg/L]水平均明显高于脓毒症非休克组,差异均有统计学意义(均 P<0.001)。死亡组和存活组血浆miR-101-3p、miR-141-3p及PCT水平均明显高于健康对照组,差异均有统计学意义(均 P<0.001),且死亡组血浆miR-101-3p(4.83±1.62比1.40±0.58)、miR-141-3p(3.50±1.13比0.96±0.47)及PCT[(26.30±11.72) μg/L比(3.25±2.16) μg/L]水平均明显高于存活组,差异均有统计学意义(均 P<0.001)。ROC曲线分析显示,miR-101-3p、miR-141-3p及PCT联合诊断脓毒症的曲线下面积(AUC)和95%可信区间(95% CI)明显高于miR-101-3p、miR-141-3p或PCT单独指标[0.908(0.850~0.970)比0.810(0.748~0.873)、0.784(0.723~0.844)、0.825(0.764~0.883), Z1=4.682、 Z2=5.380、 Z3=4.417,均 P<0.05],其敏感度为92.5%,特异度为84.0%。miR-101-3p、miR-141-3p及PCT联合预测脓毒症患儿死亡的AUC和95% CI明显高于miR-101-3p、miR-141-3p或PCT单独指标[0.930(0.872~0.986)比0.848(0.786~0.907)、0.792(0.730~0.853)、0.820(0.762~0.878), Z1=4.537、 Z2=5.728、 Z3=5.106,均 P<0.05],其敏感度为94.6%,特异度为87.0%。相关性分析显示,脓毒症患儿血浆miR-101-3p及miR-141-3p表达水平与PCT( r=0.804、0.773,均 P<0.001)、APACHE Ⅱ评分( r=0.738、0.695,均 P<0.001)及SOFA评分( r=0.752、0.764,均 P<0.001)均呈正相关。 结论:脓毒症患儿血浆miR-101-3p及miR-141-3p表达水平明显升高,与脓毒症患儿的严重程度相关,miR-101-3p及miR-141-3p联合PCT对儿童脓毒症诊断及预后评估具有较高价值。
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编辑人员丨1周前
