目的:评价miR-188-5p在N2a细胞氧糖剥夺-复糖复氧(OGD/R)损伤中的作用及其与SUMO特异性蛋白酶3(SENP3)的关系。方法:小鼠N2a细胞采用随机数字表法分为5组( n＝23)：对照组(C组)、OGD/R组、NC组、转染miR-188-5p激动剂组(M组)和转染miR-188-5p抑制剂组(I组)。C组细胞常规培养，NC组、M组和I组分别转染试剂miR-188-5p阴性对照miRNA、激动剂及抑制剂后。氧糖剥夺3 h后复糖复氧制备N2a细胞氧糖剥夺-复糖复氧损伤模型，于复糖复氧后24 h时采用CCK-8法检测细胞活力，检测LDH漏出量，采用RT-qPCR法检测miR-188-5p和SENP3 mRNA表达，采用Western blot法检测SENP3表达。采用双荧光素酶实验检测miR-188-5p与SENP3 mRNA的靶向关系。 结果:与C组比较，其余4组细胞活力降低，LDH漏出量增加，SENP3及其mRNA表达上调，OGD/R组和I组miR-188-5p表达下调，M组miR-188-5p表达上调( P<0.05或0.01)；与OGD/R组比较，I组细胞活力降低，LDH漏出量增加，SENP3及其mRNA表达上调，miR-188-5p表达下调，M组细胞活力增加，LDH漏出量下降，SENP3及其mRNA表达下调，miR-188-5p表达上调( P<0.05或0.01)。双荧光素酶实验报告表明：miR-188-5p直接作用于SENP3。 结论:miR-188-5p参与了N2a细胞氧糖剥夺-复糖复氧损伤的过程，与靶向下调SENP3表达有关。

目的 探讨微小RNA(miRNA)在右归丸对激素型肾阳虚证肾组织与正常肾组织中的表达差异,并用生物信息学方法分析其意义,为右归丸干预肾阳虚证的进一步机制研究奠定基础.方法 15只SD大鼠随机分为正常组(5只)和造模组(10只),正常组注射2 mL生理盐水,造模组后肢肌注氢化可的松注射液.成模后将造模组随机分为模型组和右归丸组,每组5只.右归丸组给予右归丸汤剂灌胃,模型组和正常组给予生理盐水灌胃.麻醉处死后使用TRIzol法提取肾组织中RNA,使用NanoDrop ND-1000对总RNA进行质量检测,用标记后的RNA与Agilent Rat 8 ×60k miRNA芯片进行杂交.收集原始数据进行标准化处理,进行聚类分析和火山图分析.利用生物信息学方法,预测差异miRNA富集的基因本体论(GO)功能和京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路.结果 筛选出右归丸干预肾阳虚证相关差异表达miRNA 18 条(|log2FC|≥ 1.5,P≤0.05),其中包括 5 条上调 miRNA,分别是 rno-miR-149-3p、rno-miR-188-5p、rno-miR-221-5p、rno-miR-762、rno-miR-877;13 条下调 miRNA,分别是 rno-miR-101b-5p、rno-miR-125a-3p、rno-miR-125b-2-3p、rno-miR-3085、rno-miR-344a-5p、rno-miR-347、rno-miR-34b-3p、rno-miR-351-3p、rno-miR-3573-3、rno-miR-370-3p、rno-miR-409a-3p、rno-miR-448-3p、rno-miR-503-3p.GO分析显示差异表达miRNA主要参与DNA、RNA转录的正调控进程且与ATP的结合显著相关.KEGG分析显示差异表达miRNA显著富集于cAMP通路和FoxO信号通路,这两条通路与线粒体功能密切相关.结论 右归丸通过干预miRNA的表达,改善肾阳虚证大鼠线粒体功能,调节能量代谢异常,进一步为右归丸干预肾阳虚证的机制研究提供理论依据.

目的 骨髓间充质干细胞(BMSC,Bone marrow mesenchymal stem cells)是来源于骨髓腔并具有多项分化潜能的干细胞.衰老损害了骨髓间充质干细胞的多向分化特性,导致与年龄相关的骨质流失,其关键调控因子仍不清楚.方法 从Gene Expression Omnibus数据库下载mRNA(GSE44403)和microRNA(GSE57127)的表达数据集.R软件鉴定差异表达基因(DEG,Differentially expressed genes)和microRNAs(DEM,Differentially expressed microRNAs).使用 MiRTarbase 预测 DEM 的靶点,并将 DEM 的靶基因与DEG取交集.用David数据库对获得的重叠基因进行功能富集化分析.利用Cytoscape进行PPI网络构建、Hub基因和重要模块的鉴定以及mRNA-miRNA调控网络的可视化.构建体外衰老细胞模型,RT-qPCR验证筛选的关键基因及相关microRNA.结果 在年轻和老年小鼠之间共鉴定出1917个差异mRNA和197差异 microRNA.选择了 miR-690、miR-494-3p、miR-181a、miR-142-5p、miR-188 和 miR-34b 等前 20 个调控异常的DEM作为关键microRNAs.DEG与DEM靶点的重叠基因主要集中在PI3K-Akt信号通路、ErbB信号通路和EGFR信号通路中.在构建的PPI网络中,筛选出TOP10中的Hub基因(包括mTOR、Insr、GSK3b和Ppp2ca)和顶端模块.通过miRNA-mRNA调控网络及RT-qPCR验证结果,确定了 miR-34b-5p-Insr重要调控对.结论 本研究发现衰老小鼠的间充质干细胞中存在miR-34b-5p-Insr重要调控对,可成为调控衰老BMSC细胞功能的潜在靶点.

目的:探讨冠心病患者白细胞miR-223-3p水平与氯吡格雷治疗后血小板反应之间的潜在相关性.方法:收集188名择期经皮冠状动脉介入治疗(percutaneous coronary intervention,PCI)术后接受双重抗血小板治疗的门诊患者的一般资料和血标本,检测二磷酸腺苷(adenosine diphosphate,ADP)诱导的全血血小板聚集率.选取血小板反应有显著差异的患者(超反应组和无反应组),检测其白细胞miR-223-3p水平.结果:除ADP诱导的全血血小板聚集率外,两组患者的一般资料和白细胞miR-223-3p水平差异无统计学意义(P＞0.05).结论:冠心病择期PCI术后门诊患者外周血白细胞miR-223-3p水平与氯吡格雷治疗后的血小板反应无关.

目的 探讨慢病毒介导的微小RNA(miR)-1246表达下调后,对子宫颈癌细胞系SiHa细胞生物学行为的影响,以及对其下游蛋白表达的调控作用.方法 针对人miR-1246的靶序列合成含有反向互补序列的寡核苷酸片段并克隆至慢病毒载体,构建重组慢病毒LV-miR-1246-抑制物(inhibitor).实验分为3组,即抑制组(感染重组慢病毒LV-miR-1246-inhibitor)、阴性对照组(LV-NC组,感染空载体病毒颗粒)和空白对照组(NC组,无干预措施仅加培养基).采用逆转录(RT)-PCR技术检测3组SiHa细胞中miR-1246的表达水平,活细胞计数(CCK-8)法、体外侵袭实验、流式细胞仪分别检测3组SiHa细胞的增殖、侵袭、凋亡情况.建立子宫颈癌裸鼠移植瘤模型,观察miR-1246表达下调对移植瘤生长的影响,蛋白印迹(western blot)法检测3组裸鼠移植瘤组织中血小板反应蛋白2(THBS2)及基质金属蛋白酶(MMP)2、MMP-9蛋白的表达.结果 (1)miR-1246表达:抑制组SiHa细胞中miR-1246表达水平(0.11±0.13)明显低于LV-NC组、NC组(分别为1.14±0.86、1.30±0.73,P<0.01).(2)增殖能力:培养不同时间(分别为24、48、72、96 h)后,抑制组SiHa细胞的A值均明显低于LV-NC组、NC组,分别比较,差异均有统计学意义(P<0.01).(3)侵袭能力:抑制组的穿膜细胞数[(71±4)个]明显少于LV-NC组、NC组[分别为(162±5)、(188±5)个,P<0.01].(4)细胞凋亡率:抑制组SiHa细胞凋亡率[(16.10±3.37)％]明显高于LV-NC组、NC组[分别为(5.67±0.89)％、(1.78±0.08)％,P<0.01].(5)移植瘤体积:抑制组裸鼠移植瘤体积[(287±59)mm3]明显小于LV-NC组、NC组[分别为(571±137)、(657±144)mm3,P<0.01].(6)与LV-NC组、NC组比较,抑制组裸鼠移植瘤组织中THBS2蛋白的表达水平明显升高(P<0.05),而MMP-2、MMP-9蛋白的表达水平明显下降(P<0.01).结论 子宫颈癌SiHa细胞中miR-1246的表达下调后,抑制细胞增殖、促进细胞凋亡、降低细胞侵袭能力;其机制可能是通过上调THBS2蛋白的表达,进一步影响MMP的表达而实现.

目的 探讨新诊断T2DM患者血清miR-126表达水平与非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)的相关性.方法 选取2016年7月至2017年7月于我院内分泌科就诊的188例新诊断T2DM患者,根据肝脏彩色超声结果分为T2DM组(n=92)及T2DM合并NAFLD组(NAFLD,n=96),按照血清miR-126表达水平三分位数将新诊断T2DM患者分成3组,行肝脏彩色超声检查、相关生化指标和血清miR-126表达量的测定.结果 NAFLD组血清miR-126表达量低于T2DM组[(0.43±0.19)vs(0.78±0.31),P<0.01];Person相关分析提示,血清miR-126表达量与胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)(r=-0.664,P<0.01)和高敏C反应蛋白(hsC-RP)(r=-0.273,P=0.023)呈负相关.Logistic回归分析结果显示,校正BMI、WC、血脂、hsC-RP后,血清miR-126表达量是NAFLD的保护因素(OR=0.158,95％CI 0.032～0.838,P=0.036).但校正HOMA-IR后,血清miR-126表达量与NAFLD无相关性(P>0.05).随着血清miR-126表达水平的升高,NAFLD患病率逐渐下降(86.95％vs 52.17％vs 17.39％,P<0.01).结论 新诊断T2DM患者血清miR-126表达水平与NAFLD密切相关,IR可能参与了这一过程.

Keloids (KDs) and hypertrophic scars (HSs),two forms of pathological scars,seriously affect the physical and psychological health of patients.Despite many similarities with HSs,KDs are characterized by invasion and a high rate of recurrence after surgery,features they share in common with tumors.The underlying molecular mechanisms of this phenomenon have not been fully elucidated.In this study,we used microRNA (miRNA) array analysis to search for invasion-associated miRNAs in KDs.The expression of miR-188-5p in KDs,HSs,normal skin (NS) tissues,and cell lines was measured by quantitative real-time polymerase chain reaction.Furthermore,cell proliferation,migration,and invasion were detected in KD fibroblasts (KFs) and HS fibroblasts (HSFs),and interrelated proteins were ascertained by western blot analysis.It was found that miR-188-5p was significantly decreased in KD tissue compared with HS and NS tissues.Upregulated expression of miR-188-5p suppressed KF proliferation,migration,and invasion;and decreased expression of miR-188-5p also promoted HSF proliferation,migration,and invasion.The protein levels of MMP-2,MMP-9,PI3K,and p-Akt in miR-188-5p mimic-transfected KFs were repressed.In contrast,after transfection with miR-188-5p inhibitor,the protein levels of MMP-2,MMP-9,PI3K,and p-Akt were higher than the control in HSFs.Treatment with PI3K/Akt inhibitor LY294002 in KFs with miR-188-5p inhibitor did not further reduce their proliferation,migration,and invasion.The upregulation of MMP-2 and MMP-9 by miR-188-5p inhibitor could be abolished by LY294002.These findings together demonstrate a tumor-suppressive role of miR-188-5p in KD proliferation and invasion via PI3K/Akt/MMP-2/9 signaling,indicating that miR-188-5p may be a potential prognostic marker and therapeutic target for KDs.

目的 探讨miR-1187靶向调控Rho鸟苷交换因子-9 (Arhgef9)在七氟醚致小鼠海马神经元凋亡中的调控作用.方法 通过基因芯片技术测定小鼠海马miRNA.利用miR Walk数据库对差异miRNA的靶基因进行预测.为验证预测结果与实际情况是否相符,同步进行mRNA水平的表达谱芯片实验,筛选出与差异miRNA确有互作关系的mRNA.为说明miRNA与mRNA的互作关系,进一步利用David数据库对靶基因进行注释,最终形成miRNA与mRNA共表达网络.采用RT-PCR法检测海马神经元miR-1187 mRNA相对表达量,细胞计数试剂盒(CCK-8)法检测miR-1187转染后海马神经元存活率,荧光素酶实验检测Arhgef9是否为miR-1187的靶基因.结果 海马神经元凋亡主要与9个miRNA相关,即miR-101b-3p、miR-1187、miR-188-5p、miR-219a-5p、miR-338-3p、miR-425-5p、miR-467a-3p、miR-705、miR-92a-3p.miR-1187在七氟醚诱导海马神经元损伤模型中的相对表达量明显降低(P＜0.05),miR-1187高表达质粒(miR-1187 mimics)转染后,海马神经元存活率明显升高(P＜0.05).miR-1187与Arhgef9存在靶向关系,miR-1187通过与Arhgef9基因mRNA的3'非翻译区互补配对来发挥作用.结论 miR-1187是海马神经元抗细胞凋亡的抑制因子;高表达miR-1187通过靶向调节Arhgef9 mRNA表达来抑制海马神经元凋亡的发生.

目的 探讨舌鳞癌细胞线粒体微小RNA(mitochondrial microRNAs,mitomiRs)的表达,筛选出与化疗耐药相关的mitomiRs.方法 提取舌鳞癌细胞系CAL-27及其顺铂耐药细胞株CAL-27-re的线粒体、细胞质、总细胞RNA,采用高通量miRNA芯片筛选出耐药和亲本细胞中差异表达的mitomiRs,应用qRT-PCR验证在CAL-27和CAL-27-re中表达上调的mitomiRs,并在化疗耐药及敏感的舌鳞癌患者样本中验证表达上调的mit-omiRs.结果 芯片结果显示,在CAL-27和CAL-27-re的线粒体、细胞质和总细胞RNA共6个组分中共检测到263个miRNA,其中共有57个mitomiRs和134个细胞质微小RNA(cytoplasmic microRNAs,cytomiRs);与总miR-NA相比,CAL-27-re细胞中有35个mitomiRs表达上调,CAL-27细胞中有31个mitomiRs表达上调(≥1.5倍).进一步比较分析亲本和耐药细胞中差异表达的mitomiRs,在CAL-27-re细胞中有miR-2392、miR-4462、miR-1290、miR-4449、miR-1268a、miR-1246、miR-371a-5p、miR-3934-5p、miR-4271、miR-513p、miR-664b-3p共11个mi-tomiRs表达上调;而5个表达下调的mitomiRs则分别是miR-188-5p、miR-1973、miR-3653、miR-4499、miR-5787;其他41个mitomiRs在两种细胞株中的表达水平几乎相同.qRT-PCR与miRNAs芯片结果相符合,并且在CAL-27和CAL-27-re中得到验证的11个表达上调的mitomiRs中,有miR-1268a、miR-2392、miR-4462、miR-1290、miR-4449共5个mitomiRs在化疗耐药舌鳞癌临床样本中也同样表达上调.结论 顺铂化疗耐药和敏感的舌鳞癌细胞中存在差异表达的mitomiRs,特异高表达的mitomiRs:miR-1268a、miR-2392、miR-4462、miR-1290、miR-4449可能在舌鳞癌化疗耐药中具有重要作用.

目的:探讨卵巢子宫内膜异位症(ovarian endometriosis,OEM)外泌体微小RNA(microRNA,miRNA)的表达谱.方法:采用芯片技术对3例OEM患者及3例健康对照者的在位内膜间质细胞外泌体miRNA进行分析,筛选出组间差异miRNA.结果:获得存在差异表达miRNA共12条,其中hsa-miR-6829-5p、hsa-miR-5188、hsa-miR-4430、hsa-miR-584-5p、hsa-miR-4485-5p、hsa-miR-4257在实验组表达上调,hsa-miR-188-5p、hsa-miR-4741、hsa-miR-4516、hsa-miR-1229-5p、hsa-miR-7150、hsa-miR-5787表达下调.对表达差异较大的外泌体miRNA进行靶基因预测及其基因功能(gene ontology,GO)分析和信号通路(pathway)分析,发现靶基因聚集的生物学功能多数参与生物进展过程的调控.结论:OEM患者与健康对照者的在位内膜间质细胞外泌体miRNA存在着差异性表达.差异性表达的miRNA特异性很高,对进一步阐明该疾病的发病机制和寻找新的诊断标记物具有重要意义.