目的:构建胃癌相关竞争内源性RNA(ceRNA)网络，探索胃癌发生、发展的分子机制。方法:应用生物芯片技术测定胃癌及对应癌旁组织的信使RNA(mRNA)、微小RNA(miRNA)和长链非编码RNA(lncRNA)表达谱，应用R软件中的edgeR包筛选差异表达基因并绘制火山图，基于miRNA－lncRNA在线预测工具lncBase数据库和miRNA靶基因预测数据库预测mRNA、miRNA和lncRNA的相互作用关系，采用Cytoscape软件构建胃癌lncRNA－miRNA－mRNA ceRNA网络，根据cytohubba计算各节点degree得分筛选关键基因(hub基因)。运用注释、可视化和集成发现数据库(DAVID)，对差异表达的mRNA进行基因本体论(GO)功能富集和京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析。在OncoLnc数据库中，选择肿瘤基因组计划(TCGA)数据集的胃癌项目，输入hub基因，以标准化后基因表达量中位数为界值，将样本分为高表达组和低表达组，并进行生存分析。结果:共筛出差异表达的mRNA 766个，miRNA 10个，lncRNA 110个，其中90个mRNA、6个miRNA和4个lncRNA构成ceRNA网络，20个hub基因中有2个与患者预后有关。经TCGA胃癌数据库验证，LncRNA MAP3K20的反义RNA 1(MLK7－AS1)、分泌性磷酸化糖蛋白(SPP1)、硫酸酯酶1(SULF1)hsa－miR－1307－3p等基因在胃癌组织生物芯片中高表达，金属硫蛋白2A(MT2A)、金属硫蛋白1X(MT1X)等基因低表达，与TCGA胃癌数据库一致。生物学功能和通路分析显示，差异表达的mRNA主要在生物学过程(BP)和矿物吸收的通路中显著富集。在TCGA胃癌数据中，碳水化合物磺基转移酶1(CHST1)和miR－183－5p均与患者生存时间有关，CHST1表达量越高患者生存时间越短，而miR－183－5p表达量越高患者生存时间越长。结论:胃癌ceRNA网络的构建有助于深入了解胃癌的分子生物学机制，CHST1和mi－183－5p可作为胃癌预后的预测指标。

目的 探讨微小核糖核酸miR-766在不同葡萄糖浓度培养的心肌细胞中的表达水平,明确其对心肌细胞凋亡的影响及相关分子机制.方法 在不同葡萄糖浓度条件下(正常糖5 mmol/L、高糖15、25及35 mmol/L)培养的心肌细胞中,采用实时荧光定量聚合酶链式反应(PCR)检测miR-766的表达差异,以流式细胞术检测各组心肌细胞凋亡情况,Western blot法检测各组环腺苷酸活化交换蛋白1(Epac-1)、Bax蛋白、半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶-3(caspase-3)活化片段蛋白表达水平.采用生物信息学预测miR-766的靶基因,并进一步采用双荧光素酶报告基因法进行验证.组间数据比较采用t检验.结果 与5 mmol/L相比,miR-766在15、25及35 mmol/L组的心肌细胞中表达上调(3.40±0.38,4.61±0.34,6.17±0.42比0.97±0.04,t=11.131～21.493,P<0.05),而转染miR-766抑制剂后,细胞的凋亡率明显降低[(16.43±0.31)％比(26.45±0.31)％,t=-39.566,P<0.05];Western blot结果表明,在人心肌细胞中miR-766高表达者Epac-1的蛋白表达减少(0.48±0.07比1.00±0.12,t=-6.695,P<0.05),而抑制miR-766的表达后Epac-1的表达增加(1.23±0.12比0.70±0.10,t=5.884,P<0.05);荧光素酶报告基因结果表明,miR-766模拟物或抑制剂与Epac-1基因3'-非翻译区野生型报告基因共转染时,报告基因荧光素酶活性明显变化(3.22±0.07比5.01±0.96,6.98±0.61比5.01±0.96,t=-3.239～-3.008,P<0.05);在高糖培养条件下抑制miR-766表达能够部分拮抗高糖对Epac-1蛋白表达的抑制作用(0.80±0.05比0.53±0.05,t=6.810,P<0.05);在miR-766模拟物处理的H9c2细胞中回补Epac-1,caspase-3活化片段蛋白的表达则明显降低(0.67±0.07比1.07±0.12,t=-5.050,P<0.05).结论 在高糖培养的心肌细胞中高表达的miR-766通过靶向调控Epac-1基因的表达,进而促进细胞的凋亡.

目的:探究miR-766-3p是否可通过调节靶基因SIRT6影响肝细胞癌(HCC)的发生与发展进程.方法:RT-PCR及Western blot检测miR-766-3p及SIRT6在HCC组织及癌旁组织中的表达;CCK-8、流式凋亡检测技术、划痕实验及Transwel小室检测miR-766-3p/SIRT6对HCC细胞生长、凋亡、转移及侵袭能力的影响;荧光报告基因实验及western blot技术检测miR-766-3p对SIRT6表达的影响.结果:miR-766-3p在HCC组织中低表达,而SIRT6高表达.过表达miR-766-3p通过与SIRT6的3'UTR区结合降低SIRT6的表达.上调miR-766-3p明显抑制HepG2细胞增殖、转移及侵袭能力,促进细胞凋亡;但SIRT6过表达后终止miR-766-3p的以上作用.结论:miR-766-3p通过靶向负调控SIRT6的表达抑制HCC进展.

目的 本研究旨在探讨miR-155、miR-1238-3p、miR-202-3p、miR-630和miR-766-3p在白癜风患者外周血中的表达改变与病程发展的关系.方法 本次研究选取2018年1月-2019年1月来我院治疗和检查的62例白癜风患者,平均年龄(23.25±2.11)岁,男30例(48.39％),女32例(51.61％),其中白癜风稳定期患者44例(71.77％),白癜风进展期患者18例(28.23％).选取与白癜风组性别、年龄和体质量指数匹配的健康者作为对照组;通过实时荧光定量PCR(RT-qPCR)和蛋白质免疫印迹(Western blot)检测受试者外周血中miR-155、miR-1238-3p、miR-202-3p、miR-630和miR-766-3p的表达量;通过酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测肿瘤坏死因子(TNF)-α、干扰素(IFN)-γ、IFN-α和白细胞介素(IL)-1β蛋白水平含量;通过活性氧检测试剂盒和流式细胞仪检测受试者白癜风患者细胞内活性氧含量.结果 随着白癜风病程发展,miR-155 mRNA和蛋白表达量逐渐增加,miR-1238-3p、miR-202-3p、miR-630和miR-766-3p mRNA和蛋白表达量逐渐降低(P＜0.05).白癜风进展期miR-155 mRNA和蛋白表达量高于白癜风稳定期,miR-1238-3p、miR-202-3p、miR-630和miR-766-3p mRNA和蛋白表达量低于白癜风稳定期(P＜0.05);相较于健康对照组,白癜风稳定期和白癜风进展期均能使TNF-o、IFN-γ、IFN-c和IL-1β含量增加,白癜风进展期TNF-α、IFN-γ、 IFN-α和IL-1β含量高于白癜风稳定期;相较于健康对照组(2.36±0.15),白癜风稳定期(3.85±0.47)和白癜风进展期(8.18±0.56)活性氧含量均增加,且进展期高于稳定期(P＜0.05).结论 随着白癜风病程发展,外周血中miR-155表达量逐渐增加,miR-1238-3p、miR-202-3p、miR-630和miR-766-3p表达量逐渐降低.

目的 分析MicroRNA-766-3p靶向调控Epac-1影响H9C2心肌细胞凋亡的机制研究.方法 采用miR-766 NC、miR-766 mimics、miR-766 NC inhibitor、miR-766 inhibitor转染心肌细胞H9C2;采用RT-PCR法检测不同组别H9C2中miR-766表达水平;采用流式细胞凋亡实验检测miR-766在Epac-1中的凋亡作用;采用蛋白质印迹法(Western Blot)检测不同组别H9C2中Epac-1及相关凋亡蛋白水平;采用双荧光素酶报告基因检测miR-766靶基因.结果 与miR-766 NC组细胞相比,miR-766 mimics组细胞中miR-766明显高表达(P<0.001),其心肌细胞凋亡率均明显增加(P<0.05),细胞中Epac-1 mRNA及蛋白呈低表达(P<0.05),Bcl-2、Caspase-3等凋亡相关蛋白则呈高表达(P<0.05);与miR-766 NC inhibitor组细胞相比,miR-766 inhibitor组细胞中miR-766呈低表达(P<0.001),其心肌细胞凋亡率降低(P<0.05),Epac-1 mRNA及蛋白呈高表达(P<0.05),Bcl-2、Caspase-3等凋亡相关蛋白则呈低表达(P<0.05).生物信息学网站预测及双荧光素酶报告基因实验结果显示,miR-766与Epac-13'UTR存在结合位点.结论 心肌细胞中MicroRNA-766-3p可通过靶向抑制Epac-1表达促进调控心肌细胞凋亡.

为了筛选大白猪GABRR2基因的SNP和对GABRR2基因进行结构、功能的预测和分析,本研究利用30头大白猪混池为模板,通过PCR扩增GABRR2基因外显子,测序后进行SNP筛选,并对测序结果进行拼接,利用多种生物信息学软件对大白猪GABRR2基因启动子区、编码区、3'UTR区进行了一系列的分析.结果显示,大白猪GABRR2基因在c615、c660、c798和c1134共有4个同义突变;RNGTT、SRSF12和ANKRD63个基因在GABRR2基因连锁区间内,且编码的蛋白具有相互作用;起始密码子上游2 000bp区域在385～435号碱基和759～806号碱基区域有2个核心启动子区域,在核心启动子386～395、769～778有Sp1转录因子结合位点,757～766有CREB-2转录因子结合位点,775～784有NF-1转录因子结合位点,在1 593～1 752号碱基区间内有一个 CpG 岛;3'UTR 区域有 14个 miRNA 结合位点,其中 miR-365-3p、miR-497-5p、miR-5195-3p 和miR-145-5p评分高于80.研究结果表明,大白猪GABRR2基因CDS区全长1 380 bp,存在4个同义突变,保守性高;编码一个具有4个跨膜结构、1个信号肽的亲水性蛋白,与RNGTT基因功能可能有密切联系;2个核心启动子区域内含有Sp1、CREB-2和NF-1三种共4个转录因子结合位点,且启动子区有一个特征的CpG岛;3'UTR 区域存在 miR-365-3p、miR-497-5p、miR-5195-3p 和 miR-145-5p 共4个 miRNA 结合区域.

目的:分析先天性脊柱侧凸(CS)患者和健康人骨髓间充质干细胞中的差异microRNAs(miRNAs)表达谱.方法:获取CS患者(椎体形成障碍亚组、椎体分节障碍亚组)及健康对照组的骨髓,分离培养、鉴定骨髓间充质干细胞,提取总RNA后标记miRNAs,使用微阵列芯片技术检测三组受试者骨髓间充质干细胞中的miRNAs表达谱,并对差异miRNAs进行生物信息学分析,通过qRT-PCR技术对获得的差异miRNAs进行验证.结果:在椎体形成障碍亚组和健康对照组之间鉴定出29个差异表达miRNAs,在椎体分节障碍亚组和健康对照组之间鉴定出27个差异表达miRNAs.两组差异表达miRNAs的交集共有10个.生物信息学分析结果显示,细胞内信号转导、高尔基体部分和蛋白质丝氨酸/苏氨酸激酶激活物活性分别是生物过程、细胞定位和分子功能中最显著的富集项,黏蛋白型O-聚糖的生物合成是所涉及的最重要的信号通路.qRT-PCR成功验证了其中2个差异表达的miRNAs:miR-412-3p和miR-766-5p.结论:本研究成功构建了CS患者与健康人骨髓间充质干细胞中的差异miRNAs表达谱.这些差异表达的miRNAs可能对阐述CS的发病机制具有重要意义,并有助于建立早期诊断生物标志物.

MiR-766-3p可以调控细胞凋亡,但其在动脉粥样硬化中对巨噬细胞的凋亡机制尚不清楚.本研究构建了高脂喂养的ApoE敲除小鼠动脉粥样硬化模型,采用定量PCR检测了动脉粥样硬化组织中miR-766-3p的表达水平.结果发现,miR-766-3p在小鼠动脉粥样硬化组织中表达上调.生物信息学预测发现,Mipu1可能为miR-766-3p调控的潜在靶基因.采用荧光素酶报告基因分析验证了miR-766-3p对Mipu1的调控作用.采用定量PCR和Western blot检测miR-766-3p对Mipu1表达的调控作用,采用流式细胞仪和Western blot检测miR-766-3p调控Mipu1对RAW264.7细胞凋亡的影响.结果发现,miR-766-3p可促进RAW264.7细胞凋亡,其机制可能与其下调Mipu1表达有关.本文初步探索了 miR-766-3p对巨噬细胞的凋亡调控在动脉粥样硬化发病中的作用机制,为进一步防治动脉粥样硬化提供了新思路.

目的:探讨lincRNA AC099850.3在非肌层浸润性尿路上皮癌(NMIBC)中的表达和调控.方法:生物信息学筛选癌症基因组图谱(TCGA)数据库中差异性lncRNA.收集24例NMIBC手术中的正常组织和癌组织,体外培养人膀胱癌细胞系T24细胞,采用lincRNA AC099850.3的siRNA转染T24细胞,RT-qPCR测定基因表达情况.结果:生物信息学分析表达差异后得到156个上调lncRNA和69个下调lncRNA,其中61.78％为lincRNA,26.67％为反义lncRNA,11.56％为其他lncRNA.lincRNA AC099850.3上调最为显著,lincRNA AC099850.3高表达与不良预后显著相关(P=0.006).与正常组织相比,癌组织中lincRNA AC099850.3表达明显升高(P<0.0001).与lincRNA AC099850.3连接密切的2个miRNAs为miR-101-3p和miR-766-3p.功能富集分析显示,调控模块中的mRNA(FZD3、FZD6、COL4A1、LEF1和TCF7)可能对NMIBC的细胞周期至关重要.相对于正常组织,癌组织中miR-101-3p低表达,FZD3、FZD6、COL4A1和LEF1均高表达(P<0.05),lincRNA AC099850.3和miR-101-3p表达呈负相关(r=-0.662,P=0.001).T24细胞转染siRNA干扰lincRNA AC099850.3后,相对于对照组和空载体组,T24细胞中lincRNA AC099850.3表达降低(P=0.002),miR-101-3p表达升高(P<0.0001),COL4A1表达降低(P=0.021).结论:在NMIBC中,lincRNA AC099850.3高表达,可能是通过负性调控miR-101-3p促进肿瘤发展.

目的 探讨姜黄素干预肾上腺皮质癌SW-13细胞的miRNA调控机制.方法 将肾上腺皮质癌SW-13细胞分为对照组和姜黄素干预组,分别加入基础培养基2 mL、50μmol/L姜黄素溶液2 mL,干预24 h后提取总RNA用于小RNA文库构建和测序.将获得的序列进行miRNA注释和新miRNA预测后,筛选差异性表达的miRNA;对差异性表达的miRNA进行靶基因预测,对靶基因进行功能和通路富集分析.使用实时荧光定量PCR鉴定部分差异性表达miRNA的表达量.结果 共筛选出44个差异性表达的miRNA,包括21个表达上调的miRNA和23个表达下调的miRNA,其中预测有靶基因且有功能的miRNA共9个.功能富集分析结果显示,靶基因主要富集在细胞增殖、细胞迁移、细胞分化和凋亡等生物学过程;通路富集分析结果显示,靶基因主要富集在癌症途径、丝裂原活化蛋白激酶信号通路、内质网应激信号通路、细胞周期和凋亡途径等.实时荧光定量PCR结果提示,miR-184、miR-490-3p、miR-766-3p、miR-200b-3p、miR-200c-3p和miR-3622a-5p的表达量与小RNA测序数据结果基本一致.结论 姜黄素可能通过miR-184、miR-490-3p、miR-766-3p、miR-200c-3p、miR-3622 a-5 p等miRNA参与调控癌症途径、丝裂原活化蛋白激酶信号通路、内质网应激信号通路、细胞周期和凋亡途径等信号通路,以抑制细胞增殖、迁移、分化和凋亡,从而发挥抗肾上腺皮质癌的作用.