目的:探讨长链非编码RNA（lncRNA）DHRS4-AS1与骨肉瘤患者无病生存的关系及其体外对骨肉瘤细胞增殖和迁移影响的机制。方法:收集GEPIA数据库建库以来骨肉瘤患者DHRS4-AS1转录组水平和生存情况数据，依据DHRS4-AS1转录组中位水平将患者分为DHRS4-AS1高表达组和低表达组，各59例，采用Kaplan-Meier法分析两组无病生存情况。采用实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测DHRS4-AS1在骨肉瘤细胞株MG-63、HOS、143B、U-2OS、Saos2及正常成骨细胞株hFOB1.19中的表达，选择DHRS4-AS1表达水平最低的骨肉瘤细胞株进行后续实验。将载有DHRS4-AS1序列的质粒和载有阴性对照序列的质粒分别转染至选取的骨肉瘤细胞中，分别为DHRS4-AS1组和对照组。CCK-8法检测各组细胞增殖情况，以吸光度值为细胞增殖能力；细胞划痕实验检测各组细胞迁移情况。采用生物信息学网站starBase V2.0预测DHRS4-AS1的靶基因，双荧光素酶报告基因法验证DHRS4-AS1与靶基因的靶向关系。采用qRT-PCR和蛋白质印迹法检测对照组和DHRS4-AS1组骨肉瘤细胞靶基因及下游基因表达水平。结果:生存分析显示，GEPIA数据库中DHRS4-AS1高表达组骨肉瘤患者无病生存优于DHRS4-AS1低表达组（ P<0.001）。与正常成骨细胞hFOB1.19细胞相比，各骨肉瘤细胞中DHRS4-AS1的表达水平均低（均 P<0.01），其中U-2OS细胞中DHRS4-AS1的表达水平最低（ P<0.001）。DHRS4-AS1组U-2OS细胞培养1、2、3、4 d后细胞增殖能力均较对照组降低（均 P<0.05）。DHRS4-AS1组U-2OS细胞迁移率低于对照组[（31±6）%比（63±4）%， t=4.38， P=0.005]。starBase V2.0网站预测DHRS4-AS1与miRNA-411-3p（miR-411-3p）互补结合；双荧光素酶报告基因实验显示，miR-411-3p过表达降低了野生型DHRS4-AS1报告基因的荧光素酶活性（ P<0.001），但对突变型DHRS4-AS1报告基因荧光素酶活性无影响（ P>0.05）。qRT-PCR检测显示，与对照组相比，DHRS4-AS1组U-2OS细胞miR-411-3p相对表达量低（0.22±0.06比1.06±0.23， t=3.55， P=0.012），转移抑制因子MTSS1 mRNA相对表达量高（5.58±1.03比1.06±0.22， t=4.28， P=0.005）；蛋白质印迹法检测显示，MTSS1表达升高，细胞增殖表型蛋白CDK3、cyclin C和细胞迁移表型蛋白ZEB2、KLF8表达水平均低。 结论:lncRNA DHRS4-AS1高表达骨肉瘤患者无病生存较好，其在骨肉瘤细胞株中低表达。DHRS4-AS1可能通过靶向下调骨肉瘤细胞miR-411-3p的表达，促进MTSS1基因表达，抑制细胞增殖和迁移。

目的:研究miR-155的表达与FLT3-ITD+急性髓系白血病细胞系药物敏感性的关系及潜在的调控机制.方法:通过CRISPR/Cas9基因编辑工具在FLT3-ITD+AML细胞系MV411中实现miR-155编码基因敲除,筛选单克隆细胞,PCR及Sanger测序鉴定单克隆细胞的基因型,实时荧光定量逆转录PCR鉴定成熟miRNA的表达水平.MTT法计算半数抑制率,比较MV411细胞对多柔比星、奎扎替尼以及米哚妥林的药物敏感性.转录组测序分析miR-155敲除后MV411细胞mRNA水平的变化,基因集富集分析获得miR-155敲除后的信号通路的变化水平,Western blot验证信号通路关键分子的表达.结果:通过PCR初筛和Sanger测序获得了4个基因敲除的杂合子和1个基因插入的杂合子.实时荧光定量逆转录PCR结果显示,这些单克隆细胞中成熟miR-155的表达显著低于野生型克隆.MTT结果显示,与野生型相比,miR-155基因敲除后MV411细胞对多种抗FLT3-ITD+AML的药物敏感性有了显著增加.RNA测序显示miR-155敲除后mTOR信号通路和Wnt信号通路受到抑制.Western blot结果显示,信号通路关键分子p-mTOR、Wnt5α、β-catenin的表达下调.结论:miR-155敲除后能显著提升MV411细胞对多柔比星、奎扎替尼和米哚妥林的药物敏感性,这与包括mTOR及Wnt信号通路在内的多条信号通路的抑制有关.

目的 探讨绝经后骨质疏松症(postmenopausal osteoporosis ,PMOP)肾阴虚证miRNA的表达谱特征,及对差异表达的miRNA进行生物信息学分析.方法 随机选择绝经后骨质疏松症受试者,中医辨证,分为3组:PMOP肾阴虚组3例,PMOP肾阳虚组3例,健康绝经后妇女3例作为对照组.采用人miRNA芯片检测外周血单个核细胞miRNA的表达水平.肾阴虚证组分别与其他两组比较,筛选共同的差异表达基因,实时荧光定量PCR验证芯片结果,并对差异表达的miRNA进行pathway分析及靶基因预测.结果 肾阴虚证组与对照组、肾阳虚证组两组比较,筛选出20条共同差异表达miRNA;实时定量PCR验证hsa-miR-411-5p、hsa-miR-143-3p、 hsa-miR-95-3p表达的结果与芯片结果相符;pathway分析结果显示,这些差异miRNA主要参与代谢通路、癌症通路、Rap1信号通路、粘着斑信号通路、PI3K-Akt、MAPK信号通路、钙离子信号通路、内质网蛋白加工、cGMP-PKG信号通路、Ras信号通路、Wnt信号通路的调控;结合多个数据库对差异表达的miRNA进行靶基因预测,最终筛选出9个靶基因(RC3H1、SOX11、FUT4、GABRA4、NUFIP2、ONECUT2、PHF20、PURB、ZNF148).结论 建立了PMOP肾阴虚证的miRNA基因表达谱,且这20个差异表达的miRNA可能通过调控PI3K-Akt、MAPK、Wnt等与骨代谢相关信号通路参与PMOP肾阴虚证的发生发展过程.

目的 检测肝癌患者血清中miRNA的表达水平.方法 提取肝癌患者血清中的miRNA进行芯片杂交测序,并用qRT-PCR的方法比较确定患者miRNA与健康对照的表达水平变化,检测手术前手术后肝癌患者血清中相关miRNA的表达水平变化.结果 与健康对照组相比,肝癌患者血清中hsa-miR-206、hsa-miR-20a-3p、hsa-miR-411-5p、hsa-miR-122和has-miR-423水平明显升高,术后hsa-miR-206、hsa-miR-411-5p、hsa-miR-122和has-miR-423水平显著降低;hsa-miR-26a-5p、hsa-miR-455-5p、hsa-miR-30e-3p、hsa-let-7f-5p和hsa-miR-6852水平显著降低,术后hsa-miR-26a-5p和hsa-miR-455-5p水平显著回升.结论 血清miRNA可作为肝癌诊断的依据,并能反映疾病发展过程.

羊驼是重要的毛用型经济动物,具有22种天然色.毛色由皮肤中黑色素细胞产生的黑色素颗粒的分布和转运所决定的.然而,羊驼色素形成或毛色形成的分子机制复杂,由多个基因、miRNA和lncRNA调控.但是,miR-411a-3p对羊驼色素形成起调控作用未见报道.为研究miR-411a-3p在黑色素产生过程中的调控作用,本文将构建的miR-411a-3p载体转染到羊驼黑色素细胞中,并对毛色基因的表达进行研究.经生物信息学预测,钙/钙调素依赖蛋白激酶4(calcium-calmodulin dependent protein kinase 4,CaMK4)可能是miR-411a-3p的靶基因之一.双荧光素酶报告基因结果显示,与对照组相比,双荧光报告酶活性下降(34.78±16.09)％(P＜0.01),其下降趋势明显,说明CaMK4可能是miR-411a-3p的靶基因之一.miR-411a-3p通过结合CaMK4的3'untranslated region (3'-UTR)直接调控CaMK4的表达.在羊驼黑色素细胞中转染miR-411a-3p后,CaMK4、CDK5和TYRP1在转录水平的表达量与NC组相比具有显著下降趋势,其中TYRP1下降趋势尤为显著(53.66±2.11)％(P＜0.01).Western印迹检测CaMK4、CDK5、TYRP1、p-CREB在蛋白质水平的表达与NC组相比下降趋势明显,尤其是CDK5和p-CREB基因下降极为显著,分别为(70.26±4.84)％(P＜0.01)和(70.11±9.05)％(P＜0.01).Masson-Fontana法检测黑色素颗粒,结果显示,miR-411 a-3p抑制黑色素细胞产生黑色素颗粒.通过紫外分光度法检测真黑素(eumelanin,EM)和褐黑素(phenomelanin,PM)显示,EM和PM的含量均被下调.结果 表明,miR-411 a-3p靶向抑制CaMK4表达,从而改变CREB的表达以控制黑色素的产生,此研究结果对哺乳动物毛色形成机制有重要意义.

黑色素细胞中产生的黑色素转移及黑色素细胞的增殖和迁移均与色素沉积有关.黑色素细胞的增殖需要有丝分裂原协同进行.黑色素细胞的增殖和分化受组织环境以及多种毛色基因的调控.miRNA-411 a-3p在不同毛色羊驼皮肤中呈差异表达,且通过靶向IGF1R调控黑色素生成.但miRNA-411a-3p是否与黑色素颗粒迁移、黑色素细胞的增殖和迁移相关未见报道.本研究通过miRNA-411a-3p转染羊驼黑色素细胞后发现,与对照组相比,钙离子信号转导水平下降了(91.73±1.53)％(P＜0.01),与黑色素转移有关的Rab27a和肌球蛋白Ⅴa在蛋白质水平的表达均被下调,同时与细胞增殖有关的整联蛋白β1和β5相关基因在转录水平分别下降了(44.67±13.67)％(P＜0.01)和(30.72±6.23)％(P＜0.01),在蛋白质水平表达下降了(45.18±1.96)％ (P＜0.001)和(11.52±1.09)％ (P＜0.001).综上所述,miRNA-411a-3p过表达后会抑制钙离子信号转导,以及羊驼黑色素细胞的增殖和迁移.

目的:研究Hsa-miR-411-3P对胃癌细胞功能作用及分子机制.方法:MTT检测Hsa-miR-411-3P对胃癌细胞SGC-7901、AGS增殖的影响;流式细胞术检测Hsa-miR-411-3P对胃癌细胞SGC-7901、AGS周期和凋亡的影响;RNAhybrid2.1.2、Miranda3.3a、TargetScan7.0预测Hsa-miR-411-3P靶基因,与mRNA测序结果联合分析,取交集基因认为是比较可靠的靶基因,进行GO、KEGG分析;Real-time PCR检测Hsa-miR-411-3P靶基因VAV3、ROCK2、PLD1、PTCH1的表达.结果:过表达Hsa-miR-411-3P抑制SGC-7901、AGS细胞增殖,促进凋亡,使SGC-7901细胞周期阻滞在S期,AGS细胞周期阻滞在G1期;软件预测和测序结果联合分析获得235个交集靶基因;Hsa-miR-411-3P靶基因分子功能集中在酶结合、蛋白质结合、转移酶活性等;生物学过程集中在代谢过程、细胞组件组装、解剖结构发展、细胞成分生物发生等(P＜0.05);KEGG信号通路集中在胰岛素信号通路、cAMP信号通路、AMPK信号通路、FOXO信号通路等(P＜0.05);VAV3、ROCK2、PLD1、PTCH1共同参与cAMP信号通路;过表达Hsa-miR-411-3P的SGC-7901、AGS细胞中,VAV3、ROCK2 mRNA表达量均减少,PLD1 mRNA表达量在SGC-7901细胞中增加,在AGS细胞中减少;PTCH1 mRNA表达量在SGC-7901细胞中减少,在AGS细胞中增加.结论:过表达Hsa-miR-411-3P将下调靶基因VAV3、ROCK2的表达,从而影响cAMP信号通路,抑制SGC-7901、AGS细胞增殖,促进凋亡,使SGC-7901细胞周期阻滞在S期,AGS细胞周期阻滞在G1期.

目的 通过DNA甲基转移酶抑制剂5-氮杂-2'-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)与siRNA干扰改变乳腺癌细胞MCF-7中DNA甲基化水平,探讨DNA甲基转移酶3b(Dnmt3b)表达对乳腺癌细胞相关mRNA、微小RNA(miRNA)的影响.方法 通过5-Aza-CdR抑制乳腺癌细胞整体甲基化水平,免疫荧光染色检测其抑制效果,高通量测序检测乳腺癌细胞miRNA的表达,荧光定量PCR(qRT-PCR)检测乳腺癌细胞miRNA及乳腺癌相关基因的表达;通过siRNA干扰抑制乳腺癌细胞中Dnmt3b的表达,qRT-PCR和Western blotting检测siRNA干扰效率,细胞生长曲线反映细胞生长情况.结果 5-Aza-CdR降低细胞整体甲基化水平,siRNA干扰后Dnmt3b的表达下降,细胞生长显著抑制;高通量测序显示5-Aza-CdR作用后67个miRNA表达有统计学差异(均P<0.05);qRT-PCR结果显示5-Aza-CdR作用后乳腺癌细胞中miR-200a、miR-411、miR-382、miR-409、miR-493、miR-127、miR-520a、miR-654表达显著上调(P<0.05);siRNA干扰Dnmt3b后乳腺癌细胞中miR-29b、miR-506、miR-200a、miR-203b、miR-409、miR-520a、miR-654的表达显著上调(P<0.05),而miR-200b、miR-127的表达显著下调(均P<0.05);5-Aza-CdR作用后乳腺癌细胞WWOX、MMP7的表达下调,TCF21、TIMP1的表达上调(均P<0.05);siRNA干扰Dnmt3b后乳腺癌细胞抑癌基因BRCA1、BRCA2及癌基因MMP7、survivin的表达均下调(均P<0.05).结论 Dnmt3b可影响乳腺癌细胞相关基因WWOX、TCF21、BRCA1、BRCA2、MMP7、TIMP1、PKM2、survivin及miR-29b、miR-506、miR-200a、miR-200b、miR-203b、miR-409、miR-127、miR-520a、miR-654的表达.

目的 筛选衰老性骨质疏松症小鼠胫骨组织中差异表达的miRNA,并进行生物信息学分析.方法 雄性BALB/c小鼠40只,随机分为衰老组和对照组各20只,衰老组通过D-半乳糖皮下注射法建立衰老性骨质疏松症小鼠模型,对照组皮下注射等量PBS.造模3个月后,分别取两组小鼠胫骨组织,采用miRNA芯片技术分析miRNA表达谱变化,筛选两组差异表达的miRNA.利用DAVID在线数据库对差异表达miRNA进行GO分析和KEGG通路分析,采用STRING在线数据库及Cytospace软件完成miRNA-靶基因—蛋白网络相互作用分析.结果 衰老组较对照组表达上调的miRNA有8个,分别为miR-5617-5p、miR-10a-3p、miR-3071-5p、miR-16-2-3p、miR-125b-1-3p、miR-344i、miR-181a-1-3p、miR-1934-3p;表达下调12个,分别为miR-211-3p、miR-31-3p、miR-5619-3p、miR-370-5p、miR-450b-3p、miR-96-5p、miR-5136、miR-344d-2-5p、miR-376b-3p、miR-411-5p、miR-15b-5p、miR-499-3p.靶基因主要在酶结合、蛋白结合和DNA结合等方面发挥作用,涉及细胞连接、液泡和突触等细胞组分,参与蛋白质定位、蛋白质转运和信号调节,调节MAPK信号通路、FoxO信号通路、Ras信号通路等.miR-96-5p、miR-5617、miR-15b、miR-3071与靶基因MAP2K1、UBE2G1、P4HB、VDAC1、CD164有紧密联系,这些靶基因编码蛋白具有相互作用关系.结论 miRNA在衰老性骨质疏松症的发生发展过程中可能发挥重要作用,其中miR-96-5p、miR-5617、miR-15b、miR-3071可能通过调控MAP2K1、UBE2G1、P4HB、VDAC1、CD164等参与衰老性骨质疏松症的发生.