目的 建立淋巴细胞激活基因3(LAG-3)免疫噬菌体纳米抗体文库,获得高特异性和亲和力的抗LAG-3纳米抗体,并鉴定其功能活性.方法 采用人LAG-3蛋白免疫羊驼,获取外周血cDNA;通过巢式PCR获得纳米抗体基因,构建至pComb3XSS质粒,电转至大肠杆菌XL1-Blue中构建纳米抗体噬菌体免疫文库,并对文库进行质量分析.通过噬菌体展示技术筛选抗LAG-3特异性纳米抗体,通过第二代基因测序技术获得纳米抗体的基因序列.将目的序列构建到大肠杆菌BL21(DE3)周质表达载体pET-22b(+)中进行抗体表达,Prism A柱进行纯化,通过高效液相色谱-质谱分析(HPLC-MS)、ELISA、Western blot法和表面等离子共振技术(SPR)进行抗体性质和功能分析.结果 构建的纳米抗体噬菌体免疫文库的库容为7.20 ×108菌落形成单位(CFU),序列分析文库多样性良好,经过4轮淘筛后获得3条具有不同氨基酸序列的抗LAG-3纳米抗体,分别为重链抗体重链可变区结构域-L1-3(VHH-L1-3)、VHH-L3-2和VHH-L13-2,纳米抗体表达纯化后纯度在95％以上,三种抗体均可以与重组人LAG-3蛋白进行特异性结合;其中VHH-L13-2抗体的亲和力指数KD值为3.971 × 10 mol/L,且对于LAG-3和纤维蛋白原样蛋白1(FGL-1)的结合具有抑制作用,半数抑制浓度(IC50)值为15.58 nmol/L.结论 成功构建了 LAG-3纳米抗体噬菌体免疫文库,筛选获得了特异性好、亲和力高的LAG-3纳米抗体,且对于LAG-3与其配体的结合具有一定的抑制作用.

血管内皮素生长因子受体3(vascular endothelial growth factor receptor 3,VEGFR-3/FLT4)与黑色素瘤细胞的生长有关,其可能对毛色及黑色素生成有一定的调控作用.为探讨FLTd基因对羊驼毛色及黑色素生成的影响,本文采用免疫组织化学、qRT-PCR、Western印迹对FLT4在不同毛色羊驼皮肤毛囊中的表达进行了研究.结果显示,FLT4在不同毛色毛囊中外根鞘及毛乳头阳性表达不同,且棕色皮肤比白色皮肤阳性信号强;FLT4 mRNA在棕色羊驼皮肤的表达量明显高于白色羊驼皮肤(P＜0.01);FLT4蛋白在棕色皮肤中的表达量明显高于白色皮肤(P＜0.01);为进一步研究FLT4对黑色素生成的影响;通过对体外培养的羊驼皮肤黑色素细胞中添加不同浓度的FLT4蛋白(0,1,10,50,100 ng/mL),与对照组相比,添加FLT4蛋白后酪氨酸酶(TYR)、酪氨酸相关蛋白-1(TYRP1)、受体酪氨酸激酶c-KIT、小眼畸形相关转录因子(MITF)的mRNA和蛋白质表达明显增加,10 ng/mL组表达量最高(P＜0.01);黑色素含量测定结果表明,不同浓度的FLT4蛋白处理的羊驼皮肤黑色素细胞的黑色素含量比对照组明显升高,添加FLT4蛋白10 ng/mL表达量最高(P＜0.01).由此可知,FLT4可以通过调节毛色相关基因的表达进而引起黑色素细胞中黑色素含量的变化.

目的 构建中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)特异性纳米抗体噬菌体展示库,并应用于纳米中和抗体筛选.方法 使用MERS-CoV的受体结合区(RBD)重组蛋白免疫羊驼后分离外周血单个核细胞(PBMC)并提取总RNA.使用简并引物通过PCR扩增重链抗体的重链可变区(VHH)基因构建重组噬菌粒并转化TG1大肠杆菌克隆菌株,构建特异性纳米抗体噬菌体展示库,利用噬菌体展示技术进行纳米中和抗体筛选和功能鉴定.结果 构建的纳米抗体噬菌体展示库库容为1.31×108个,丰度为5.65×1010个/mL,VHH片段插入率达到96％,且具有较好的多样性,并利用构建的纳米抗体噬菌体展示文库成功筛选并表达出具有中和活性的纳米抗体.结论 成功构建了能有效应用于MERS-CoV中和纳米抗体筛选的噬菌体库.

miR-380是不同羊驼毛色中差异表达的基因之一,但是否与黑色素生成有关未见报道.为了丰富调控黑色素生成的机制,挖掘黑色素生成路径中所涉及到的更多新的基因并揭示miR-380在黑色素细胞中的功能,本实验通过生物信息学方法预测出MAPK信号通路的成员MAP3 K6是miR-380的靶基因之一.在293T细胞中共转染miR-380和MAP3 K6后,与对照组相比双荧光报告酶活性下降(28.92±25.63)％ (P ＜0.01),下降趋势明显,说明MAP3K6可能是miR-380的靶基因之一;在羊驼黑色素细胞中转染miR-380后,MA P3 K6、MEK1、ERK1/2、CREB和MITF在转录水平的表达量与NC组相比具有显著下降趋势,其中CREB下降趋势尤为显著(64.20±54.30)％(P＜0.01),Western印迹检测MAP3K6、p-MEK1、p-ERK1/2、CREB和MITF在蛋白质水平的表达与NC组相比下降趋势明显且p-MEK1和CREB基因下降极为显著,分别为(29.09±10.68)％(P＜0.001)和(47.12±6.70)％ (P ＜0.001),抑制组则反之.通过Masson-Fontana黑色素颗粒染色法检测miR-380抑制黑色素细胞产生黑色素颗粒,用紫外分光度法检测真黑素(eumelanin,EM)和褐黑素(pheomelanin,PM),含量结果提示EM与PM含量分别下降为(38.63±2.00)％(P＜0.01),(54.10±5.73)％ (P＜0.001)且PM含量下降极为显著.综上所述miR-380通过靶向抑制MAP3K6等基因的表达,从而对MAPK/ERK信号通路起调控作用,最终影响黑色素生成生物学功能,此研究对哺乳动物毛色形成机制和防止皮肤受紫外辐射有重要意义.

本研究旨在构建表达抗艰难梭菌毒素的纳米抗体重组乳酸乳球菌.所述的抗体为免疫羊驼后从外周血中分离的天然缺失轻链的纳米抗体(分别命名为E3、AA6).构建重组质粒pNZ8148- E3-AA6,转化乳酸乳球菌NZ9000后诱导表达,SDS-PAGE及Western blot检测到32 kD的目的蛋白.利用镍柱亲和层析法纯化重组蛋白E3-AA6,BCA试剂盒测定其浓度.通过细胞变圆实验以及CCK8实验鉴定其功能,E3-AA6能够抑制艰难梭菌毒素TcdB的毒性.本实验成功构建了重组表达载体pNZ8148-E3-AA6,通过NICE系统实现了二价抗体的表达,为治疗艰难梭菌引发的感染提供了新的治疗途径.

抗体是实验研究和药物应用的重要工具.大多数抗体具有4条多肽链的对称结构,两条较长的重链和两条较短的轻链,两臂末端是相同的抗原结合部位.除了这些传统的抗体,羊驼、一些骆驼和鲨鱼体内会产生一种只含有重链的抗体,称为重链抗体.它们的抗原结合部位只由单一结构域构成.这类单域抗体具有分子小、可溶性好、热稳定性高和体内组织渗透性好等优点,引起了药物开发与免疫治疗应用等领域的广泛关注,具有很广阔的研究前景.文章主要概述了抗体药物的研究,单域抗体的特点及天然物种来源的单域抗体的研究概况.

已知黑色素皮质素受体1(melanocortin-1 receptor,MC1R)是调控哺乳动物毛色的主要基因之一.羊驼是一种能生产纤维的家畜,有22种天然毛色.为了研究是否可以将羊驼的毛色基因应用到绵羊中,本文克隆了羊驼MC1R,发现羊驼MC1R与绵羊的相似性为88.05％.将表达羊驼MC1R的质粒转染到绵羊黑色素细胞中,MC1R、小眼畸形相关转录因子(microphthalmia-associated transcription factor,MITF)、酪氨酸酶(tyrosinase,TYR)、酪氨酸酶相关蛋白2(tyrosinase-related protein 2,TYRP2)在转录水平的表达量与NC组相比具有显著上升趋势,分别是对照组的3.193±0.063倍、2.021±0.129倍、3.218±0.056倍、3.140 0.108倍(P＜0.01).Western印迹检测MITF、TYR、TYRP2在蛋白质水平的表达分别是对照组的1.852±0.117倍、3.537±0.13倍、2.045±0.163倍,具有显著差异(P＜0.01).此外,绵羊黑色素细胞中羊驼MC1R的表达造成黑色素合成显著增加,是NC组的1.715±0.014倍(P＜0.01).本研究结果表明,羊驼MC1R可用于增加绵羊黑色素生成过程中某些毛色基因的表达,为羊驼提供了可能的应用策略.

纳米抗体(Nb)最早发现于羊驼的外周血液中,与传统抗体相比,Nb具有体积小、稳定性好、免疫原性低、组织渗透性强、易于通过基因工程生产等特点,是目前已知最小的功能性抗原特异性结合片段,因此Nb近年来被认为是一种极具开发价值的蛋白质,在基础研究、新药研发、疾病治疗等多个领域得到了广泛的应用.本文重点综述Nb的结构特点和生化特性、在肿瘤诊断和治疗等领域的研究进展,同时预测Nb的应用前景.

黑色素瘤作为一种多发于皮肤部位的恶性肿瘤,严重危害着动物和人们的健康.与传统抗体比较,单域抗体具有结构简单、分子量小、免疫原性弱等特点,使其在疾病的诊断及治疗方面具有广阔的应用空间.本研究以B16-F10细胞蛋白质为研究对象,通过反复冻融与超声破碎相结合的方式获得B16-F10蛋白质作为抗原,免疫成年雄性羊驼.采用噬菌体单域抗体展示技术,构建了质量优良的B16-F10细胞蛋白质单域抗体免疫文库,其库容为5.76×1010,VHH重组率为96％,文库丰度为3.00×1010个/mL.该结果为研究黑色素瘤的生物学特性提供了新思路,同时也为后续筛选B16-F10单域抗体奠定了基础.

羊驼是重要的毛用型经济动物,具有22种天然色.毛色由皮肤中黑色素细胞产生的黑色素颗粒的分布和转运所决定的.然而,羊驼色素形成或毛色形成的分子机制复杂,由多个基因、miRNA和lncRNA调控.但是,miR-411a-3p对羊驼色素形成起调控作用未见报道.为研究miR-411a-3p在黑色素产生过程中的调控作用,本文将构建的miR-411a-3p载体转染到羊驼黑色素细胞中,并对毛色基因的表达进行研究.经生物信息学预测,钙/钙调素依赖蛋白激酶4(calcium-calmodulin dependent protein kinase 4,CaMK4)可能是miR-411a-3p的靶基因之一.双荧光素酶报告基因结果显示,与对照组相比,双荧光报告酶活性下降(34.78±16.09)％(P＜0.01),其下降趋势明显,说明CaMK4可能是miR-411a-3p的靶基因之一.miR-411a-3p通过结合CaMK4的3'untranslated region (3'-UTR)直接调控CaMK4的表达.在羊驼黑色素细胞中转染miR-411a-3p后,CaMK4、CDK5和TYRP1在转录水平的表达量与NC组相比具有显著下降趋势,其中TYRP1下降趋势尤为显著(53.66±2.11)％(P＜0.01).Western印迹检测CaMK4、CDK5、TYRP1、p-CREB在蛋白质水平的表达与NC组相比下降趋势明显,尤其是CDK5和p-CREB基因下降极为显著,分别为(70.26±4.84)％(P＜0.01)和(70.11±9.05)％(P＜0.01).Masson-Fontana法检测黑色素颗粒,结果显示,miR-411 a-3p抑制黑色素细胞产生黑色素颗粒.通过紫外分光度法检测真黑素(eumelanin,EM)和褐黑素(phenomelanin,PM)显示,EM和PM的含量均被下调.结果 表明,miR-411 a-3p靶向抑制CaMK4表达,从而改变CREB的表达以控制黑色素的产生,此研究结果对哺乳动物毛色形成机制有重要意义.