从药效相关性和成分差异阐释青翘与老翘改善博来霉素(BLM)诱导肺纤维化小鼠的作用差异.小鼠随机分为正常组,模型组,吡非尼酮组(50mg·kg-1),青翘低、高剂量组(1.3、2.6g·kg-1),老翘低、高剂量组(1.3、2.6 g·kg-1).采用气管滴注BLM制备肺纤维化模型,统计小鼠存活率及体质量变化;给药完成后计算肺指数,HE染色、Masson染色和天狼星红染色评价肺组织病理变化;透射电子显微镜观察肺组织超微结构;生化法测定肺组织转化生长因子-β1(TGF-β1)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、E钙黏着蛋白(E-cadherin)、羟脯氨酸(HYP)及肺泡灌洗液中白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平;RT-qPCR、Western blot法检测肺组织中基质金属蛋白酶7(MMP7)、胶原蛋白I型(collagen I)、E-cadherin、TNF-α、波形蛋白(vimentin)、TGF-β1、α-SMA表达;免疫荧光检测肺组织中α-SMA的表达;主成分分析法评价老翘与青翘改善肺纤维化的作用差异;分子对接技术分析老翘中含量高的化合物与TGF-β1受体之间的相互作用,CCK-8法检测其对TGF-β1诱导BEAS-2B和HFL1细胞模型的影响.结果显示,青翘、老翘可提高肺纤维化小鼠存活率,降低肺指数,改善肺组织病理损伤与胶原纤维沉积水平,改善小鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞板层小体受损情况,降低肺泡灌洗液中IL-6、TNF-α水平,下调肺组织中HYP、MMP7、vi-mentin、collagen Ⅰ、TGF-β1、α-SMA的表达,上调E-cadherin的表达.通过主成分分析综合评价胶原纤维沉积水平,其改善程度为老翘高剂量＞老翘低剂量＞青翘高剂量＞青翘低剂量.分子对接显示羟基酪醇、咖啡酸、连翘脂素、落叶松脂素与TGF-β1受体有较好的结合活性,且可显著减轻TGF-β1诱导BEAS-2B细胞损伤,抑制TGF-β1诱导HFL1细胞增殖.综上,青翘、老翘均可有效改善BLM诱导的肺纤维化小鼠损伤,老翘在减少胶原沉积方面优于青翘,可能与老翘中羟基酪醇、咖啡酸、连翘脂素、落叶松脂素含量高于青翘有关.

该研究旨在通过观察苓桂术甘汤(Linggui Zhugan Decoction,LGZGD)含药血清对心肌成纤维细胞(cardiac fibroblasts,CFs)纤维化及Wnt/β-连环蛋白(β-catenin)信号通路蛋白分子表达的调控机制.制备空白血清和LGZGD含药血清,胰酶-胶原酶依次消化并结合差速贴壁法分离培养原代CFs,采用免疫荧光标记鉴定原代CFs.设正常对照组,模型组,20％空白血清组,5％、10％、20％LGZGD含药血清组.分别用20％空白血清,5％、10％、20％LGZGD含药血清预处理12 h,除正常对照组,其余5组均加入过氧化氢(hydrogen peroxide,H2O2)刺激细胞,建立原代CFs纤维化模型.采用划痕愈合实验观察细胞迁移能力,ELISA法检测Ⅰ型胶原(collagen Ⅰ,Col Ⅰ)、Ⅲ型胶原(collagen Ⅲ,Col Ⅲ)含量,Western blot法检测α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、Wnt1、糖原合酶激酶 3β(glycogen synthase kinase 3 beta,GSK-3β)、磷酸化糖原合酶激酶 3β(phospho synthase kinase 3 beta,p-GSK-3β)、β-catenin 及细胞核β-catenin 的蛋白表达,RT-qPCR 检测 β-catenin、基质金属蛋白酶9(matrix metalloprotein 9,MMP9)的基因表达,免疫荧光技术检测关键蛋白α-SMA、β-catenin的表达及定位.制备Wnt1过表达CFs,采用H2O2处理CFs.设正常对照组、模型组、20％LGZGD含药血清组、空载质粒+20％LGZGD含药血清组、Wnt1过表达+20％LGZGD含药血清组.采用ELISA法检测Col Ⅰ、Col Ⅲ的含量与其比值,Western blot法检测α-SMA和Wnt1、GSK-3β、p-GSK-3β、β-catenin及细胞核β-catenin的蛋白表达,RT-qPCR检测β-catenin、MMP9的基因表达.免疫荧光染色显示,心肌成纤维细胞Vimentin表达阳性,呈绿色,胞核为蓝色,纯度大于90％,鉴定是原代CFs.结果显示,与正常对照组相比,模型组CFs 愈合率增强,Col Ⅰ、Col Ⅲ 含量升高,Col Ⅰ/Col Ⅲ 比值增大,α-SMA、Wnt1、p-GSK-3β、β-catenin、核β-catenin 蛋白表达上调,GSK-3β蛋白表达降低,β-catenin、MMP9 mRNA表达显著升高,β-catenin、α-SMA荧光强度明显增强,表达量明显增多;与模型组相比,5％、10％、20％LGZGD含药血清能显著抑制细胞迁移能力,减少Col Ⅰ、Col Ⅲ的含量,降低Col Ⅰ/Col Ⅲ比值,下调α-SMA、Wnt1、p-GSK-3β、β-catenin、核 β-catenin 蛋白表达,提高 GSK-3β 表达,减少 β-catenin、MMP9 的 mRNA 表达,降低β-cate-nin、α-SMA荧光强度和表达量;与空载质粒+20％LGZGD含药血清组比,过表达Wnt1后,LGZGD作用被显著逆转.LGZGD能够减少胶原纤维过度沉积,抑制成纤维细胞过度增生,改善心肌纤维化进程.LGZGD改善心肌纤维化的作用与调控Wnt/β-catenin通路,减少胶原沉积,保护心肌细胞有关.

目的:探讨机械张力对兔耳增生性瘢痕的形成及转化生长因子β 1（TGF-β 1）/Smad信号通路的影响。 方法:采用实验研究方法。取6只3~5个月龄雌雄不拘新西兰大白兔，于每侧兔耳腹面制作5个全层皮肤缺损创面。观察术后0（即刻）、7、14、21、28 d所有兔耳创面外观。术后28 d，计算瘢痕形成率。将每只兔左耳的3个成熟瘢痕纳入张力组并采用螺旋扩弓器持续扩弓，将每只兔右耳的3个成熟瘢痕纳入假张力组并仅缝合螺旋扩弓器不扩弓，每组共18个瘢痕。经机械张力处理（以下简称处理）40 d，观察2组兔耳瘢痕组织颜色、质地。处理40 d，观察并计算瘢痕增生指数（SEI），分别行苏木精-伊红染色观察组织形态、Masson染色观察胶原形态，采用实时荧光定量反转录PCR法检测瘢痕组织中TGF-β 1、Smad3、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的mRNA表达，采用蛋白质印迹法检测瘢痕组织中TGF-β 1、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、α-SMA的蛋白表达和Smad3磷酸化水平。以上实验各组样本数均为3。对数据行独立样本 t检验。 结果:术后0 d，所有兔耳均形成5个新鲜创面；术后7 d，可见创面结痂；术后14 d，大部分创面已上皮化；术后21 d，可见全部创面上皮化；术后28 d，形成明显的增生性瘢痕。术后28 d，瘢痕形成率为75%（45/60）。处理40 d，张力组的兔耳瘢痕组织凸起较假张力组明显，瘢痕组织较硬，颜色较红润；张力组兔耳瘢痕的SEI为2.02±0.08，明显高于假张力组的1.70±0.08（ t=5.07， P<0.01）。处理40 d，与假张力组相比，张力组兔耳瘢痕组织角质层变厚，真皮层可见大量新生的毛细血管、炎症细胞和成纤维细胞；胶原排列更加紊乱，呈结节状或旋涡状分布。处理40 d，张力组兔耳瘢痕组织中TGF-β 1、Smad3、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、α-SMA的mRNA表达量分别为1.81±0.25、5.71±0.82、7.86±0.56、4.35±0.28、5.89±0.47，分别明显高于假张力组的1.00±0.08、1.00±0.12、1.00±0.13、1.00±0.14、1.00±0.14（ t值分别为5.36、9.82、20.60、18.26、17.13， P值均<0.01）；张力组兔耳瘢痕组织中TGF-β 1、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、α-SMA的蛋白表达和Smad3磷酸化水平分别为0.865±0.050、0.895±0.042、0.972±0.027、1.012±0.057、0.968±0.087，分别明显高于假张力组的0.657±0.050、0.271±0.029、0.631±0.027、0.418±0.023、0.511±0.035（ t值分别为5.08、21.27、15.55、16.70、8.40， P值均<0.01）。 结论:机械张力会刺激瘢痕增生，抑制真皮层胶原纤维的正常排列，加剧胶原纤维的沉积，从而对兔耳增生性瘢痕的消退起抑制作用，其机制可能与机械张力激活TGF-β 1/Smad信号通路有关。

目的:通过体内实验和体外实验探讨地高辛对博莱霉素诱导肺纤维化小鼠的作用及其可能机制。方法:①体内实验：将60只C57/BL6J小鼠按随机数字表法分为对照组、肺纤维化模型组（模型组）、吡非尼酮（300 mg/kg）组及地高辛1.0 mg/kg、0.2 mg/kg组，每组12只。一次性气管内滴注博莱霉素5 mg/kg制备小鼠肺纤维化模型；对照组给予等量无菌生理盐水。制模后次日起各组灌胃相应药物，每日1次，持续28 d；对照组及模型组给予等量生理盐水。处死小鼠取肺组织，检测肺系数；苏木素-伊红（HE）及Masson染色后，光镜下观察肺组织形态学和胶原变化；采用免疫组化法检测肺组织中肌成纤维细胞标志物α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）及细胞外基质（ECM）胶原蛋白（COL-Ⅰ、COL-Ⅲ）阳性表达；采用蛋白质免疫印迹试验（Western blotting）检测肺组织中ECM纤维连接蛋白（FN）、转化生长因子-β（TGF-β）及磷酸化Smad3（p-Smad3）的蛋白表达。②体外实验：体外培养人胚肺成纤维细胞（HFL-1），当细胞密度达到70%~90%时分为空白对照组、细胞活化模型组（模型组）、吡非尼酮（2.5 mmol/L）组及地高辛100 nmol/L、50 nmol/L组。给予相应药物处理3 h后，除空白对照组外，其余各组加入诱导剂TGF-β处理48 h制备细胞活化模型。Western blotting检测细胞中α-SMA、FN、p-Smad3蛋白表达及磷脂酰肌醇3激酶/丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（PI3K/Akt）通路蛋白PI3K、Akt的磷酸化（p-PI3K、p-Akt）水平。结果:①体内实验结果：与对照组比较，模型组小鼠肺泡结构破坏明显，大量炎症细胞浸润，肺间质内胶原沉积，且肺组织中ECM沉积增加，α-SMA、FN、TGF-β、p-Smad3的蛋白表达水平均显著升高，说明博莱霉素诱导小鼠肺纤维化模型制备成功。与模型组比较，地高辛可以显著抑制气道炎症、胶原纤维沉积，减少ECM沉积，降低α-SMA、FN、TGF-β、p-Smad3的蛋白表达，且效果优于吡非尼酮组，除FN外以地高辛1.0 mg/kg组效果更好〔α-SMA（ A值）：5.37±1.10比9.51±1.66，TGF-β蛋白（TGF-β/GAPDH）：0.09±0.04比0.33±0.23，p-Smad3蛋白（p-Smad3/GAPDH）：0.05±0.01比0.20±0.07，均 P<0.01〕。②体外实验结果：与空白对照组比较，模型组细胞FN、α-SMA、p-Smad3及PI3K/Akt信号蛋白表达均增加，表明TGF-β诱导的成纤维细胞活化模型建立成功。与模型组比较，地高辛可以显著抑制成纤维细胞活化，明显降低FN、α-SMA、p-Smad3及PI3K/Akt通路蛋白表达，且效果优于吡非尼酮组，其中以地高辛100 nmo/L组FN、α-SMA及p-Akt表达降低更为明显〔FN蛋白（FN/GAPDH）：0.21±0.15比0.88±0.22，α-SMA蛋白（α-SMA/GAPDH）：0.20±0.01比0.50±0.08，p-Akt蛋白（p-Akt/GAPDH）：0.30±0.01比0.65±0.10，均 P<0.01〕。 结论:地高辛对博莱霉素诱导的小鼠肺纤维化具有保护作用，其机制可能与调节PI3K/Akt信号通路抑制成纤维细胞活化有关，并呈一定剂量依赖性。

目的:探究多磺酸黏多糖乳膏对增生性瘢痕形成的抑制作用及机制。方法:在新西兰白兔（16只）双耳建立直径6 mm的圆形全层创面，构建兔耳增生性瘢痕模型，每只兔耳3个瘢痕创面，左耳瘢痕作为多磺酸黏多糖乳膏实验组，右耳瘢痕为基质对照组，分别外涂多磺酸黏多糖乳膏和基质乳膏，1只兔耳用药量约0.4 g，2次/d，连续6周。分别在用药开始第0天（手术14 d）、14天（手术后28 d）和42天（手术后56 d）取瘢痕组织进行HE染色、Masson染色和免疫组化实验，评估组织病理评分，检测瘢痕厚度、胶原纤维密度和Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白表达及Ⅰ/Ⅲ型胶原蛋白比值。采用 t检验和单因素方差分析比较两组各指标差异。 结果:HE染色结果显示，与给药前相比，给药42 d对照组存在大量细胞外基质沉积、炎症细胞浸润和局部充血等，而实验组未见明显改变。给药0、14、42 d，对照组兔耳瘢痕组织病理结构评分明显升高，分别为4.16 ± 1.61、6.50 ± 1.46、6.53 ± 1.34（ F = 13.69， P = 0.001），而实验组无明显变化（4.65 ± 1.52、5.13 ± 1.83、5.38 ± 1.60； F = 0.78， P > 0.05）。Masson染色结果显示，给药42 d对照组胶原纤维含量极高，被染成深蓝色，而实验组胶原纤维含量有所下降；随着给药时间的增加，与给药前相比，对照组瘢痕组织厚度明显增加（ F = 5.64， P = 0.007），而实验组无明显变化（ F = 1.48， P > 0.05）。免疫组化结果显示，与给药0 d相比，实验组和对照组各时点Ⅲ型胶原蛋白表达均无明显改变（ F = 0.22、0.92，均 P > 0.05），但对照组Ⅰ型胶原蛋白表达和Ⅰ/Ⅲ型胶原蛋白比例明显上升（ F = 7.47， P < 0.001； F = 4.70， P = 0.005）；给药42 d，与对照组相比，实验组Ⅰ型胶原蛋白表达和Ⅰ/Ⅲ型胶原蛋白比值明显下降（ t = 3.04， P = 0.007； t = 2.35， P = 0.030） 。 结论:多磺酸黏多糖乳膏局部应用可有效降低瘢痕厚度和抑制胶原纤维增生以及Ⅰ型胶原蛋白表达，预防和抑制瘢痕增生。

目的:探讨脊神经双侧离断神经源膀胱(NB)幼鼠模型的膀胱形态结构功能变化及转化生长因子β1(TGF-β1)通路相关蛋白的表达。方法:选取SD雌性幼鼠64只，其中32只行L 6＋S 1神经双侧离断建立NB模型，32只行假手术作为对照。神经离断和假手术3、6、12、24周后行膀胱测压检查。收集对应膀胱组织行马松染色和天狼猩红染色分析胶原纤维变化，免疫组织化学染色分析TGF-β1、Smad2、Smad6蛋白变化，采用Western blot检测TGF-β1受体Ⅰ的蛋白水平变化。 结果:各NB神经离断组膀胱不稳定，存在膀胱漏尿点压(BLPP)，膀胱无明显排尿收缩压；神经离断3、6、12周和24周鼠的膀胱基础压(22.10±2.51)、(18.20±1.52)、(31.20±2.82)、(41.10±3.41) cmH 2O(1 cmH 2O＝0.098 kPa)和膀胱容量(22.30±1.72)、(49.10±5.54)、(30.30±2.68)、(13.50±1.52) mL均明显高于假手术组[(3.51±0.45) cmH 2O和(0.52±0.04) mL]，差异均有统计学意义(均 P<0.01)。神经离断组膀胱组织横切面大小为先增大(3、6周)后变小挛缩(12、24周)，膀胱壁厚度先变薄(3、6周)后增厚(12、24周)；膀胱质量随离断时间持续增加。马松染色结果显示，神经离断大鼠的膀胱壁中正常纤维结缔组织逐渐紊乱，膀胱壁分层结构逐渐解体，平滑肌肥大增厚，肌间胶原纤维逐渐增多，染色变深。天狼猩红检测示神经离断24周的膀胱组织中Ⅲ型胶原纤维明显增多，Ⅲ型/Ⅰ型胶原纤维比例(3.14±0.71)明显高于对应的假手术组(0.88±0.21)，差异有统计学意义( t＝7.48， P<0.01)。免疫组织化学染色发现，神经离断膀胱组织中TGF-β1和Smad2表达随着离断时间逐渐升高，通路抑制性蛋白Smad6随离断时间逐渐降低。Western blot显示TGF-β1受体Ⅰ蛋白水平在12、24周的表达分别高于对应的假手术组1.3、1.6倍( t＝6.06、14.45，均 P<0.01)。 结论:脊神经双侧离断导致的幼鼠NB，收缩功能瘫痪，膀胱内压逐渐增高，膀胱正常结构逐渐解体，膀胱纤维化通路TGF-β1/Smads信号通路逐渐激活，小儿NB发展的过程为膀胱纤维化，临床治疗小儿NB应尽早预防膀胱纤维化。

目的:建立放射性心脏纤维化大鼠模型，观察重组人血管内皮抑制素(恩度)对心肌纤维化的影响，初探转化生长因子-β1(TGF-β1)、结缔组织生长因子(CTGF)与心肌纤维化的相关性。方法:将40只SD大鼠按随机数表法分为4组，每组10只，A组为健康对照组；B组为恩度干预组，恩度(6 mg/kg)腹腔连续注射14 d；C组为单纯照射组，心脏照射25 Gy/5次，连续5 d；D组为照射＋恩度干预组，恩度给药方法同B组、心脏照射方法同C组。照射后第1、3个月各麻醉处死5只大鼠。Masson染色评估心肌纤维化情况，Western blot检测心肌TGF-β1、CTGF及胶原蛋白Ⅰ(COL－Ⅰ)型表达。结果:照射后1和3个月，B组未见明显的心肌纤维化表现，C组和D组可见胶原纤维分布于心肌细胞间质。照射后1个月，半定量分析结果显示A组的心肌胶原容积分数(CVF)为(5.20±0.75)%，C组(10.12±2.17)%和D组(10.32±1.36)均高于A组( t＝4.74、4.93， P<0.01)，C组和D组的CVF差异无统计学意义( P>0.05)；照射后3个月C组的CVF(13.17±2.67)%仍比A组(5.23±1.32)%高( t＝4.49， P<0.01)，C组的CVF低于D组(16.92±3.58)%( t＝3.19， P<0.05)。照射后1个月，A组TGF-β1的表达量为0.441±0.063，C组0.817±0.079高于A组( t＝5.81， P<0.01)；照射后3个月，A组TGF-β1的表达量为0.501±0.110，C组0.832±0.150高于A组( t＝4.19， P<0.01)，D组1.403±0.133高于C组( t＝7.24， P<0.01)。照射后1、3个月，各组间CTGF及COL-I的变化趋势与TGF-β1的变化趋势相似。 结论:射线可引起心肌纤维化的形成，重组人血管内皮抑制素可能会加重晚期放射纤维化的形成。

目的:探究免疫球蛋白样结构域受体2（immunoglobulin-like domain-containing receptor 2，Ildr2）在缺血再灌注诱导肾纤维化中的作用。方法:利用CRISPR/Cas9技术构建 Ildr2敲除小鼠（KO组），其对照组为野生型小鼠（WT组）。通过夹闭左侧肾蒂构建单侧肾脏缺血再灌注（unilateral renal ischemia reperfusion，UIR）模型（UIR组），造模后分为KO-UIR组和WT-UIR组；假手术小鼠（Sham组）不进行缺血处理。采用肌氨酸氧化酶法检测血清肌酐水平；二乙酰肟比色法检测血尿素氮水平；酶联免疫吸附测定法检测尿白蛋白水平，计算尿白蛋白/肌酐比值；HE、PAS及MASSON染色检测肾组织炎性细胞浸润情况和纤维化程度；实时荧光定量PCR检测 Ildr2，肾损伤相关分子中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白（neutrophil gelatinase-associated lipocalin， NGAL）和肾损伤分子1（kidney injury molecule-1， KIM-1），纤维化标志分子Ⅰ型胶原α1（type 1 collagen α-1， Col1α1）、纤维连接蛋白1（fibronectin， Fn1）、α平滑肌肌动蛋白（ α-smooth muscle actin， α-SMA）和结缔组织生长因子（connective tissue growth factor， CTGF），以及炎症相关分子巨噬细胞标志物 F4/80、单核细胞趋化因子1（monocyte chemoattractant protein-1， MCP-1）的mRNA表达水平。免疫荧光和Western印迹法检测Ildr2、Col1α1及α-SMA的蛋白表达水平。 结果:（1）实时荧光定量PCR和Western印迹结果显示UIR组Ildr2 mRNA和蛋白表达水平均显著低于Sham组（均 P<0.05）。（2）KO组和WT组小鼠体重、血清肌酐、血尿素氮、总胆固醇、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白及三酰甘油等的差异均无统计学意义（均 P>0.05）。实时荧光定量PCR结果显示，KO组和WT组 NGAL、 KIM-1、 α-SMA、 Col1α1、 CTGF、 Fn1、 MCP-1及 F4/80 mRNA表达水平的差异均无统计学意义（均 P>0.05）。组织学染色结果显示KO组和WT组均无炎性细胞浸润异常及间质纤维化。（3）与WT-UIR组相比，KO-UIR组血清肌酐和血尿素氮水平均较高（均 P<0.05）。实时荧光定量PCR结果显示，KO-UIR组 NGAL、 F4/80、 MCP- 1、 Col1α1、 α- SMA和 CTGF mRNA表达水平均显著高于WT-UIR组（均 P<0.05）。免疫荧光和Western印迹结果显示，KO-UIR组Col1α1和α-SMA蛋白表达水平均明显高于WT-UIR组（均 P<0.05）。组织学染色结果显示，相比WT-UIR组，KO-UIR组小鼠炎性细胞浸润明显较多，间质胶原纤维沉积和小管损伤较重。 结论:正常生理状态下 Ildr2敲除未引起小鼠表型变化。Ildr2在UIR损伤中起到调控作用， Ildr2缺失导致UIR诱导的肾纤维化程度加重。

目的:观察慢性氟中毒大鼠肝组织胶原蛋白-Ⅰ型（Col-Ⅰ）、胶原蛋白-Ⅲ型（Col-Ⅲ）及α-平滑肌动蛋白（α-SMA）表达情况，探讨慢性氟中毒是否有导致大鼠肝纤维化的作用。方法:将48只SD大鼠按体重（90 ~ 100 g）采用随机数字表法分为对照组（饮用水氟离子浓度< 0.5 mg/L），低、中、高浓度氟组（饮用水氟离子浓度分别为5.0、50.0、100.0 mg/L），每组12只（雌、雄各半），饲养6个月。采用氟离子选择电极法检测骨氟、尿氟含量；苏木精-伊红（HE）染色及马松染色法光镜下观察肝组织病理形态学改变及胶原纤维沉积情况；实时荧光定量PCR及免疫组织化学染色法观察肝组织Col-Ⅰ、Col-Ⅲ、α-SMA mRNA及蛋白表达情况。结果:4组大鼠骨氟、尿氟[骨氟：（92.52 ± 5.64）、（112.21 ± 11.86）、（142.99 ± 7.87）、（235.63 ± 11.55）mg/kg，尿氟：（5.47 ± 0.88）、（17.78 ± 1.48）、（54.16 ± 5.96）、（121.11 ± 6.32）mg/L]比较，差异均有统计学意义（ P均< 0.001）。光镜下，随着染氟浓度增加，肝细胞水肿程度加重，中央静脉周围及汇管区胶原纤维沉积显著增多。低、中、高浓度氟组大鼠Col-Ⅰ mRNA表达水平（1.20 ± 0.09、1.80 ± 0.08、1.58 ± 0.06）均高于对照组（1.00 ± 0.00， P均< 0.05）；中、高浓度氟组大鼠Col-Ⅲ、α-SMA mRNA表达水平（Col-Ⅲ：1.15 ± 0.14、1.64 ± 0.24，α-SMA：1.69 ± 0.02、2.34 ± 0.06）均高于低浓度氟组（Col-Ⅲ：0.59 ± 0.17，α-SMA：0.80 ± 0.13， P均< 0.05）。随着染氟浓度增加，大鼠肝组织Col-Ⅰ（0.00 ± 0.00、0.03 ± 0.01、0.08 ± 0.01、0.13 ± 0.02）、Col-Ⅲ（17 803.05 ± 3 221.16、47 523.15 ± 3 490.10、127 786.35 ± 13 008.86、237 233.03 ± 47 614.63）、α-SMA（516.83 ± 181.18、2 885.03 ± 864.92、11 186.94 ± 2 394.08、37 182.43 ± 12 390.59）蛋白表达水平均增加（ P均< 0.05）。 结论:长期摄入过量氟可能引起大鼠肝脏中央静脉周围及汇管区胶原纤维产生增多，进而引起肝纤维化形成。

目的:探讨基于软骨脱细胞外基质微载体体外构建具有功能化和自我更新能力的软骨类器官。方法:取新鲜的猪关节软骨，将部分仅粉碎处理的软骨微粒设置为天然软骨组；利用物理离心化学萃取相结合的脱细胞方法，制备粒径合适的细胞外基质（ECM）微载体，设置为微载体组。通过旋转式生物反应器将人脐带干间充质干细胞（hUCMSCs）和人软骨细胞（hCho）按照3∶1的比例与微载体负载，体外构建软骨类器官，将诱导不同时间的类器官分为诱导0、7、14及21 d组。4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）荧光染色观察、DNA定量评估微载体组和天然软骨组细胞残留情况；番红O、甲苯胺蓝染色观察微载体ECM保留情况，二甲氨基苯甲醛比色法测定微载体组和天然软骨组胶原蛋白含量；二甲基亚甲蓝（DMMB）比色法测定微载体组和天然软骨组糖胺聚糖（GAGs）含量。扫描电镜及能谱分析对微载体进行进一步表征；将添加体积分数10%胎牛血清（FBS）的杜尔伯克改良伊戈尔低糖培养基（DMEM）培养的hUCMSCs作为对照组，将微载体浸提液培养的hUCMSCs作为实验组，两组分别设置培养1、3、5 d共3个时间点的亚组，细胞增殖及毒性检测试剂盒（CCK-8）检测两组生物相容性。活死染色检测诱导0、7、14及21 d组的软骨类器官细胞活性，Ki67荧光染色鉴定诱导14 d软骨类器官的自我更新能力。RT-PCR测定诱导7、14、21 d组的软骨类器官，包括软骨形成相关标记物聚蛋白聚糖（ACAN）、Ⅱ型胶原（COL2A1）、性别决定区Y框蛋白9（SOX9）及软骨肥大、矿化相关标记物Ⅰ型胶原（COL1A1）、Runt相关转录因子2（RUNX2）、骨钙素（OCN）的表达水平；比色法和DMMB法测定诱导0、7、14及21 d组的类器官分泌胶原蛋白和GAGs能力。结果:DAPI荧光染色结果显示，天然软骨组具有大量细胞核，而微载体组则基本无细胞核。微载体组DNA含量为（7.8±1.8）ng/mg，较天然软骨组的（526.7±14.7）ng/mg显著降低（ P<0.01）。番红O、甲苯胺蓝染色可见微载体着色较深且均一，保留大量软骨ECM成分。微载体组胶原蛋白含量为（252.9±1.4）μg/mg，GAGs含量为（173.4±0.8）μg/mg，均显著低于天然软骨组的（311.9±2.2）μg/mg、（241.3±0.7）μg/mg（ P<0.01）。扫描电镜显示，微载体表面有凹凸不平相互交错的胶原纤维网络。能谱分析结果显示，C、O、N元素均匀分布在微载体，表明该微载体成分组成均匀。微载体生物相容性良好，培养1、3 d时，对照组和实验组CCK-8实验结果比较，差异均无统计学意义（ P>0.05）；培养5 d，实验组 A值为0.53±0.02，优于对照组的0.44±0.03（ P<0.05）。诱导0、7、14及21 d组中，hUCMSCs和hCho贴附在微载体表面且细胞活性好，活死比例分别为（70.6±1.1）%、（80.5±0.6）%、（94.5±0.9）%、（90.8±0.5）%（ P<0.01）；诱导14 d时，软骨类器官有大量Ki67阳性细胞。RT-PCR显示，诱导7 d组ACAN、COL2A1、SOX9、COL1A1、RUNX2、OCN表达水平分别为1.00±0.09、1.00±0.24、1.00±0.18、1.00±0.03、1.00±0.06、1.00±0.13；诱导14 d组ACAN、COL2A1、SOX9、COL1A1、RUNX2、OCN表达水平分别为4.16±0.28、5.09±1.25、5.65±1.05、0.47±0.01、1.68±0.02、0.21±0.06；诱导21 d组ACAN、COL2A1、SOX9、COL1A1、RUNX2、OCN表达水平分别为13.42±0.92、3.07±0.21、1.84±1.08、2.72±0.17、2.91±0.18、3.32±1.20。与诱导7 d组比较，诱导14 d组ACAN、COL2A1、SOX9、RUNX2表达水平均升高（ P<0.05），COL1A1表达水平降低（ P<0.05），OCN表达水平差异无统计学意义（ P>0.05）；与诱导7 d组比较，诱导21 d组ACAN、COL1A1、RUNX2表达水平均显著升高（ P<0.01），COL2A1、SOX9、OCN表达水平差异均无统计学意义（ P>0.05）；与诱导14 d组比较，诱导21 d组ACAN、COL1A1、RUNX2、OCN表达水平均升高（ P<0.05或0.01），COL2A1表达水平差异无统计学意义（ P>0.05），SOX9表达水平降低（ P<0.05）。诱导0、7、14及21 d组胶原蛋白含量分别为（219.15±0.48）μg/mg、（264.07±1.58）μg/mg、（270.83±0.84）μg/mg、（280.01±0.48）μg/mg，GAGs含量分别为（171.18±1.09）μg/mg、（184.06±1.37）μg/mg、（241.08±0.84）μg/mg、（201.14±0.17）μg/mg。与诱导0 d组比较，诱导7、14、21 d组胶原蛋白和GAGs含量均显著升高（ P<0.01）。在诱导7、14、21 d组中，诱导7 d组胶原蛋白含量最低（ P<0.01），诱导21 d组胶原蛋白含量最高（ P<0.01）；诱导7 d组GAGs含量最低（ P<0.01），诱导14 d组GAGs含量最高（ P<0.01）。 结论:物理化学方法结合制备的微载体脱细胞成功，其基质保留较多，成分均一且无细胞毒性。基于微载体负载hUCMSCs与hCho体外成功构建软骨类器官，具有细胞活性好、自我更新能力、软骨形成相关基因表达强及分泌胶原蛋白和GAGs等特点，诱导14 d时构建的软骨类器官成软骨活性最佳。