目的:探究平潭东岸近岸海水中的主要细菌种类、分布及其与人类健康的关系。方法:采用基因测序和细菌培养的方法，对平潭东岸近岸提取的7个海水样本进行微生物学分析。结果:采样时，平潭沿岸海水的气温为28.00 ℃，水温为24.30 ℃，溶解氧浓度为8.76 mg/L；码头水温为26.60 ℃，溶解氧浓度为7.12 mg/L。海水细菌培养后，共分离出29株弧菌科细菌，包括溶藻弧菌、副溶血弧菌和沙鱼弧菌等，以及20种其他科细菌，包括大肠埃希菌、阴沟杆菌和粪肠球菌等致病菌。海水细菌基因测序显示，变形菌门在平潭东岸近岸海水中约占70%；弧菌属在平潭东北区域海水中占26.08%～31.14%。结论:平潭东岸近岸海水中的细菌主要是革兰阴性菌，以弧菌为主。在进行海水浸泡伤的救治时，应优先考虑针对革兰阴性菌的抗生素。

目的 探讨并建立非专业实验室场景下恒温、快速及简便的检测副溶血性弧菌的方法.方法 本研究针对副溶血性弧菌toxR基因设计特异性引物和成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)RNA(crRNA),建立基于重组酶聚合酶扩增(RPA)结合CRISPR及其相关蛋白13a(CRISPR-Cas13a)的反应体系,采用自配十二烷基硫酸钠(SDS)核酸快速提取试剂提取样本全基因组,并结合荧光法实现检测结果的可视化判读.结果 利用副溶血性弧菌菌株ATCC 17802和其他3种非副溶血性弧菌(溶藻弧菌、河流弧菌和梅氏弧菌)以及3种临床上常见腹泻致病菌(金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌和铜绿假单胞菌)对RPA-CRISPR/Cas13a荧光法的特异性进行验证,结果显示特异性为100.00％;对副溶血性弧菌基因组DNA进行倍比稀释并检测,该方法最低检出限为102 copies/μl.最后,将建立的方法应用于野生型副溶血性弧菌检测,检测结果与TaqMan定量聚合酶链式反应(TaqMan-qPCR)检测结果及基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)鉴定结果一致.结论 本研究建立了一种针对toxR基因的RPA-CRISPR/Cas13a检测方法,具有简便、快速、特异性强、结果判读可视化等优点,为非专业实验室场景下的副溶血性弧菌快速检测提供了较好工具.

目的 分析云南省水产品病原生物污染情况,为食源性疾病防控策略提供依据.方法 2014-2021年,按年度对云南省16个州市水产品开展随机抽样监测,以统计学方法分析不同病原生物在水产品类型、地区、季节分布上的差异以及可能的污染途径.结果 在3 540份生鲜、冷鲜、冷冻(糜制品)、即食4类水产样品中,检出9种致病菌、1种寄生虫,总检出率为10.8％(383/3 540),致病菌中检出较多的为副溶血性弧菌(10.3％,139/1 347)、单核细胞增生李斯特菌(4.2％,41/980)、沙门菌(3.3％,32/980);寄生虫中广州管圆线虫在中间宿主中感染较为普遍(9.0％,167/1 861),其他病原生物检出率较低.病原生物在不同类型水产品中检出率差异有统计学意义(x2=34.077,P＜0.001),以生鲜、冷鲜水产中检出为主;分层x2检验显示,部分病原生物在地区分布、产地及采样场所存在有检出差异;副溶血性弧菌(x2=15.850,P=0.001)、溶藻弧菌(x2=8.400,P=0.029)检出率在季度分布上差异有统计学意义.结论 云南省水产品病原生物污染较普遍,存在引发食源性疾病的风险.改变饮食习惯、改善水产品储运条件及加强病原生物监测是降低食源性疾病发病率的有效途径.

研究以前期筛选的长牡蛎(Crassostrea gigas)弧菌抗性家系为亲本,构建40个全同胞家系,评估了弧菌抗性选育家系生长和存活性状的遗传参数及多个环境下的基因型与环境互作.结果显示,在不同日龄下,壳高和壳长的遗传力分别为(0.46±0.10)-(0.59±0.13)和(0.30±0.08)-(0.59±0.13),为中高等遗传力,存活性状的遗传力为(0.25±0.06)-(0.41±0.11),为中低等遗传力.不同日龄的壳高和壳长遗传相关(0.429-0.828)均大于表型相关(0.192-0.611),除180日龄时,遗传和表型相关为低度正相关,其余各阶段均为中高度正相关;生长与存活性状的遗传和表型相关分别为(-0.138-0.380)和(-0.073-0.512),表现为中低度相关性.研究中生长和存活性状在两个环境间的遗传相关分别为(0.34-0.68)和(0.32-0.50),均小于0.7,表明乳山和荣成海区家系的生长和存活性状间存在明显的基因型与环境互作效应,因此对长牡蛎弧菌抗性进行选育时需要针对不同的养殖环境制定不同的育种方案.研究为长牡蛎抗弧菌品系的选育提供基础资料和科学依据.

目的 优化海洋来源的蓝灰异壁放线菌OUCMDZ-413突变株CRM05的发酵条件,提高浅蓝霉素H的发酵产量并测定其对海洋环境病原细菌的抑菌活性.方法 探索培养基组成、接种量、种龄、发酵天数、盐度、pH、碳源、氮源、前体以及大孔吸附树脂添加量,再采用单因素实验和正交实验确定最优发酵条件.结果 优化后浅蓝霉素H的最佳发酵条件为:摇瓶发酵11d(28℃、180 r/min)、装液量150/500 mL(体积分数)、优化培养基(20 g可溶性淀粉、10 g蛋白胨、10 g酵母浸膏、4g NaCl、4gCaCO3、0.1 g2-吡啶甲酸、40gXAD-16大孔吸附树脂、1L陈海水、灭菌前用1 mol/L盐酸调节pH 6.5)、2％接种量、5 d种龄(即菌落的A6002.72).结论 以优化条件发酵菌株CRM05,浅蓝霉素H的分离产量达到434 mg/L,是优化前液体发酵产量的10倍和优化后固体发酵产量的1.6倍.浅蓝霉素H可显著抑制3种海洋弧菌—溶藻弧菌、创伤弧菌和副溶血弧菌,其最小抑菌浓度分别为8、16和16 μg/mL,活性强于环丙沙星(相应的最小抑菌浓度分别为64、64和32 μg/mL).

[背景]由水产致病菌导致的病害不断暴发,寻找安全有效的抗生素替代品是目前生产的迫切需求.人们通常过于关注益生菌效应,而对其安全性评价重视度不够.[目的]分析我国海水养殖系统中不同来源枯草芽孢杆菌菌株的表型及遗传特征,并寻找绿色安全且具有多重抑菌作用的菌株.[方法]以 2009-2021 年从我国海水养殖系统中分离的 37 株枯草芽孢杆菌为对象,利用纸片扩散法(K-B法)检测其对不同抗生素的抗性;利用培养基平板法测定淀粉酶、蛋白酶和溶血能力;通过PCR方法检测枯草芽孢杆菌溶血相关基因携带风险;采用牛津杯法测定其对副溶血弧菌、溶藻弧菌、爱德华氏菌、哈维氏弧菌、美人鱼发光杆菌和假交替单胞菌等 6 种病原菌的抑菌作用;并对候选益生性枯草芽孢杆菌的安全性进行评估.[结果]药敏检测结果显示,37 株枯草芽孢杆菌对甲氧苄啶、吡哌酸、链霉素表现出强耐药性,对磺胺嘧啶表现出中等耐药,对头孢噻肟、环丙沙星、舒巴坦的耐药率低,对克拉霉素、诺氟沙星、氟苯尼考、氟甲喹、复方新诺明、四环素表现为完全敏感.蛋白酶、淀粉酶活性测试结果显示,37 株枯草芽孢杆菌能不同程度地水解酪蛋白和淀粉.溶血性测试结果显示,37 株枯草芽孢杆菌中有 4 株出现溶血现象,而 8 个溶血相关基因在 37 株枯草芽孢杆菌中均有检出,溶血表型与检测基因关联分析表明,产生溶血现象的菌株与其溶血基因携带间无直接相关性.抑菌试验分析表明,37 株枯草芽孢杆菌均对 2 种及以上病原菌有抑制作用,对 6 种病原菌均具有良好抑菌作用的有 2 株(菌株Bs4 和Bs7).对凡纳滨对虾的安全试验表明,菌株Bs4 对凡纳滨对虾具有高安全性,7 d对虾存活率为 100％.[结论]通过对 37 株枯草芽孢杆菌生理代谢表型、遗传特性及病原拮抗特性进行比较分析,揭示了我国海水养殖系统中枯草芽孢杆菌具有多元化的表型及遗传特征,并筛选出一株生态安全且具有多重抑菌活性的益生性枯草芽孢杆菌,为水产养殖病害防控、开发抑菌类微生态制剂及水产养殖行业健康绿色发展提供了理论基础和技术支撑.

有效消毒可以预防黏膜创面感染,减少炎症发生.基于此,文章重点研究了聚六亚甲基双胍复配消毒剂对几种伤口常见致病菌的杀灭作用.首先研究了聚六亚甲基双胍(PHMB)、三氯生(TCS)和H2O2 对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度(MIC)、最低杀菌浓度(MBC)及部分抑菌浓度指数(FICI),发现三氯生(TCS)的MIC和MBC最低,与H2O2 联合有相加作用.复配消毒剂(1 280 μg/mL PHMB、10 μg/mL TCS、40 μg/mL H2O2)对白色念珠菌的抑菌能力最强,在 30s内能够完全杀灭溶藻弧菌、副溶血性弧菌和铜绿假单胞菌,与金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、白色念珠菌和模拟陆地伤口混菌作用5 min时的杀灭对数值均≥5 log10 CFU/mL,符合国家标准.因此该消毒剂在黏膜伤口治疗中具有很大的应用潜力.

目的:了解海口市海产品中副溶血弧菌和溶藻弧菌的污染及分布情况.方法:采集 2020年～2022 年海口市售的 3 大类海产品,参照《食品安全国家标准食品微生物学检验副溶血性弧菌检验》(GB4789.7-2013)检测副溶血性弧菌和溶藻弧菌,采用实时荧光PCR技术对副溶血性弧菌及溶藻弧菌进行鉴定,分析不同种类海产品、不同年份和不同季度的副溶血弧菌和溶藻弧菌检出情况.结果:海产品中共采集119份,其中24份检出副溶血性弧菌,阳性率20.1%;46份检出溶藻弧菌,阳性率38.7%;各类海产品中虾类副溶血性弧菌阳性率最高,为50%;贝类溶藻弧菌阳性率最高,为48%.监测年份之间比较,2021年溶藻弧菌的阳性率最高,为76.7%;2022年副溶血性弧菌阳性率最高,为25%.不同季度之间比较,第二季度溶藻弧菌的阳性率最高,为80%,第四季度副溶血弧菌的阳性率最高,为33.3%.不同年份、季度海产中溶藻弧菌阳性率差异具有统计学意义(P<0.05),不同种类、季度副溶血弧菌阳性率差异具有统计学意义(P<0.05).结论:2020年～2022年海口市海产品中存在着副溶血性弧菌和溶藻弧菌的污染,建议加强相关部门的监管,保障人民海产品食用的安全性.

为了开发微生物控藻技术,从藻际环境中分离了具有溶藻活力(algicidal ability)的细菌,并探讨了群体感应信号对溶藻活力的调节作用.通过稀释涂布法从甲藻赤潮样品中分离得到了 10 株溶藻细菌,16S rRNA 基因序列鉴定为 5 个属,包括交替假单胞菌(Pseudoalteromonas sp.)、假单胞菌(Pseudomonas sp.)、弧菌属(Vibrio sp.)、新鞘氨醇杆菌属(Novosphingobium sp.)以及鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas sp.).溶藻能力分析显示,这 10 株细菌均具有较强的溶藻能力,对裸甲藻叶绿素的产生具有明显的抑制能力,其中尤以新鞘氨醇杆菌最为突出.薄层色谱法TLC检测到 8 株细菌具有产群体感应信号的能力,信号分子主要为高丝氨酸内酯AHL-C8、AHL-C8-O以及AHL-10.为了验证群体感应信号对溶藻能力的调节作用,以新鞘氨醇杆菌为代表构建了AHL突变株,通过突变株与野生株的比较试验,发现AHL的缺失明显降低了溶藻能力,证实抑藻能力受到AHL信号的正向调节.酶活分析显示主要的抑制机制在于诱发了藻类明显的氧化应激,致使丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活力明显上升.考虑到藻类的有效防控是水生生态安全的重要组成部分,本研究结果提示微生物利用群体感应信号介导溶藻作用,可能帮助我们开发针对性的方法提升控制藻类的能力,例如合成生物学技术的引入.

[背景]菌蜕是诱导PhiX 174噬菌体裂解基因E(LysisE)在革兰氏阴性菌中表达后所获得无细胞内容物的细菌空壳.菌蜕生物安全性高,能以类似活菌方式诱导机体产生良好的系统和黏膜免疫应答.[目的]对分离自患溃疡病大黄鱼肝脏中的病原菌株16-3进行种属鉴定,利用温控调节表达系统控制PhiX 174噬菌体裂解基因E在该菌株中的表达来制备菌蜕,为防控鱼类溶藻弧菌感染提供有效手段.[方法]采用形态特征观察、生理生化特性测定及16S rRNA基因序列分析等方法对菌株16-3进行鉴定;构建温控裂解质粒pBV220-LysisE,并将其电转至溶藻弧菌菌株16-3,形成重组溶藻弧菌菌株16-3(pBV220-LysisE);将不同起始浓度的重组溶藻弧菌培养物同时进行42℃升温诱导,比较其溶菌动力曲线和裂解效率的差异;在最佳条件下制备溶藻弧菌菌株16-3菌蜕,电镜观察其形态与结构,采用倾注平板法测定冻干菌蜕中的活菌数.[结果]综合菌株16-3在形态、生理生化及16S rRNA基因系统发育等方面的特性,确定其为溶藻弧菌;构建了温控裂解质粒pBV220-LysisE和重组溶藻弧菌菌株16-3(pBV220-LysisE);溶藻弧菌菌株16-3菌蜕制备的最佳条件是选择起始浓度OD600为0.3的菌液进行诱导,诱导3h后即可收获菌蜕,其裂解效率为96.9‰,但经冻干处理后的菌蜕无活菌残留;电镜观察发现菌株16-3菌蜕保持原细胞的基本形态,但细胞表面有明显的溶菌孔道,且由于细胞内容流失而使细胞表面发生皱缩.[结论]制备出溶藻弧菌菌株16-3菌蜕,为其作为疫苗或疫苗递送载体奠定了基础.