通过对中华大蟾蜍(Bufo bufo gargarizans)5个不同发育时期的耳后腺和腹皮进行转录组测序分析,挖掘参与毒素合成的关键因子,为深入研究毒素合成调控机理提供理论依据.分别取3月龄、6月龄、12月龄、24月龄、36月龄等5个发育时期的中华大蟾蜍耳后腺和腹皮进行转录组测序,利用GO和KEGG对差异表达基因功能进行分析,利用加权共表达网络分析筛选关键基因.将处于相同发育时期腹皮与耳后腺的转录组数据进行比较,分别筛选出3 053、3 026、1 516、1 028和2 061个差异表达基因.由GO分类统计结果可知,差异表达基因在生物过程类别主要集中于细胞过程、单一生物体过程、代谢过程和生物调节;在分子功能类别主要富集于结合、催化活性等方面;在细胞组分类别主要聚集于细胞、细胞组分和细胞器.KEGG通路分析结果表明,差异表达基因在蟾蜍发育过程中参与多条通路,如酪氨酸代谢、过氧化物酶体和初级胆汁酸代谢等.将5个发育时期的共同差异表达基因进行比较,筛选出与类固醇代谢、初级胆汁酸代谢和过氧化物酶体相关的21个基因,利用加权共表达网络分析筛选出4个模块的6个关键基因.在不同发育时期中华大蟾蜍的腹皮与耳后腺差异表达基因中,大量代谢途径基因发生了富集,这些基因可能在调控耳后腺毒素合成中具有重要作用,为解析蟾蜍产毒分子机制奠定了基础.

为探究增温促进变态发育的生理学代价,测定了 23、25、27、29℃条件下中华蟾蜍(Bufo gargarizans)从37期蝌蚪发育至46期幼蟾,其变态时长、身体和内脏器官大小、应激水平及免疫功能的变化.结果表明:(1)随温度升高,变态时长缩短,存活率下降,个体变小;内脏器官中,胃湿重和长度系数均在25℃组最高,27℃组最低;小肠湿重系数25℃组最高,29℃组最低,小肠长度系数无显著性差异.(2)嗜中性粒细胞和淋巴细胞的百分比及两者的比值的组间差异均不显著;嗜酸性粒细胞的百分比25℃组显著高于其他各温度组,嗜碱性粒细胞和单核细胞的百分比分别在23℃组和27℃组最高,均在25℃组最低.(3)对植物血凝素(PHA-P)的反应均在注射后5 h达到最大反应值,29℃组显著高于其他温度组.适度增温有利于幼蟾胃和小肠发育,促进嗜酸性粒细胞增殖,抑制嗜碱性粒细胞和单核细胞增殖;高温刺激PHA-P反应强度增加,存活率下降,但对应激反应能力无影响,为快速适应陆地环境而被短暂激活的免疫能力可能不利于其未来存活.

蟾酥是一种具活性的蟾蜍提取物,其炮制方法是将中华大蟾蜍皮肤腺和耳后腺分泌的毒液进行酒制或高温干燥而得.作为一种在中国被用来治疗疾病已有上千年历史的天然产物,蟾酥具有强心、镇痛、抗心肌缺血、抗内毒素休克、抗癌等多种药理作用.沙蟾毒精(arenobufagin,ARE)是蟾酥的主要化学成分之一,其抗癌机制也在近十年来被越来越多地阐明.ARE可通过多种途径发挥抗癌作用,如诱导癌细胞凋亡和/或自噬、坏死、细胞周期阻滞,抑制癌细胞迁移和侵袭,抑制血管生成等.目前有关ARE的研究主要关注在其癌细胞选择性毒性和抗癌分子机制方面,多为细胞和动物水平.受限于ARE毒副作用较大、靶点不明确和药代动力特性不清楚等,ARE尚未进入西医临床应用阶段.该文梳理了ARE的抗癌活性、抗癌分子机制以及与其他抗癌药物联合使用的相关研究成果,以期为完善ARE的抗癌机制研究提供新的方向.

蟾酥是蟾蜍科动物中华大蟾蜍或黑眶蟾蜍的耳后腺或皮肤腺体的干燥分泌物.蟾酥作为一种传统的中药,化学成分复杂,临床用途较广,具有抗肿瘤、强心、抗炎、局麻、镇痛等多种药理活性.本文从蟾酥的本草考证、质量影响因素和质量标准现状等方面总结了蟾酥质量研究现状,以期从现行标准出发,为蟾酥药材的进一步质量控制提供参考.

为助力解决蟾蜍资源日益减少的窘境,探究蟾蜍中功效成分蟾蜍甾烯类化合物(BDs)生物合成部位及代谢途径,为蟾蜍资源可持续利用提供理论基础.利用UHPLC-Orbitrap-MS对蟾蜍多组织进行检测,筛选BDs在蟾蜍体内的合成部位,并利用质谱成像、匀浆孵化实验加以验证,确定BDs生物合成的关键器官.蟾蜍组织分布结果表明除耳后腺、皮肤组织外,BDs在肝脏中含量最多,胆汁中浓度最高,因此推测肝脏能够生物合成BDs,并通过胆汁代谢分布向蟾蜍全身.DESI-MSI质谱成像检测结果也指出,BDs主要富集在蟾蜍肝脏而并非是未发育成熟的耳后腺.蟾蜍肝脏匀浆孵化证明了蟾蜍肝脏能够独立生物合成BDs.该研究表明中华大蟾蜍在变态、发育、生长过程中,肝脏是蟾蜍体内合成BDs的重要器官,为生物合成BDs以及资源可持续利用提供了有力的理论支撑.

目的:从中华大蟾蜍(Bufo gargarizans Cantor)肝脏组织中克隆细胞色素P450还原酶基因(BgCPR,GenBank登录号:OQ572435)进行生物信息学分析,并进行功能验证.方法:基于中华大蟾蜍转录组数据库挖掘BgCPR基因序列,使用SnapGene软件设计BgCPR基因两端特异性引物,以蟾蜍肝脏组织总RNA逆转录成的cDNA为模板进行PCR扩增.利用生物信息学分析BgCPR蛋白理化性质、空间结构并构建系统进化树;基于CRISPR/Cas9基因编辑系统将蟾蜍BgCPR基因表达框经同源重组整合进入酿酒酵母基因组,利用聚乙二醇法制备转化子微粒体,验证其对细胞色素C的还原功能.结果:克隆得到全长2 043 bp的BgCPR基因cDNA,编码680个氨基酸,相对分子质量77 852 Da.结构预测显示,BgCPR蛋白为非分泌蛋白;有一段跨膜螺旋区,位于蛋白的第24～46位氨基酸之间;亚细胞定位预测显示该蛋白定位于内质网上.采用体外酶活实验证明其具有传递电子功能.结论:本研究克隆得到中华大蟾蜍BgCPR基因,并构建了表达具有生物活性的BgCPR的酿酒酵母工程细胞,为进一步研究蟾蜍CYP450基因功能乃至解析蟾蜍二烯内酯类化合物的生物合成途径奠定了基础.

物种基原是影响蟾酥药材质量的重要因素之一,来源于中华大蟾蜍的蟾酥质量显著高于来源于黑眶蟾蜍的蟾酥.蟾酥属于分泌物,缺乏基原动物的外观形态,传统鉴别法难以鉴别,而分子鉴定技术的快速发展为蟾酥鉴定提供了新的方法.然而,分泌物中残留的DNA 含量很少,降解严重,目前对分泌物来源的药材进行分子鉴定研究仍缺乏.为了解蟾酥药材的基原物种,该研究首先收集了83 份蟾酥样品,其中71 份原动物样品,按照2020 年版《中国药典》的方法制备蟾酥,市售蟾酥药材7 份,对照药材 5 份.然后比较了不同DNA提取方法,扩增其线粒体 16S rRNA基因片段和构建系统发育树,最后对蟾酥的基原物种进行分子鉴定.结果表明,试剂盒法提取蟾酥DNA质量比较好,83 份蟾酥样品中有 80 份成功扩增出 16S rRNA序列.从GenBank上下载了 71 条蟾酥基原物种的 16S rRNA序列.系统发育树结果表明蟾酥基原物种中华大蟾蜍与黑眶蟾蜍各自聚成单系,节点支持率为 100%(NJ)和 1.00(BI).市售蟾酥和对照药材的基原物种均为中华大蟾蜍.可见,从分泌物来源的蟾酥能提取DNA,扩增出 16S rRNA基因序列,能够对蟾酥基原物种进行分子鉴定,这为蟾酥药材的质量标准、其他分泌物来源的药材基原物种鉴定提供参考.

蟾酥作为临床常用的动物药材,广泛用于心血管疾病、风湿和恶性肿瘤疼痛的治疗.因其具有高活性和高毒性的特点,关注蟾酥制剂中蟾酥药味的质量控制,对于保障临床用药的安全有效至关重要.通过梳理我国药品标准收载的蟾酥制剂情况,明确已批准上市的蟾酥制剂有 102 种 474 个批号,其中《中国药典》2020 年版收载 14 种,《中华人民共和国卫生部药品标准》收载 68 种.这些制剂中,蟾酥多以原粉入丸、散剂,功能主治主要集中在清热解毒、消肿止痛、益气活血、开窍醒脑等方面.除了 2020 年版《中国药典》收载的蟾酥制剂中蟾酥药味的质量控制水平相对较高以外,其他蟾酥制剂中蟾酥药味的质控标准均较低,甚至缺失,亟需进行蟾酥制剂的质量标准提升研究.进一步检索中国知网(CNKI)、PubMed、Web of Science,对国内外报道的蟾酥制剂的质量评价研究和质量控制现状进行归纳总结,有 64 种蟾酥制剂报道了定性定量分析方法,主要有薄层鉴别、HPLC指纹图谱和多成分含量测定,指标成分涉及日蟾毒它灵、沙蟾毒精、蟾毒它灵、蟾毒灵、华蟾酥毒基和脂蟾毒配基等主要的蟾蜍甾类成分.综合文献信息,提示在完善蟾酥制剂质量标准过程中,需要关注蟾酥药材、饮片和制剂分析方法和检测指标的关联性,加强吲哚生物碱类成分的监控,以及重视含量均匀度检查等项目,以提升蟾酥制剂的整体质量控制水平.

目的:克隆中华蟾蜍肿瘤坏死因子受体超家族(TNFRSF)BbgTNFRSF11b、BbgTNFRSF9 基因的全长序列,并分析其序列特征.方法:根据转录组测序所得的TNFRSF11b、TNFRSF9 基因片段设计特异性引物,以中华蟾蜍蟾皮为材料,利用逆转录聚合酶链式反应(PCR)技术获得BbgTNFRSF11b、BbgTNFRSF9 基因全长互补脱氧核糖核酸(cDNA)序列,并采用生物信息学手段分析其序列特征,通过实时荧光定量 PCR 方法检测BbgTNFRSF11b、BbgTNFRSF9 基因在中华蟾蜍 7 种组织/器官中的表达情况.结果:克隆获得蟾蜍BbgTNFRSF11b基因的全长cDNA序列为 1233 bp,编码 410 个氨基酸,理论相对分子质量为 46.97 kDa,等电点为 8.64,不存在跨膜区及信号肽,为亲水性蛋白,具有多个磷酸化位点.BbgTNFRSF9 基因的全长cDNA序列为 829 bp,编码 247 个氨基酸,理论相对分子质量为 67.874 kDa,理论等电点为 5.12,存在信号肽,为疏水性蛋白,具有多个磷酸化位点,进化树分析发现BbgTNFRSF11b、BbgTNFRSF9 基因与其他动物TNFRSF11b、TNFRSF9 基因相似度不高,表明该基因虽有特殊结构域但不同物种间差异较大.组织表达分析显示,BbgTNFRSF11b、BbgTNFRSF9 基因在耳后腺中表达显著高于其他部位.结论:成功获得蟾蜍BbgTNFRSF11b、BbgTNFRSF9 基因序列,掌握其序列特征,为后续深入研究该蛋白的功能提供参考.

通过16S rRNA高通量测序方法分析采自四川九寨沟国家级自然保护区的中华蟾蜍Bufo gargarizans和中国林蛙Rana chensinensis的肠道菌群结构,结果表明:中华蟾蜍和中国林蛙共有的扩增序列变体(ASV)数目为440,其中特有的ASV分别为313和539.在门级水平上,中华蟾蜍和中国林蛙肠道中疣微菌门Verrucomicrobiota、厚壁菌门Firmicutes和拟杆菌门Bacteroidota的总丰度分别为96.18％和79.00％.在属级水平上,丰富度0.1％以上的有17个属级单元,总丰度分别占中华蟾蜍和中国林蛙肠道菌群的69.82％和41.37％,其中阿克曼菌属Akkermansia最丰富,分别占48.35％和10.75％.在中国林蛙肠道中,拟杆菌属Bacteroides、另枝菌属Alistipes、脱硫弧菌属Desul-fovibrio、丹毒杆菌属Erysipelatoclostridium、瘤胃球菌属Ruminococcus UBA1819、理研菌属Rikenella表现出更高的均匀度.研究结果为进一步深入研究中华蟾蜍和中国林蛙肠道微生物结构和功能提供了基础资料.