通过对中华大蟾蜍(Bufo bufo gargarizans)5个不同发育时期的耳后腺和腹皮进行转录组测序分析,挖掘参与毒素合成的关键因子,为深入研究毒素合成调控机理提供理论依据.分别取3月龄、6月龄、12月龄、24月龄、36月龄等5个发育时期的中华大蟾蜍耳后腺和腹皮进行转录组测序,利用GO和KEGG对差异表达基因功能进行分析,利用加权共表达网络分析筛选关键基因.将处于相同发育时期腹皮与耳后腺的转录组数据进行比较,分别筛选出3 053、3 026、1 516、1 028和2 061个差异表达基因.由GO分类统计结果可知,差异表达基因在生物过程类别主要集中于细胞过程、单一生物体过程、代谢过程和生物调节;在分子功能类别主要富集于结合、催化活性等方面;在细胞组分类别主要聚集于细胞、细胞组分和细胞器.KEGG通路分析结果表明,差异表达基因在蟾蜍发育过程中参与多条通路,如酪氨酸代谢、过氧化物酶体和初级胆汁酸代谢等.将5个发育时期的共同差异表达基因进行比较,筛选出与类固醇代谢、初级胆汁酸代谢和过氧化物酶体相关的21个基因,利用加权共表达网络分析筛选出4个模块的6个关键基因.在不同发育时期中华大蟾蜍的腹皮与耳后腺差异表达基因中,大量代谢途径基因发生了富集,这些基因可能在调控耳后腺毒素合成中具有重要作用,为解析蟾蜍产毒分子机制奠定了基础.

蟾酥是一种具活性的蟾蜍提取物,其炮制方法是将中华大蟾蜍皮肤腺和耳后腺分泌的毒液进行酒制或高温干燥而得.作为一种在中国被用来治疗疾病已有上千年历史的天然产物,蟾酥具有强心、镇痛、抗心肌缺血、抗内毒素休克、抗癌等多种药理作用.沙蟾毒精(arenobufagin,ARE)是蟾酥的主要化学成分之一,其抗癌机制也在近十年来被越来越多地阐明.ARE可通过多种途径发挥抗癌作用,如诱导癌细胞凋亡和/或自噬、坏死、细胞周期阻滞,抑制癌细胞迁移和侵袭,抑制血管生成等.目前有关ARE的研究主要关注在其癌细胞选择性毒性和抗癌分子机制方面,多为细胞和动物水平.受限于ARE毒副作用较大、靶点不明确和药代动力特性不清楚等,ARE尚未进入西医临床应用阶段.该文梳理了ARE的抗癌活性、抗癌分子机制以及与其他抗癌药物联合使用的相关研究成果,以期为完善ARE的抗癌机制研究提供新的方向.

蟾酥是蟾蜍科动物中华大蟾蜍或黑眶蟾蜍的耳后腺或皮肤腺体的干燥分泌物.蟾酥作为一种传统的中药,化学成分复杂,临床用途较广,具有抗肿瘤、强心、抗炎、局麻、镇痛等多种药理活性.本文从蟾酥的本草考证、质量影响因素和质量标准现状等方面总结了蟾酥质量研究现状,以期从现行标准出发,为蟾酥药材的进一步质量控制提供参考.

为助力解决蟾蜍资源日益减少的窘境,探究蟾蜍中功效成分蟾蜍甾烯类化合物(BDs)生物合成部位及代谢途径,为蟾蜍资源可持续利用提供理论基础.利用UHPLC-Orbitrap-MS对蟾蜍多组织进行检测,筛选BDs在蟾蜍体内的合成部位,并利用质谱成像、匀浆孵化实验加以验证,确定BDs生物合成的关键器官.蟾蜍组织分布结果表明除耳后腺、皮肤组织外,BDs在肝脏中含量最多,胆汁中浓度最高,因此推测肝脏能够生物合成BDs,并通过胆汁代谢分布向蟾蜍全身.DESI-MSI质谱成像检测结果也指出,BDs主要富集在蟾蜍肝脏而并非是未发育成熟的耳后腺.蟾蜍肝脏匀浆孵化证明了蟾蜍肝脏能够独立生物合成BDs.该研究表明中华大蟾蜍在变态、发育、生长过程中,肝脏是蟾蜍体内合成BDs的重要器官,为生物合成BDs以及资源可持续利用提供了有力的理论支撑.

目的:从中华大蟾蜍(Bufo gargarizans Cantor)肝脏组织中克隆细胞色素P450还原酶基因(BgCPR,GenBank登录号:OQ572435)进行生物信息学分析,并进行功能验证.方法:基于中华大蟾蜍转录组数据库挖掘BgCPR基因序列,使用SnapGene软件设计BgCPR基因两端特异性引物,以蟾蜍肝脏组织总RNA逆转录成的cDNA为模板进行PCR扩增.利用生物信息学分析BgCPR蛋白理化性质、空间结构并构建系统进化树;基于CRISPR/Cas9基因编辑系统将蟾蜍BgCPR基因表达框经同源重组整合进入酿酒酵母基因组,利用聚乙二醇法制备转化子微粒体,验证其对细胞色素C的还原功能.结果:克隆得到全长2 043 bp的BgCPR基因cDNA,编码680个氨基酸,相对分子质量77 852 Da.结构预测显示,BgCPR蛋白为非分泌蛋白;有一段跨膜螺旋区,位于蛋白的第24～46位氨基酸之间;亚细胞定位预测显示该蛋白定位于内质网上.采用体外酶活实验证明其具有传递电子功能.结论:本研究克隆得到中华大蟾蜍BgCPR基因,并构建了表达具有生物活性的BgCPR的酿酒酵母工程细胞,为进一步研究蟾蜍CYP450基因功能乃至解析蟾蜍二烯内酯类化合物的生物合成途径奠定了基础.

物种基原是影响蟾酥药材质量的重要因素之一,来源于中华大蟾蜍的蟾酥质量显著高于来源于黑眶蟾蜍的蟾酥.蟾酥属于分泌物,缺乏基原动物的外观形态,传统鉴别法难以鉴别,而分子鉴定技术的快速发展为蟾酥鉴定提供了新的方法.然而,分泌物中残留的DNA 含量很少,降解严重,目前对分泌物来源的药材进行分子鉴定研究仍缺乏.为了解蟾酥药材的基原物种,该研究首先收集了83 份蟾酥样品,其中71 份原动物样品,按照2020 年版《中国药典》的方法制备蟾酥,市售蟾酥药材7 份,对照药材 5 份.然后比较了不同DNA提取方法,扩增其线粒体 16S rRNA基因片段和构建系统发育树,最后对蟾酥的基原物种进行分子鉴定.结果表明,试剂盒法提取蟾酥DNA质量比较好,83 份蟾酥样品中有 80 份成功扩增出 16S rRNA序列.从GenBank上下载了 71 条蟾酥基原物种的 16S rRNA序列.系统发育树结果表明蟾酥基原物种中华大蟾蜍与黑眶蟾蜍各自聚成单系,节点支持率为 100%(NJ)和 1.00(BI).市售蟾酥和对照药材的基原物种均为中华大蟾蜍.可见,从分泌物来源的蟾酥能提取DNA,扩增出 16S rRNA基因序列,能够对蟾酥基原物种进行分子鉴定,这为蟾酥药材的质量标准、其他分泌物来源的药材基原物种鉴定提供参考.

蟾酥作为临床常用的动物药材,广泛用于心血管疾病、风湿和恶性肿瘤疼痛的治疗.因其具有高活性和高毒性的特点,关注蟾酥制剂中蟾酥药味的质量控制,对于保障临床用药的安全有效至关重要.通过梳理我国药品标准收载的蟾酥制剂情况,明确已批准上市的蟾酥制剂有 102 种 474 个批号,其中《中国药典》2020 年版收载 14 种,《中华人民共和国卫生部药品标准》收载 68 种.这些制剂中,蟾酥多以原粉入丸、散剂,功能主治主要集中在清热解毒、消肿止痛、益气活血、开窍醒脑等方面.除了 2020 年版《中国药典》收载的蟾酥制剂中蟾酥药味的质量控制水平相对较高以外,其他蟾酥制剂中蟾酥药味的质控标准均较低,甚至缺失,亟需进行蟾酥制剂的质量标准提升研究.进一步检索中国知网(CNKI)、PubMed、Web of Science,对国内外报道的蟾酥制剂的质量评价研究和质量控制现状进行归纳总结,有 64 种蟾酥制剂报道了定性定量分析方法,主要有薄层鉴别、HPLC指纹图谱和多成分含量测定,指标成分涉及日蟾毒它灵、沙蟾毒精、蟾毒它灵、蟾毒灵、华蟾酥毒基和脂蟾毒配基等主要的蟾蜍甾类成分.综合文献信息,提示在完善蟾酥制剂质量标准过程中,需要关注蟾酥药材、饮片和制剂分析方法和检测指标的关联性,加强吲哚生物碱类成分的监控,以及重视含量均匀度检查等项目,以提升蟾酥制剂的整体质量控制水平.

通过实验获得中华大蟾蜍(Bufo gargarizans)内皮分化相关因子-1(Endothelial differentiation related factor-1,EDF-1)重组蛋白及高效价抗血清.在前期研究工作中已克隆中华大蟾蜍EDF-1的开放阅读框(Open reading frame,ORF)(GenBank登录号K F769459),但因密码子的偏好性使中华大蟾蜍原有密码子在原核细胞中发生识别困难,重组蛋白原核表达未能成功.本文对中华大蟾蜍的EDF-1的ORF进行密码子优化,委托公司合成并插入原核表达载体,构建重组质粒pET-28b-EDF-1-Bufo.将重组质粒转入大肠杆菌(E. coli)感受态细胞BL21(DE3),使用IPTG诱导重组蛋白表达,钴胶纯化重组蛋白,纯化的重组蛋白免疫小鼠制备鼠抗重组中华大蟾蜍EDF-1的抗血清,然后通过Western-blot和ELISA检测抗血清的特异性及其效价.重组中华大蟾蜍EDF-1得到良好表达,抗血清特异性良好,效价为1∶8 000.为进一步研究EDF-1的生物学功能奠定基础,同时为研发抑制内皮细胞分化相关的抗肿瘤药物提供重要参考.

蟾酥为蟾蜍科动物中华大蟾蜍Bufo bufo gargarizans或黑眶蟾蜍B.melanostictus耳后腺及皮肤腺的干燥分泌物.目前商品蟾酥质量问题突出,混伪、掺假现象普遍存在.亟需构建科学完善的质量控制方法,以提升蟾酥药材、饮片及其中成药制剂的质量控制水平,保障临床用药安全有效.该研究采用高效液相色谱法建立蟾酥药材的特征图谱,采用一测多评法(QAMS)测定5种主要蟾毒配基的含量.通过不同批次市售蟾酥样品的分析,建立了以五羟色胺、日蟾毒它灵、沙蟾毒精、嚏根草配基、远华蟾毒精、蟾毒它灵、华蟾毒它灵、蟾毒灵、华蟾酥毒基和脂蟾毒配基为特征峰的对照特征图谱;建立了以华蟾酥毒基为内参物,同步测定蟾酥药材中5种蟾毒配基含量的一测多评法,并对相对校正因子(RCF)的耐用性和系统适用性进行了系统研究.华蟾酥毒基对日蟾毒它灵、蟾毒它灵、蟾毒灵和脂蟾毒配基的RCF分别为1.05,0.895,1.09,0.913.建立的特征图谱和QAMS法,可以有效控制蟾酥药材的质量,为2020年版《中国药典》蟾酥药材质量标准的完善与提高提供参考.

以黄河下游地区封丘县为研究区,在地理信息系统和R软件的支持下,在栖息地水平和景观水平上,分析了两栖类生物分布与栖息地变量(池塘水体溶解氧DO、电导率COND、浊度TURB、水体氨氮NH3-N、池塘内植被盖度VEGinterior、池塘内挺水植物盖度EMER、池塘边缘植被盖度VEGedge、两栖类幼虫捕食者PRE和池塘面积AREA)和采样点池塘250、500、1000、2000 m半径缓冲区内景观变量(池塘面积AP、与最近道路的距离DR、耕地面积AF、林地面积AW、Shannon多样性指数SHDI和蔓延度指数CONTAG)的关系.结果表明:中华大蟾蜍的分布主要与栖息地变量中的PRE和较大缓冲区半径内的景观变量(AW2000、DR2000、SHDI 1000、CONTAG1000)相关;黑斑侧褶蛙的分布与栖息地变量中的EMER和较小缓冲区半径内的景观变量(SHDI500)关系密切;金线侧褶蛙的分布主要与栖息地变量中的VEGinterior和PRE相关;泽陆蛙的分布主要与较大缓冲区半径内的景观变量(AF2000、SHDI2000)相关;两栖类生物总体上主要与栖息地变量中的EMER和较小缓冲区半径内的景观变量(SH DI500)相关.在农业景观中,保护两栖类生物应该保护永久性和半永久性池塘、提高池塘内部植被盖度、增强栖息地池塘之间的功能连通性.