目的 克隆获得丹参SmCYP76S7 基因序列,并对其进行生物信息学和表达特性分析.方法 克隆获得SmCYP76S7的 cDNA 及基因组 DNA 序列,运用生物信息学软件对该基因及其编码蛋白进行结构和理化性质分析.构建融合表达载体pEGAD-SmCYP76S7-eGFP,转化烟草后分析SmCYP76S7 蛋白的亚细胞定位.利用qRT-PCR测定SmCYP76S7 基因在各器官中的表达量,同时分别利用不同光质和茉莉酸甲酯(methyl jasmonate,MeJA)处理丹参幼苗和丹参毛状根,探究SmCYP76S7基因对光质和MeJA的响应.结果 SmCYP76S7 基因包含 2个外显子和 1 个 1 506 bp的开放阅读框,编码 501 个氨基酸.该基因在根、茎、叶和花中均有表达,其中花中表达量最低.SmCYP76S7 蛋白除定位于内质网外,还分布于多个细胞结构.SmCYP76S7 基因的表达在红光处理和MeJA处理样品中显著上调,是典型的光和MeJA诱导基因.结论 SmCYP76S7 基因是CYP76 家族成员,结合其表达特性和同家族其他成员的催化活性,该蛋白很可能参与丹参酮类成分的生物合成,其具体的生物学作用值得进一步深入挖掘.

植物毛状根是药用成分的天然优质原料,具有生长快速、生产时间短、次生代谢产物产量高、遗传稳定等优点,目前利用毛状根技术高效生产药用原料和改良药用植物品质已经成为研究热点.该文总结了与毛状根中药用成分合成途径及其调控方式相关的研究资料,发现目前提高药用植物毛状根中次生代谢物含量的途径一是改变毛状根的外在培养条件,二是对毛状根内在的次生代谢物生物合成通路进行调控;而有关毛状根次生物质代谢合成调控机制的研究主要集中于双子叶草本植物中,以研究生物碱类、黄酮类、皂苷类、萜类、苯丙素类和蒽醌类药用活性成分生物合成的调控机制为主,其中对丹参毛状根中丹参酮和甘草毛状根中甘草酸的生物合成调控机制进行了深入研究.该综述主要从调控毛状根药用成分生物合成的关键酶基因、转录因子以及新颖分子调控因子三个方面进行了系统总结,为药用植物毛状根次生代谢产物合成调控与生产提供参考.

目的 考察生物诱导子酵母提取物(YE)和非生物诱导子银离子(Ag+)复合诱导子对不同处理时间丹参毛状根生长量和初次生代谢产物积累的综合性影响.方法 在继代培养21d的丹参毛状根中添加YE+Ag+复合诱导子,分别测定诱导后0、2、4、6、8、10 d后丹参毛状根的生长量,采用紫外分光光度法和超高效液相色谱法测定丹参毛状根体内初次生代谢产物的含量.结果 在实验浓度条件下,与空白对照组相比,YE+Ag+对毛状根生长有明显的抑制作用,且抑制了初生代谢产物总糖和总蛋白的积累.YE+Ag+明显促进了毛状根中次生代谢产物总酚酸类和总丹参酮类的积累,其中咖啡酸、迷迭香酸、丹酚酸B、二氢丹参酮I、丹参酮ⅡA和隐丹参酮含量分别为空白对照组的2.22、7.47、2.39、32.15、7.65和52.89倍.结论 YE+Ag+协同作用抑制丹参毛状根的生长,同时对不同成分的积累具有不同的影响,抑制初生代谢产物的积累,促进次生代谢产物的积累.

蛋白质复合物参与植物多种次生代谢物的合成,其分离对阐明植物次生代谢及提高体外催化效率至关重要.该研究构建了过表达丹参酮合成途径关键酶CYP76AH1的转基因毛状根株系,通过Western杂交筛选得到高表达CYP76AH1蛋白的丹参转基因毛状根,并以此作为后续提取丹参酮合成途径中蛋白质复合物的组培材料.通过优化蛋白提取缓冲液中的去污剂种类和浓度,筛选出含0.5％ Triton X-100的缓冲液为最佳提取缓冲液,并分离得到相对大量的可溶性CYP76AH1蛋白质.该研究为后续进一步分离纯化与CYP76AH1相互作用的蛋白质复合物奠定了基础,也为深度解析丹参酮合成代谢通路提供思路.

目的:利用土培植物进行原位侵染获得RNAi型丹参毛状根,并对其干扰效果进行研究.方法:利用转化有目标基因RNAi载体的发根农杆菌对土壤中生长的丹参幼苗根茎部分进行侵染产生毛状根,经荧光显微镜鉴定阳性毛状根,并利用实时荧光定量PCR检测目标基因的表达情况.结果:在土培丹参根茎部分成功侵染产生毛状根,利用荧光显微镜进行检测显示目标基因RNAi型毛状根阳性转化率为72.72%,RNAi空载毛状根阳性转化率为66.67%.实时荧光定量PCR结果表明RNAi型毛状根中目标基因表达受到抑制,表达量下降到空载型对照组的8.61%,证明对土培植物直接进行侵染能够成功诱导RNAi毛状根.结论:采用原位侵染法诱导丹参根茎部位成功产生阳性RNAi型毛状根,侵染过程无需无菌操作,简单快捷,对植株生长无影响,能够用于功能基因的体内功能研究.

为构建高质量的丹参cDNA文库以及通过酵母双杂交获得丹参SrnJAZ8互作蛋白基因.研究以丹参的根、茎、叶、花、毛状根为材料,利用SMART(switching mechanism at 5'end of RNA transcript)方式合成全长cDNA,并结合基于双链的特异性核酸酶(duplex-specific nuclease,DSN)均一化技术,构建丹参的均一化全长cDNA文库.通过文库鉴定,检测到cDNA文库库容为1.45 × 106,重组率为100％,插入片段平均大小为500 ～2 000 bp.构建pDEST-pGADT7-SmJAZ8重组载体,将该载体转化Y2HGold菌种,通过酵母双杂交进行互作蛋白的筛选,最终筛选到了丹参DnaJ蛋白和UBQ蛋白.该研究既成功构建了丹参均一化全长cDNA文库,又为后续丹参功能基因筛选和基因功能的研究奠定了基础.

目的:验证氯化镧诱导丹参毛状根活性物质积累的信号分子.方法:采用HPLC法测定丹参毛状根中活性物质含量;采用“loss and gain”策略对信号分子进行验证.结果:茉莉酸甲酯对镧的响应规律与丹参毛状根中活性物质对镧元素响应规律相符且对丹参毛状根活性物质积累起促进作用;经茉莉酸甲酯淬灭剂和抑制剂处理验证发现,抑制剂和淬灭剂对丹参毛状根中活性物质积累起抑制作用,而抑制剂与氯化镧同时处理能逆转抑制剂对活性物质的抑制作用.结论:茉莉酸甲酯是氯化镧诱导丹参毛状根活性物质积累的信号分子,但不是唯一的信号分子.

研究茉莉酸甲酯对丹参毛状根中次生代谢产物含量的影响,为丹参毛状根培养的生产应用提供实验依据.以茉莉酸甲酯作为丹参毛状根的诱导子,进行丹参毛状根诱导培养.发现茉莉酸甲酯诱导的丹参毛状根的丹参酮类化合物丹参酮Ⅰ和丹参酮ⅡA分别是无茉莉酸甲酯诱导的1.53倍和1.16倍,酚酸类化合物迷迭香酸和丹酚酸B分别是无茉莉酸甲酯诱导的1.37倍和4.43倍.茉莉酸甲酯能显著提高丹参毛状根次生代谢产物的合成和积累,通过茉莉酸甲酯诱导实现丹参有效次生代谢产物的高效生产.

丹参酮是中药丹参的主要有效成分,其生物合成途径表明细胞色素CYP450酶在丹参酮生物合成途径结构后修饰过程中发挥着重要作用.长链非编码RNA(lncRNA)是一类长度大于200 nt的核苷酸,对药用植物的生长发育、次生代谢等具有重要调控作用.该研究通过对丹参毛状根进行诱导,利用高通量测序构建其长链非编码RNA文库,共获得8 942个差异lncRNA,其中6 755个基因间lncRNA,并鉴定出1 115 814个lncRNA-靶基因对,包括122个lncRNA-靶基因顺式对.对差异lncRNA与CYP450进行相关性分析,共鉴定出16 249个lncRNA-CYP450靶基因对.将其与丹参酮生物合成途径CYP76AH1,CYP76AH3,CYP76AK1基因进行靶向相关性分析,得到216个靶基因,这些候选基因为丹参酮生物合成途径下游调控机制研究奠定基础.

目的:丹参(Salvia miltiorrhiza)根中所含的丹参酮为二萜醌类化合物,而鉴定参与丹参酮合成的CYP450基因成为解析丹参酮生物合成途径分子机制的关键步骤.方法:本实验从丹参基因组和转录组数据中筛选到SmCYP81C16基因,采用RT-PCR方法克隆获得基因cDNA全长序列,利用生物信息学分析方法分析其所编码蛋白质的理化性质,预测该蛋白质二级结构、保守结构域等,建立系统发育进化树;利用实时荧光定量PCR方法检测了该基因的组织/器官表达特异性;通过遗传转化方法获得了该基因的过表达转基因毛状根株系,通过化学检测及代谢组学分析丹参酮类化合物在对照株系和过表达株系中的含量变化.利用实时荧光定量PCR方法检测了毛状根中丹参酮合成途径关键酶基因中的相对表达量.结果:SmCYP81C16基因全长1497 bp,编码498个氨基酸残基,该蛋白质相对分子质量为55.8 kDa;SmCYP81C16在丹参茎和根的周皮部高表达;通过化学检测及代谢组学分析发现,与对照株系比较,在SmCYP81C16过表达阳性株系中,丹参酮类化合物的含量升高;过表达毛状根中丹参酮合成途径关键酶基因的表达量显著上升.结论:本研究结果表明SmCYP81C16具有正向调控丹参酮生物合成的功能.本研究为利用生物技术方法提高丹参酮类化合物含量奠定基础.