目的:利用土培植物进行原位侵染获得RNAi型丹参毛状根,并对其干扰效果进行研究.方法:利用转化有目标基因RNAi载体的发根农杆菌对土壤中生长的丹参幼苗根茎部分进行侵染产生毛状根,经荧光显微镜鉴定阳性毛状根,并利用实时荧光定量PCR检测目标基因的表达情况.结果:在土培丹参根茎部分成功侵染产生毛状根,利用荧光显微镜进行检测显示目标基因RNAi型毛状根阳性转化率为72.72%,RNAi空载毛状根阳性转化率为66.67%.实时荧光定量PCR结果表明RNAi型毛状根中目标基因表达受到抑制,表达量下降到空载型对照组的8.61%,证明对土培植物直接进行侵染能够成功诱导RNAi毛状根.结论:采用原位侵染法诱导丹参根茎部位成功产生阳性RNAi型毛状根,侵染过程无需无菌操作,简单快捷,对植株生长无影响,能够用于功能基因的体内功能研究.

[背景]大豆疫霉根腐病作为大豆生产上的一种毁灭性病害已被美国、加拿大等多国报道,其病原菌大豆疫霉(Phtophthora sojae Kaufmann and Gerdemann)为典型的土传病原菌.近年来,土传病原菌与植物根系的互作成为研究土传病原菌寄主选择机制的主要方向.[目的]探究寄主大豆和非寄主菜豆根及根分泌物对大豆疫霉的不同影响,阐明这种影响与大豆疫霉对寄主选择的关系.[方法]应用原位土培法种植大豆疫霉感病品种Sloan、抗病品种Williams82和非寄主菜豆一点红,测定了单个大豆疫霉游动孢子对寄主大豆和非寄主菜豆幼根的侵染行为,收集了寄主及非寄主根分泌物,测定了根分泌物对大豆疫霉游动孢子的趋化作用,包括吸引游动孢子的能力以及对游动孢子成囊、孢囊萌发和芽管生长的影响.[结果]大豆疫霉单个游动孢子对寄主大豆幼根表现强烈趋向性,沿着根面进行多次试探性接触后在根尖伸长区快速成囊并萌发,产生的芽管顶端贴附在幼根表面,在感病大豆品种根面上的芽管比抗病大豆品种上的短且粗,而对非寄主菜豆幼根则不具有趋向性,接触一次后即远离,最终在距离幼根75 μm的位置成囊萌发,且芽管生长不具有方向性.此外,大豆疫霉游动孢子对抗病、感病大豆和非寄主菜豆幼根的侵染行为差异完全在根分泌物试验中重现,即寄主大豆根分泌物对大豆疫霉游动孢子具有较强的趋向作用,能够有效吸引游动孢子,促进游动孢子快速成囊及萌发,抑制芽管的伸长,而非寄主菜豆根分泌物不具有上述作用.[结论]大豆疫霉对寄主的选择性与根分泌物有关,为进一步了解大豆疫霉的寄主选择机制提供理论依据.

HbWRKY是橡胶树中的一类转录因子基因家族,该家族基因编码的蛋白质参与橡胶树的产胶、衰老和抗逆胁迫等生理生化过程,植物激素类物质刺激(如乙烯利、茉莉酸、水杨酸等)、病原菌侵染和机械伤害均能诱导HbWRKYs基因的表达.目前,该基因家族的大部分基因已被克隆和分析,但这些基因在染色体上的具体位置尚未确定.本研究以巴西橡胶树热研7-33-97品系为材料,利用荧光原位杂交技术(FISH)和原位PCR技术对Hb WRKYs基因家族中10个成员(HbWRKY1、HbWRKY2、HbWRKY3、HbWRKY4、HbWRKY5、HbWRKY7、HbWRKY9、HbWRKY11、HbWRKY27和HbWRKY7)进行了物理定位分析.结果表明:HbWRKY1、HbWRKY4和HbWRKY5基因同时定位在第9号染色体上,其中HbWRKY1和HbWRKY4在第9号染色体短臂上,其信号位点距离着丝粒的平均百分距分别为57.38和4.57,Hb WRKY5在第9号染色体长臂上,其信号位点距离着丝粒的平均百分距为31.67;HbWRKY2、HbWRKY3、HbWRKY7、HbWRKY9、HbWRKY11和HbWRKY75基因分别定位在第8、3、4、10、2和7号染色体的短臂上,信号位点距离着丝粒的平均百分距分别为6.00、12.30、4.40、45.21、5.74和26.11;HbWRKY27基因定位在第6号染色体长臂上,其信号位点距离着丝粒的平均百分距为38.88.本研究还讨论了这些基因与其他已定位基因之间的位置关系.

冬虫夏草是一种具有极高药用和食用价值的珍稀菌类,其生物学特性和可持续发展关键技术一直是冬虫夏草研究关注的重点.总结了冬虫夏草生物学及生态学中的几个重要科学问题,包括冬虫夏草菌侵染蝙蝠蛾幼虫的途径及机制、冬虫夏草菌子实体形成及生长过程中的关键调控因子、冬虫夏草菌遗传多样性及基因组学研究、天然冬虫夏草及其微环境中的微生物群落组成、全球变暖背景下未来青藏高原地区的气候变化对冬虫夏草资源的影响等的研究进展,并分析了现有研究中尚未明确和不足之处.未来在冬虫夏草生物学及生态学的研究中,需要利用和研发更加先进的观测设备及试验方法,以实现天然冬虫夏草发生发育的原位观测和机理研究;充分利用冬虫夏草人工培植技术,结合分子生物学研究,从基因水平上揭示冬虫夏草菌生态适应性及侵染蝙蝠蛾幼虫的机理;建立冬虫夏草科学研究基地,开展长期定位观测试验并结合生态学模型构建明确未来气候变化对冬虫夏草资源的影响,以期进一步深入冬虫夏草生物学和生态学研究、推进我国冬虫夏草资源的合理利用及可持续发展的政策制定.

磷酸烯醇丙酮酸羧化酶激酶相关激酶(PEPRKs)在橡胶树中参与乙烯信号传导的相关反应,还与叶片发育、真菌侵染和低温胁迫有一定的相关性.本研究以巴西橡胶树无性系‘热研7-33-97’品种为材料,利用荧光原位杂交技术(FISH)对PEPRK基因家族中个成员(PEEPRK1,PEPRK2,PEPRK3,PEPRK4和PEPRK5)进行了物理定位分析.结果 表明:HbPEPRK1和HbPEPRK3基因同时定位在巴西橡胶树4号染色体长臂上,其信号位点到着丝粒的平均百分距分别为15.49、31.07;HbPEPRK2、HbPEPRK4和HbPEPRK5基因分别定位在巴西橡胶树5、6和7号染色体的长臂上,信号位点距离着丝粒的平均百分距分别为30.31、19.75和40.32.并讨论了这些基因与其他定位的基因之间的位置关系.为橡胶树分子辅助育种和比较基因组学研究提供有用的科学依据.

[背景]orf3位于猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)s基因与e基因之间,是目前发现的PEDV唯一一个附属基因,编码附属蛋白(ORF3蛋白).我们前期研究初步发现ORF3蛋白对PEDV诱导的细胞凋亡有影响.[目的]研究ORF3蛋白在PEDV侵染复制过程中的毒力作用机制.[方法]实验用3种PEDV: rDR13att-△ORF3 (orf3基因全部敲除)、DR 13-ORF3att(携带有C端截短orf3)、rDR13att-ORF3wt(携带全长orf3基因)感染Vero细胞,观察病变情况,再用活细胞成像仪、流式细胞仪、DNA断裂的原位末端标记法[terminal deoxynucleotidyl transferase (TDT)-mediated dUTP nick end labeling,TUNEL]等方法检测不同感染时间点的细胞凋亡情况,然后用蛋白质印迹方法分析PEDV感染宿主细胞中主要凋亡相关蛋白(如Caspase-3)的活化或裂解,最后进行转录组测序研究病毒感染细胞中差异基因的表达情况,再用荧光定量PCR验证转录组结果.[结果]rDR13att-△ORF3引起较多的细胞病变,活细胞成像仪的动态观察结果显示,3种病毒侵染的细胞凋亡水平随着时间的延长均高于正常阴性细胞,但敲除orf3的病毒感染细胞后细胞凋亡率比其他两种病毒更高;敲除orf3病毒感染细胞凋亡率显著高于其他两种病毒;病毒rDR 13 att-△ORF3感染细胞后TUNEL阳性细胞数比DR 13-ORF3att和rDR 13atty-ORF3wt更多;表达ORF3蛋白的重组PEDV可以抑制Caspase-3的活化;ORF3蛋白对受感染细胞Heat shock 70 kD protein 1B (HSP70)基因转录有促进作用,荧光定量PCR结果表明rDR13att-ORF3wt感染细胞的HSP70表达量高于rDR13att-△ORF3感染细胞.[结论]PEDV通过ORF3蛋白抑制细胞凋亡,而且这种作用可能是通过抑制Caspase-3的活化或增加HSP70的产生来完成的.

土传青枯病是最严重的细菌性病害之一,专性侵染细菌的病毒——噬菌体在青枯病的防控中发挥重要作用.前期研究发现不同地区的青枯菌在遗传型和生理型上呈现高度多态性,但噬菌体宿主专一性强,对来自同一地方的青枯菌的侵染能力较强.拟针对特定地区的病原青枯菌,从原位筛选高效稳定的噬菌体,并探究其抑菌的稳定性.以分离自南京麒麟大棚的一株病原青枯菌为宿主,从同一地区病土中筛选其专性噬菌体;并从中筛选出一株抑菌能力最强的噬菌体NJ-P3,室内检测了其基础生物学特性、稳定性和最佳保存方式,盆栽试验探究其最佳应用方式.噬菌体NJ-P3属于裂解性短尾噬菌体,基因组中含有特殊的蛋白可能与其强裂解性相关;抗逆性强,能够耐受50℃高温、4-10的pH、紫外线80 min的照射;在SM缓冲液中低温保存效果稳定,常温条件可短期保存;盆栽试验结果表明与传统灌根法相比,茎部注射方式接种噬菌体NJ-P3应用效果更好,对土传青枯病的防控效果提高了37.5％.从原位筛选到一株高效稳定的青枯菌专性噬菌体,系统地研究了其最佳保存条件和应用方式,为建立青枯菌噬菌体资源库防控土传病害的广泛应用奠定理论基础.

[目的]Mesorh izob ium huakuii 7653R的MCHK _1326基因编码一种外膜孔蛋白,可能参与根瘤菌侵染宿主植物以及结瘤固氮过程,本研究旨在探索该基因在共生固氮中的功能.[方法]生物信息学分析MCHK _1326蛋白的结构特征及生物学功能,启动子原位表达技术检测MCHK_1326共生时空表达特征,利用Cre-loxp系统构建MCHK_1326缺失突变株,考察其共生固氮表型及早期侵染事件,通过植物盆栽并额外添加无机氮源,检测突变株接种紫云英后的共生固氮表型变化.[结果]MCHK_1326基因在侵染早期如侵染线的延伸等过程中表达,在成熟根瘤的侵染区表达,与野生型相比,突变体△1326侵染线和根瘤原基数量显著减少;植株地上部分鲜重与固氮酶活性极显著降低,根瘤数量和根瘤重量显著降低;额外添加无机氮源能恢复其共生缺陷表型.[结论]MCHK_1326基因参与根瘤菌早期侵染和结瘤,在根瘤发育与共生固氮过程中发挥作用.

解决茶树缺乏高效、稳定的遗传转化体系问题,建立了一种基于根癌农杆菌介导的茶树原位转化转基因方法,为茶树基因功能研究和种质创新奠定坚实的基础.以茶树品种'铁观音'、'白叶1号'和'龙井43'的实生幼苗为受体材料,进行去顶芽和腋芽处理.利用根癌农杆菌菌液侵染实生苗伤口,通过抗性筛选获得再生芽,经分子生物学鉴定后,采用短穗扦插法获得茶树转基因植株.结果表明,再生芽中GUS(β-glucuronidase)和HYG(hygromycin)标记基因经多次PCR检测均为阳性,经测序验证PCR产物序列与标记基因序列一致.'铁观音'、'白叶1号'和'龙井43'的转化率分别为8.14％、2.99％和2.53％.建立了不依赖茶树组织培养的原位转化转基因体系,具有操作简便、转化率高、成本低、试验周期短的特点.

抗生素的大量使用和滥用造成细菌耐药性问题愈发严峻,噬菌体疗法作为一种精准治疗多重耐药病原菌的有效方法开始被人们日益重视.采用双层琼脂平板法从活性污泥中分离出多重耐药福氏志贺菌(Shigella flexneri)噬菌体P003,鉴定为肌尾噬菌体科(Myoviridae).通过生物学特性测定表明P003的最佳感染复数为10,潜伏期约10 min;在4-70℃、pH 3.0-10.0的条件下保持活性.全基因组测序表明,噬菌体基因组长约68721 bp,GC含量46.14％,预测编码99个开放阅读框(open reading frame,ORF),未发现已知耐药基因和毒力基因.全基因组多序列线性与进化树分析结果表明,P003与大肠杆菌噬菌体有较近的亲缘关系,但不能侵染大肠杆菌.从活性污泥原位分离到一株新的多重耐药福氏志贺菌噬菌体P003,为利用噬菌体疗法防治多重耐药病原菌S.flexneri感染提供了新的菌种资源.