目的:研究槲皮素体外抗呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus，RSV）的作用，为新型抗呼吸道合胞病毒中药开发提供基础研究数据。方法:根据细胞毒性实验确定槲皮素的最大工作浓度，采用病毒滴度TCID 50检测法、细胞毒性检测法、Western blot和实时荧光定量PCR（qPCR）方法检测槲皮素体外对RSV的增殖、蛋白表达和基因转录抑制效果。采用RNA干扰敲低HSP70表达水平，检测病毒的生长曲线。 结果:槲皮素对Vero细胞的毒性呈现明显的梯度依赖效应，最大无毒浓度为25 μM，且12 μM的槲皮素浓度下，细胞上清中病毒滴度抑制率达60%；同时Western blot结果显示槲皮素处理的细胞中病毒F蛋白受到显著抑制；qPCR对细胞中RSV G蛋白的转录本的检测结果表明槲皮素使病毒G蛋白的转录效率下降了85%以上。敲低HSP70的表达水平后，病毒的滴度下降了两个数量级。结论:槲皮素体外对RSV-A有较好的抗病毒作用，且可能是通过抑制其特异性底物HSP70实现的。

目的:探讨应用RNAi技术降低神经纤毛蛋白-2（NRP-2）表达后对结肠癌细胞HCT-8增殖和凋亡的影响。方法:通过脂质体lip2000分别将NRP2-siRNA和NControl-siRNA转染入HCT-8中作为转染组和阴性对照组，加入磷酸盐缓冲液作为空白对照组，通过实时荧光定量PCR（RT-qPCR）和Western印迹法验证转染效果，采用细胞计数试剂盒（CCK）法、平板克隆实验和Ki-67蛋白染色实验检测3组细胞的增殖情况，吖啶橙/碘化丙啶（AO/PI）荧光染色实验检测3组细胞的凋亡情况。结果:RT-qPCR和Western印迹法结果表明转染组细胞NRP-2 mRNA相对表达量和NRP-2蛋白含量降低（0.46±0.05比0.99±0.05和1.00±0.06，1.04±0.06比1.73±0.09和1.65±0.11）（均 P<0.05），CCK法表明，转染组各时段的增殖能力较阴性对照组和空白对照组显著降低（24 h为0.53±0.04比0.82±0.07和0.87±0.07，48 h为0.54±0.05比1.00±0.09和1.17±0.05，72 h为0.75±0.05比1.31±0.13和1.50±0.03，96 h为1.05±0.04比1.46±0.09和1.86±0.06）（均 P<0.05）；平板克隆实验显示转染组细胞较其他两组克隆形成能力显著下降（134.67±8.74比245.33±19.14和300.33±14.01， P<0.05）；Ki-67蛋白检测显示与对照组相比，转染组的细胞Ki-67含量显著下降（5.93±0.22比8.36±0.09和8.70±0.21， P<0.05）；AO/PI实验显示转染组较对照组相比凋亡细胞/活细胞比例显著上升（0.43±0.07比0.14±0.04和0.11±0.04， P<0.05）。 结论:降低NRP-2表达可使结肠癌细胞HCT-8的增殖能力下降，凋亡能力上升。

目的:构建同时表达神经纤毛蛋白质1(NRP-1)和存活素(Survivin)双基因的短发夹RNA(shRNA)真核表达质粒，通过体内外实验，观察其对鼻咽癌细胞CNE-2Z生长增殖的影响。方法:构建同时表达NRP-1和Survivin双基因的质粒(Plasmid-1)，并构建单独表达NRP-1和Survivin基因质粒(分别为Plasmid-2、Plasmid-3)。转染入鼻咽癌CNE-2Z细胞株，于荧光显微镜观察质粒转染及表达情况；以噻唑蓝(MTT)法检测细胞增殖能力；定量聚合酶链反应(PCR)及免疫印迹法(Western blot)在mRNA水平和蛋白水平上检测目的基因抑制作用。建立稳定转染裸鼠移植瘤模型，体内裸鼠成瘤实验观察质粒对肿瘤的抑制效果。原位缺口末端标记法(TUNEL)法检测移植瘤细胞凋亡率。多组间比较采用单因素方差分析。结果:通过测序证实重组shRNA真核表达载体构建成功。各重组质粒表达载体成功转染CNE-2Z细胞，可见大量的癌细胞表达绿色荧光。MTT显示细胞增殖受到抑制，且双基因干扰质粒对细胞增殖的抑制作用明显强于单基因干扰质粒，差异有统计学意义(0.209±0.021比0.392±0.013、0.384±0.014， F＝354.121， P<0.05)。反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)证实双基因联合沉默组和单基因沉默组均能有效抑制目的基因mRNA表达，双基因组NRP-1 mRNA(0.20±0.06)表达明显低于NRP-1单基因组(0.27±0.05)，差异有统计学意义( F＝198.437， P<0.05)；双基因组Survivin mRNA表达(0.13±0.02)明显低于Survivin单基因组(0.17±0.01)，差异有统计学意义( F＝245.647， P<0.05)。Western blot检测结果双基因组对NRP-1和Survivin蛋白的表达抑制率分别为67.41%和79.24%，与单基因组比较均有统计学意义( F＝129.354、216.411， P<0.05)。体内抑瘤实验证实，与NRP-1单基因干扰组[(0.628±0.013) cm 3]、Survivin单基因干扰组[(0.601±0.301) cm 3]比较，双基因干扰组[(0.205±0.002) cm 3]瘤体积生长明显受到抑制，差异有统计学意义( F＝49.214， P<0.05)，抑瘤率为81.71%。TUNEL实验表明双基因干扰组凋亡指数[(49.84±1.98)%]，显著高于NRP-1单基因组[(21.53±2.01)%， P<0.05]和Survivin单基因组[(19.91±2.11)%]，差异有统计学意义( F＝254.130， P<0.05)。 结论:同时表达两个不同基因的shRNA质粒载体转染鼻咽癌细胞后，可同时敲降NRP-1和survivin基因表达，与单个基因沉默比较，可以更好的促进细胞凋亡，抑制细胞生长增殖。

目的:构建大鼠RNAi-腺苷A2a受体(A2aR)慢病毒载体并进行鉴定。方法:首先构建3对短发夹RNA(shRNA)-A2aR序列(shRNA-A2aR 1、shRNA-A2aR 2、shRNA-A2aR 3)，在shRNA慢病毒载体中分别插入3对双链shRNA oligo，shRNA慢病毒重组质粒构建成功后，将重组质粒、包装载体、穿梭载体共转染293T细胞，从而获得病毒液。实验Ⅰ　采用随机数字表法将大鼠原代心肌细胞分为3组( n＝6)：空载组(V组)、shRNA-A2aR 1组和shRNA-A2aR 3组，各组分别转染MOI为10的相应病毒液，转染48 h时，Western blot法检测A2aR表达水平，确定干扰效率，以筛选最佳慢病毒载体。实验Ⅱ　采用随机数字表法将大鼠原代心肌细胞分为5组( n＝36)：空载组(V组)、MOI5组、MOI10组、MOI15组和MOI20组，各组分别转染相应MOI的病毒液(最佳慢病毒载体)，于转染24、48和72 h时，采用CCK-8法测定细胞存活率，荧光显微镜下观察细胞活力和细胞死亡情况，Western blot法检测A2aR表达水平，确定干扰效率。 结果:实验Ⅰ　成功构建了2种shRNA-A2aR慢病毒载体(shRNA-A2aR 1、3)。shRNA-A2aR 3病毒液滴度为3.5×10 8 TU/ml。与V组和shRNA-A2aR 1组比较，shRNA-A2aR 3组心肌细胞A2aR表达下调( P<0.01)，shRNA-A2aR 3慢病毒载体干扰效率73%。实验Ⅱ　选择shRNA-A2aR 3慢病毒载体转染24 h时，各组细胞存活率均>85%；转染48 h时，MOI5组和MOI10组细胞存活率>80%；转染72 h各组细胞存活率<70%。倒置荧光显微镜下可见，MOI5组荧光密度稍低，MOI10组转染48 h及MOI20组转染24 h时，荧光密度较高且细胞状态较好；转染72 h时各组心肌细胞活力明显下降、死亡细胞增加。Western blot显示：MOI10组转染48 h、MOI15组转染48 h、MOI20组转染24和48 h时干扰效率均>70%。 结论:成功构建了大鼠shRNA-A2aR慢病毒载体，且MOI为10、转染48 h或MOI为20、转染24 h为最佳转染方案。

目的:观察缺氧缺糖条件下谷氨酸(AMPA)受体相互作用蛋白(GRIPs)表达的变化及对少突胶质前体细胞(OPCs)凋亡的影响，探讨GRIPs在AMPA受体兴奋性毒性中的作用。方法:OPCs分为对照组、缺氧缺糖60 min组和缺氧缺糖120 min组，通过实时荧光定量PCR及蛋白印迹法(Western blot)检测缺氧缺糖条件下GRIP1、GRIP2 mRNA和蛋白的表达情况；再次将OPCs分为空白对照组、OPCs＋缺氧缺糖组、OPCs＋环磷酸腺苷(cAMP)＋缺氧缺糖组、OPCs＋cAMP＋缺氧缺糖＋GRIP1小干扰RNA(siRNA)组、OPCs＋cAMP＋缺氧缺糖＋GRIP1 siRNA阴性对照组、OPCs＋cAMP＋缺氧缺糖＋GRIP2 siRNA组、OPCs＋cAMP＋缺氧缺糖＋GRIP2 siRNA阴性对照组，TUNEL试剂盒检测各组细胞凋亡情况，Fluo-4荧光探针观察胞内游离钙变化。结果:缺氧缺糖引起OPCs损伤，光学显微镜下显示细胞轮廓不清晰，胞体回缩。缺氧缺糖60 min后GRIP1(1.233±0.060比1.003±0.079， P<0.05)和GRIP2(1.396±0.069比1.001±0.037， P<0.05)表达明显高于对照组，且缺氧缺糖时间越长，GRIP1(1.416±0.064比1.233±0.060， P<0.01)和GRIP2(1.680±0.018比1.396±0.069， P<0.01)表达水平越高。RNAi分别下调GRIP1和GRIP2，细胞内游离钙离子水平降低(0.054±0.003比0.074±0.003， P<0.01；0.060±0.003比0.074±0.003， P<0.01)，细胞凋亡率下降[(20.703±3.882)%比(11.470±1.679)%， P<0.05；(19.070±1.106)%比(14.448±0.849)%， P<0.01]。 结论:GRIP1和GRIP2参与缺氧缺糖引起的OPCs损伤，其可能通过调节Ca 2＋通透性触发AMPA受体介导的兴奋性毒性发挥作用。

目的:探讨Ras超家族亚群A(RhoA)/Rho关联含卷曲螺旋结合蛋白激酶1(Rock-1)在无机磷酸盐中诱导大鼠瓣膜间质细胞(VICs)成骨分化的作用机制。方法:取8只雄性大鼠(购自上海西普尔必凯动物实验有限公司)的主动脉瓣膜消化培养至第3代后免疫荧光鉴定。小干扰RNA(siRNA)-RhoA转染VICs后用无机磷酸盐成骨培养基(IP-OIM)分别诱导转染组(RNAi)，阴性对照组(NC)及空白对照组(CON)的成骨分化，并通过蛋白质印迹法(Western blot)与聚合酶链反应(PCR)评估转染后RhoA、Rock-1、Runt相关转录因子2(Runx-2)及骨钙素(OST)的变化；7 d行碱性磷酸酶(ALP)活性相关检测，14 d行钙含量相关检测评估其早期与晚期成骨分化趋势。用IP-OIM刺激转染后的VICs 60 min，并通过Western blot检测SMAD1/5/9的磷酸化变化。采用单因素方差分析。结果:鉴定后的VICs转染siRNA-RhoA并用IP-OIM培养，经过Western blot及PCR检测后可知RNAi的RhoA(Western blot：0.330±0.020；PCR：0.357±0.060)及Rock-1(Western blot：0.366±0.020；PCR：0.383±0.040)比CON均出现表达下调(RhoA Western blot： t＝36.680， P<0.05 PCR： t＝10.610， P<0.05；Rock-1 Western blot： t＝31.240， P<0.05 PCR： t＝13.210， P<0.05)，差异有统计学意义，RNAi的OST(Western blot：0.520±0.030；PCR：0.510±0.070)和Runx-2(Western blot：0.573±0.020；PCR：0.57±0.060)比CON也出现了下降(OST Western blot： t＝16.630， P<0.05；PCR： t＝6.970， P<0.05；Runx-2 Western blot： t＝21.040， P<0.05；PCR： t＝6.710， P<0.05)，差异有统计学意义。在7 d的ALP染色中RNAi的颜色最浅，ALP活性检测中RNAi [(1.005±0.101) U/mg]活性比较NC[(2.042±0.116) U/mg]和CON[(1.931±0.136) U/mg]明显下降( t＝10.570， P<0.05； t＝9.400， P<0.05)，差异有统计学意义。在14 d的相对钙含量测定中RNAi[(22.290±1.981) ng/L]钙含量比较NC[(41.100±2.440) ng/L]和CON[(41.760±1.215) ng/L]明显下降( t＝10.530， P<0.05； t＝14.510， P<0.05)，差异有统计学意义；同样茜素红钙沉积染色中，也是RNAi颜色最浅。经IP-OIM分别刺激60 min，RNAi的SMAD1/5/9的磷酸化水平(0.337±0.030)比CON明显下降( t＝25.480， P<0.05)，差异有统计学意义。 结论:无机磷酸盐可通过RhoA/Rock-1引起瓣膜间质细胞的成骨分化，SMAD1/5/9的磷酸化在此过程中起重要作用。

目的:观察吞噬和细胞运动蛋白2(ELMO2)对胰腺癌细胞株人源胰腺癌细胞系-1(PANC-1)的趋化运动能力、细胞黏附能力和侵袭能力的影响，探讨其作用机制。方法:2018年9月至2019年7月应用小干扰RNA技术对PANC-1中ELMO2蛋白进行敲减。采用配对设计方法，分为ELMO2蛋白敲减组、阴性敲减链对照组和空白对照组。建立不同浓度的CXC趋化因子配体12(CXCL12)浓度梯度，应用趋化运动实验、细胞黏附实验和细胞侵袭实验来研究ELMO2蛋白对细胞迁移运动能力、趋化运动能力和转移侵袭能力的影响。应用免疫共沉淀技术对ELMO2蛋白与G蛋白阿尔法亚基i2蛋白(Gαi2)的相互作用机制进行研究。组间比较采用双因素方差分析方法。结果:将RNAi干扰链转染进入PANC-1细胞株，细胞中ELMO2蛋白表达量明显降低。在趋化因子浓度为10 μg/L时，实验结果显示，敲减组定向跨膜的移动细胞数量明显低于阴性对照组[(36.67±1.21)个比(75.67±1.76)个， t＝18.270， P<0.01]，差异有统计学意义。在趋化因子浓度为10 μg/L的条件下，实验结果显示，敲减组细胞黏附率明显低于阴性对照组[(0.47±0.02)%比(0.79±0.01)%， t＝19.850， P<0.01]，差异有统计学意义。趋化因子CXCL12浓度为10 μg/L时，实验结果显示，敲减组穿越基质胶的细胞数量明显低于阴性对照组，侵袭能力明显减弱[(84.33±2.03)个比(132.00±0.58)个， t＝22.610， P<0.01]，差异有统计学意义。构建吞噬与细胞运动蛋白2的过表达质粒(代号质粒362)载体，在Flag标签蛋白抗体的免疫沉淀物中发现Gαi2蛋白的条带。 结论:ELMO2蛋白的敲减可以减弱胰腺癌细胞的趋化运动能力、黏附能力和侵袭能力。外源性免疫共沉淀试验结果表明，ELMO2蛋白与Gαi2蛋白存在直接相互作用关系。

目的:探讨基质金属蛋白酶13（MMP13）和低密度脂蛋白受体相关蛋白1（LRP1）对大骨节病患者关节软骨细胞自噬功能的影响。方法:自陕西省地方病防治研究所获取4例大骨节病患者和4例对照受试者的关节软骨样本，采用免疫组织化学（IHC）法检测软骨组织中MMP13和LRP1的表达水平；体外提取并培养软骨细胞，分别采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）和蛋白免疫印迹（WB）法检测软骨细胞LRP1以及自噬相关基因[自噬基因Beclin1（BECN1）、微管相关蛋白1轻链3（LC3）]，软骨损伤相关基因[MMP13、半胱氨酸蛋白酶3（CASP3）]，软骨细胞分化相关基因[Ⅱ型胶原α1链（COL2A1）、Y染色体性别决定区-盒转录因子9（SOX9）]的mRNA和蛋白表达水平。另提取3例大骨节病患者膝关节样本的软骨细胞，采用RNA干扰（RNAi）技术进行MMP13基因沉默实验，并采用qRT-PCR和WB法检测上述基因mRNA和蛋白表达水平。此外，采用LRP1的拮抗剂受体相关蛋白（RAP）对人正常软骨细胞（C28/I2细胞）中LRP1进行封闭，并采用qRT-PCR和WB法检测软骨细胞LRP1、自噬、分化和软骨损伤相关基因的mRNA和蛋白表达水平。结果:IHC结果显示，大骨节病患者软骨组织表、中、深层的MMP13表达水平（1.67 ± 0.21、0.59 ± 0.15、0.51 ± 0.12）均显著高于对照受试者（0.25 ± 0.03、0.26 ± 0.04、0.06 ± 0.01），差异均有统计学意义（ t = - 11.38， P < 0.001； t = - 3.82、- 6.26， P = 0.019、0.003）；LRP1表达水平（0.10 ± 0.02、0.03 ± 0.01、0.17 ± 0.03）均显著低于对照受试者（1.63 ± 0.40、0.44 ± 0.12、0.34 ± 0.08），差异均有统计学意义（ t = 6.61、5.61、3.64， P = 0.003、0.005、0.022）。大骨节病患者软骨细胞中MMP13、CASP3、SOX9的mRNA和蛋白表达水平均显著高于对照受试者，差异均有统计学意义（均 P < 0.05）；LRP1、LC3、COL2A1的mRNA表达水平均显著低于对照受试者，差异均有统计学意义（均 P < 0.05）。在大骨节病患者软骨细胞中沉默MMP13基因后，LRP1、BECN1、LC3、CASP3、COL2A1和SOX9的mRNA和蛋白表达水平均无显著变化（均 P > 0.05）。采用RAP封闭LRP1后，软骨细胞LRP1、BECN1、LC3、MMP13、COL2A1和SOX9的蛋白表达水平均明显低于对照组（均 P < 0.05）。 结论:MMP13与大骨节病患者关节软骨细胞的自噬异常无直接联系；封闭LRP1后软骨细胞自噬相关基因BECN1、LC3的表达降低。

目的:探讨脂肪量和肥胖相关基因(FTO)在结肠癌组织的表达及其生物学功能。方法:采用实时定量聚合酶链反应检测并分析FTO在结肠癌组织与癌旁组织中的表达特征及临床意义。利用RNA干扰(RNAi)技术构建FTO稳定下调表达的结肠癌细胞株SW620和Caco-2，通过细胞计数试剂盒(CCK-8)细胞增殖实验、划痕实验进一步研究FTO下调表达对结肠癌细胞株生物学行为的影响。结果:结肠癌组织中FTO的mRNA表达水平显著高于癌旁正常组织( t＝10.310， P<0.01)；FTO mRNA在肠癌细胞中的表达水平显著高于正常肠上皮细胞株(HT-29为， t＝18.730， P<0.01；HCT-116为， t＝3.700， P<0.05；SW620为， t＝4.060， P<0.05；LoVo为， t＝5.580， P<0.01；SW48为， t＝16.640， P<0.01；DLD-1为， t＝7.260， P<0.01；Caco-2为， t＝9.640， P<0.01)，差异均有统计学意义。CCK-8增殖实验结果显示，LV-FTO-shRNA组中结肠癌细胞的增殖能力低于shNC组(SW620，24 h为， t＝4.660， P<0.01，48 h为， t＝3.760， P<0.01，72 h为， t＝3.370， P<0.05；Caco-2，24 h为， t＝3.680， P<0.05，48 h为， t＝3.630， P<0.05，72 h为， t＝4.180， P<0.01)，差异均有统计学意义；划痕试验结果显示，划痕24 h后，LV-FTO-shRNA组的无细胞区域显著宽于LV-NC组(SW620为， t＝34.070， P<0.01；Caco-2为， t＝31.680， P<0.01)，差异均有统计学意义。 结论:FTO在结肠癌组织及结肠癌细胞株中高表达，FTO的下调表达显著抑制结肠癌细胞的增殖和迁移能力，提示FTO异常表达是促进结肠癌进展的重要因素。

目的:探讨结直肠癌中p53蛋白对Numb蛋白表达的影响及其作用机制，观察两者相互作用对Numb蛋白泛素化降解影响以及对结肠癌细胞凋亡的影响。方法:以人结肠癌细胞系HCT116(＋)及HCT116(－)[分别为p53野生型及p53缺失型，美国典型菌种保藏中心(ATCC)来源]作为研究对象，分别采用基因过表达(Transfection)及RNA干扰(RNAi)，再用蛋白酶体抑制剂MG132分别处理或不处理细胞12 h，用蛋白质免疫印迹法(Western blot)检测了p53蛋白对Numb蛋白表达量及其泛素-蛋白酶体途径稳定性的影响，用流式细胞术检测p53/Numb对结肠癌细胞凋亡的影响。组间比较采用方差分析(ANOVA)，独立样本 t检验比较蛋白表达量差异，统计学方法分别采用独立样本 t检验、独立样本 t检验及单因素方差分析。 结果:Numb的蛋白水平随着p53的蛋白表达水平的逐渐升高而升高，呈剂量依赖性，空白组与p53转染组(2 μg和4 μg)Numb蛋白表达水平比值分别为0.632(0.633±0.008)和0.137(0.136±0.003)，( t＝5.332， P<0.01)而Numb的mRNA水平随着p53的mRNA表达水平的升高无明显变化[0.892(0.890±0.003)比0.826(0.825±0.006)， t＝1.232， P>0.05]；p53 RNA干扰或不干扰48 h后，Numb的蛋白水平低于对照组(0.167(0.163±0.001)和0.536(0.532±0.005)， t＝3.374， P<0.05)，Numb的mRNA水平随着p53的mRNA表达水平的降低无明显变化；同时p53 RNA干扰后，Numb蛋白表达水平降低，而蛋白酶体抑制剂MG132可使Numb的蛋白水平趋于一致[0.753(0.750±0.009)比0.742(0.744±0.006)， t＝1.532， P>0.05]；当没有MG132时，p53存在情况下的Numb蛋白水平要比p53不存在时的Numb蛋白水平要高，但是此时Numb蛋白水平仍然比MG132存在时的Numb蛋白水平要低；共聚焦显微镜结果示当p53不存在时，Numb主要定位在胞膜及胞质，呈弥散分布；而当有p53存在时，Numb定位于胞质，呈聚集分布并且表达量增多，但p53也有部分是定位在胞质，说明Numb和部分p53共定位于胞质。而在HCT116(p53＋)中p53 RNA干扰后作用则与之相反；在HCT116(＋)中，转入Numb 48 h后其细胞凋亡数量明显增多(13.7%比48.3%， t＝4.523， P<0.01)，并与DAPT有同向的协同作用( t＝4.523， P<0.01)；而在HCT116(－)中细胞凋亡数量也增多，但较前者作用稍弱，而相应空白对照组、空载组变化不明显。 结论:结肠癌细胞中p53通过与Numb蛋白的结合通过泛素-蛋白酶体途径影响其蛋白稳定性，通过Numb/Notch通路可能影响结肠癌细胞凋亡。