目的:研究基于乙型肝炎病毒核心蛋白的嵌合病毒蛋白纳米颗粒对肺腺癌动物模型的免疫治疗作用，为肺腺癌的纳米治疗技术提供依据。方法:将人上皮细胞生长因子受体-2(human epidermal growth factor receptor-2，HER-2)B细胞抗原决定簇插入乙肝核心蛋白(hepatitis B core protein，HBc)的主要免疫显性区域(Major Immunodominant region，MIR)，利用大肠杆菌进行表达纯化后，得到重组蛋白纳米颗粒HBc-HER2。将此重组蛋白纳米颗粒免疫小鼠肺腺癌皮下瘤模型，通过检测其血清中HER-2抗体水平及抗体型别，评价此纳米颗粒免疫原性。通过小鼠皮下瘤大小变化评价肿瘤治疗效果。结果:得到了纯度较高的HBc-HER2重组蛋白，且电镜观察显示其形成了HBc-HER2纳米颗粒，动物实验表明免疫原性强，能够诱导机体产生高滴度的针对HER-2的抗体，并有良好的肿瘤治疗作用。结论:基因重组的HBc-HER2在小鼠肺腺癌皮下瘤模型中有明显的抑制肿瘤作用，为肺腺癌的纳米治疗技术提供了依据。

目的 通过原核系统表达纯化嵌合肠道病毒71型(EV71)中和表位SP70的病毒样颗粒(VLPs),作为备选的EV71基因重组亚单位疫苗.方法 将SP70插入乙肝病毒核心抗原(HBcAg)截短序列的主要免疫显性区域,合成融合蛋白基因后连接表达质粒转化入大肠埃希菌诱导表达,经DEAE离子交换层析、CsCl垫层离心以及密度梯度离心后得到纯化的重组VLPs,并通过Western Blot和ELISA实验鉴定其抗原性.结果 成功构建重组质粒pHBc-SP70,在大肠埃希菌中经IPTG低温诱导后高效表达,可溶性目的蛋白经离子交换层析、CsCl垫层离心和密度梯度离心三步纯化后纯度可达90％以上;纯化的融合蛋白可自发折叠组装为病毒样空心颗粒,与抗SP70单克隆抗体和抗HBc单克隆抗体均可特异性结合.结论 在原核系统中成功高效表达和纯化了表面展示EV71中和表位的嵌合HBc-SP70 VLPs,并证实其具有良好的抗原性,为该EV71基因重组疫苗的免疫效果评价奠定了基础.

目的 研究宿主限制性因子莫罗尼白血病病毒10蛋白(Moloney leukemia virus 10,MOV10)对乙肝病毒(hepatitis B virus,HBV)复制的调控作用.方法 首先在肝癌细胞Huh7中转染HBV复制质粒,探讨HBV复制和MOV10表达的相关性;接着在Huh7中通过siRNA干扰或过表达MOV10,提取病毒核心颗粒的DNA,通过荧光定量PCR分析病毒复制水平的变化;进一步构建MOV10保守结构域Ⅱ的酶活突变体(D645A、E646Q和G648A),检测突变后对MOV10抗病毒作用的影响;在人肾上皮细胞293细胞中共转染HBV复制质粒和MOV10表达质粒,通过RNA结合蛋白免疫沉淀(RNA binding protein immunoprecipitation,RIP)研究MOV10与HBV RNA的结合.结果 肝癌细胞Huh7转染HBV复制质粒后,MOV10蛋白水平增高;肝癌细胞Huh7中干扰内源性MOV10后,HBV复制水平升高1.5倍,而Huh7细胞中过表达MOV10,显著抑制了HBV的复制;MOV10结构域Ⅱ突变体同样显著抑制HBV的复制;MOV10可以与HBV 3.5 kb RNA结合.结论 在肝癌细胞中,宿主限制性因子MOV10的表达与HBV复制相关,其抑制HBV复制的作用不依赖于其解旋酶活性,可能与HBV 3.5 kb RNA结合有关.

目的 以乙肝核心抗原(HBc)病毒样颗粒为载体,化学偶联脑膜炎奈瑟球菌荚膜多糖,制备高免疫原性的多糖结合疫苗.方法 将双功能聚乙烯二醇对C群脑膜炎多糖衍生化后,与巯基化的乙肝核心抗原连接,采用凝胶过滤色谱纯化得到多糖结合疫苗.对结合疫苗的结构表征和多糖含量进行定量分析后,皮下免疫BALB/c小鼠,采用酶联免疫吸附法(ELISA)评价免疫效果.结果 衍生化多糖与巯基化的HBc按质量比1∶1投料,在4℃下反应48 h,得到多糖蛋白比为0.69、游离多糖含量为14.66％的多糖结合疫苗,并且能够保持HBc完整的颗粒结构.免疫后,纯糖免疫组只能够产生有限的抗体滴度,而以HBc为载体的多糖结合疫苗能够诱导产生明显高于纯糖组的抗体滴度.结论 采用HBc作为载体蛋白制备多糖结合疫苗,可以显著提高多糖的免疫原性.作为制备流脑多糖结合疫苗的新型载体蛋白,具有较好的研究价值和应用前景.

[目的]为了探究乙肝病毒核心蛋白(Hepatitis B virus core protein,HBc)病毒样颗粒(Virus-like particles,VLPs)表面抗原密度对免疫后抗体应答水平的影响,制备了不同抗原密度的HBc VLPs疫苗,并检测了其在小鼠体内的抗体应答水平.[方法]首先制备了N端带有3个甘氨酸的人巨细胞病毒重组抗原域AD-4作为模式抗原,接着通过Sortase A的介导将AD-4连接到HBc VLPs表面上.将系列浓度梯度AD-4抗原在Sortase A介导下分别与相同浓度的HBc VLPs发生反应,制备不同抗原密度的HBc-AD-4 VLPs.将其分别免疫6-8周龄BALB/c小鼠3次,每次免疫间隔2w,间接ELISA法检测被免疫小鼠血清的抗体应答水平.[结果]结果表明,当HBc VLPs表面抗原密度为44.4％时,即HBc反应浓度∶AD-4反应浓度为1∶0.5时,不足以引起高滴度的抗体产生;当HBc VLPs表面抗原密度为64.2％时,即HBc反应浓度∶AD-4反应浓度为1∶1时,HBc-AD-4 VLPs诱导的AD-4特异性抗体滴度与100％抗原密度的HBc-AD-4 VLPs所引起的抗体滴度相当;当HBc VLPs表面抗原密度大于64.2％时,引起的抗体应答水平不因抗原密度增加而进一步增强.[结论]发现了HBc VLPs表面抗原密度与免疫后抗体滴度呈正相关,然而免疫64.2％抗原密度的HBc VLPs所产生的抗体滴度可达峰值,抗原密度进一步增加,抗体应答水平不会进一步加强.

目的:制备嵌合结肠癌新抗原Adpgk的乙肝病毒核心抗原(HBcAg)病毒样颗粒(VLP).方法:通过重叠PCR将新抗原编码序列插入截短型HBcAg(1～149 aa)第78、79位氨基酸编码序列之间,并将融合基因克隆至原核表达载体pET-22b(+),转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达后,利用亲和层析与超滤管纯化浓缩目的蛋白,通过Western印迹、粒径分析与透射电镜成像鉴定嵌合病毒样颗粒.结果:构建了pET-22b(+)重组表达载体并转入大肠杆菌BL21(DE3),SDS-PAGE结果显示在30℃经1 mmol/L IPTG诱导5 h即可获得高浓度的可溶性蛋白,通过亲和层析与超滤浓缩得到了纯度良好的目的蛋白;Western印迹结果表明连有His标签的目的蛋白获得表达且浓度较高;透射电镜成像可见密集的大小均一、空心的球形病毒样颗粒结构.结论:制备出浓度与纯度良好且组装正确的嵌合HBcAg VLP.

目的:获取含RGD靶向肽的乙肝核心病毒样颗粒,为药物靶向纳米递送系统提供一种新型载体.方法:将实验室前期构建测序正确的含RGD修饰的乙肝核心病毒重组质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3)中,单因素分析及正交试验探究重组蛋白最适表达条件.在最适表达条件下扩培,收集菌体超声破碎后离心,采用凝胶过滤层析、离子交换和蔗糖密度梯度离心进行纯化,利用透射电镜对形成的RGD-HBc VLPs的形态及稳定性进行鉴定.纯化的RGD-HBc VLPs利用其体外自组装的特性,将光敏剂ICG装载到颗粒的内部,通过静脉注射到4T1乳腺癌荷瘤小鼠,探究重组RGD-HBc VLPs作为纳米递送系统的靶向性.结果:RGD-HBc VLPs在温度32℃、IPTG0.5mmol/L、诱导4h时以可溶性蛋白的形式得到高效表达.经蔗糖密度梯度离心纯化后纯度到达95％以上.透射电镜下观察纯化的RGD-HBc VLPs形态、大小均一,直径约为32nm,通过近红外荧光活体成像证实了RGD-HBc作为纳米载体的靶向性.结论:经表达和纯化后,RGD-HBc VLPs具有较高的表达量和大小均一的形态外貌,近红外荧光活体成像证实具有较好的靶向性,这不仅为肿瘤的可视化诊断提供一种快速、精准、方便的方法,而且为今后靶向免疫治疗提供一种新型载体.

乙型肝炎病毒核心蛋白(HBc)基因序列的C端、N端以及MIR区在插入外源基因后,能够正确折叠和组装成病毒样颗粒(VLPs),并且将外源序列暴露到衣壳的刺突,诱发强烈的外源序列特异的体液和细胞免疫反应.因此,HBc可作为基因工程疫苗的载体,在病毒性传染病的预防和肿瘤疫苗的开发和研制中都有广阔的前景.本文将从HBc作为免疫载体所具备的优势及其在病毒性传染病和肿瘤疫苗的应用进行综述.

目的:以乙型肝炎病毒核心抗原HBcAg为载体,构建呈现新冠病毒刺突蛋白受体结合域的病毒样颗粒,并鉴定其免疫原性,为新冠病毒疫苗的开发提供新思路.方法:在乙型肝炎病毒核心蛋白氨基酸编码序列第78和81位插入新冠病毒刺突蛋白受体结合域(RBD),并通过柔性linker(G4S)3进行连接,序列优化后将融合基因克隆到原核表达载体pET-28a(+),转化表达菌Rosetta,在自诱导培养基中诱导表达,菌体破碎后经蔗糖密度梯度离心,透析浓缩的方法纯化病毒样颗粒.SDS-PAGE、Western blot、透射电子显微镜检测和鉴定VLPs.将制备的VLPs与佐剂等比例混合经皮下免疫BALB/c小鼠,ELISA检测小鼠血清中特异性抗体,分析该HBc-RBD VLPs的免疫原性.结果:在自诱导培养基中,大肠埃希菌可表达部分可溶的VLPs,经蔗糖密度梯度离心纯化后在透射电子显微镜下可以观察到病毒样颗粒的存在.动物实验表明HBc-RBD VLPs刺激小鼠产生了特异性抗体.结论:在原核表达系统中成功表达了展示RBD抗原的VLPs,并通过小鼠实验初步验证了免疫原性,为新冠病毒疫苗的研发提供了新方向.