目的:对肺炎克雷伯菌(KP)中标注的氨基肽酶(PepA)进行序列扩增与蛋白表达，鉴定其酶活特性。方法:根据(美国)国家生物技术信息中心(NCBI)公布的KP PepA基因序列(Reference Sequence：NZ_CP045783.1)设计扩增引物，以本科室前期分离到的一株KP基因组为模板，通过聚合酶链反应(PCR)扩增出PepA基因全长，使用NdeⅠ和XhoⅠ双酶切后连接至表达载体pET-30a。将重组质粒pET-30a-PepA转化至大肠杆菌BL21(DE3)，经异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达出KP PepA蛋白，使用N 2＋层析柱对重组His标签蛋白进行纯化。以亮氨酸-对硝基苯胺(Leu-pNA)为底物，测定KP PepA对其水解能力，并摸索不同的反应温度和pH值条件对水解反应的影响。在反应体系中加入不同二价金属离子，观察各离子对KP PepA氨基肽酶活性的作用。组间比较采用 t检验。 结果:扩增出长度为1 527 bp的KP PepA基因，并获得可溶性KP PepA蛋白，大小为56.1×10 3，与预测大小一致。KP PepA加入组反应产物pNA浓度显著高于KP PepA不加组[(205.00±5.00) μmol/L比(8.00±2.00) μmol/L， t＝63.36， P<0.01]，表明重组KP PepA可以水解Leu-pNA。KP PepA水解Leu-pNA的最适温度为37 ℃，最适pH值为pH 8.0。Co 2＋、Mn 2＋均可以提高KP PepA酶活性，其中Co 2＋激活作用最强，加入Co 2＋组的相对酶活性显著高于不加离子组(181.70±7.64比95.00±0.00， t＝16.44， P<0.01)；Zn 2＋、Fe 2＋均可以抑制KP PepA酶活性，其中Zn 2＋抑制作用最强，加入Zn 2＋组的相对酶活性显著低于不加离子组(44.67±8.97比95.00±0.00， t＝8.49， P<0.01)。 结论:肺炎克雷伯菌中标注的PepA具有体外氨基肽酶活性。

目的:利用烟草遗传转化体系,研究尾叶桉(Eucalyptus urophylla)咖啡酸氧甲基转移酶基因(EuCOMT)和咖啡酰CoA氧甲基转移酶基因(EuCCoAOMT)对木质素单体合成的定向调控效果.方法:分别利用EuCOMT的正义片段、EuCCoAOMT的全长RNAi片段进行单基因和二价基因的烟草转化研究,并对转基因烟草植株中目标基因表达水平、木质素和纤维素的含量、茎部解剖结构及木质素单体含量进行检测.结果:分别获得了转基因植株C-S(转EuCOMT正义片段)、CR(转EuCCoAOMT全长RNAi片段)、C-CR(EuCOM和EuCCoAOMT二价基因转化).烟草中转入的正义EuCOMT的片段能够正常表达,而EuCCoAOMT的全长RNAi片段对烟草CCoAOMT基因引发了强烈的抑制.转基因烟草的生长形态、木质素、纤维含量及解剖结构与野生型无显著差异.转基因植株C-S中G木质素含量升高17.72％,S/G值降低17.99％;CR中S/G值升高61.62％,C-CR中G木质素降幅达到57.38％,S/G比值升幅达到114.94％.结论:抑制CCoA OMT对G木质素合成具有显著的抑制效果,EuCOMT和EuCCoAOMT二价基因转化对S/G比值的定向调控效果最为理想.

脱氧辛糖酸-8-磷酸合酶(3-Deoxy-D-manno-octulosonate 8-phosphate synthase,KDO8PS)是一种参与细胞壁八碳糖(KDO)合成代谢的关键酶之一.为了解该酶催化特性和功能,本实验采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)方法首次分离得到毛竹PeKDO8PS基因.序列分析表明该基因CDS区全长876 bp,编码291个氨基酸.通过IPTG诱导,含有该基因的原核表达载体在大肠杆菌中获得了大量可溶性活性蛋白表达;经Ni-NTA亲和层析和分子筛层析(SEC)方法进行酶蛋白的两步分离纯化,得到纯度大于90％以上的高纯度酶;SEC结果发现,纯化后目的蛋白KDO8PS在溶液中主要以二聚体形式存在.戊二醛交联实验证实该酶具有形成二聚体/四聚体的可能性,进一步通过超速离心(AUC)分析,发现水溶液中KDO8PS在高浓度时二聚体会聚合转化形成四聚体.推测形成二聚体/四聚体可能是保持酶稳定性的一种机制.通过测定毛竹KDO8PS酶学性质,发现该酶催化反应的pH值范围在4.0-9.0,最适pH值为8.0;热稳定性范围25-65℃,最适作用温度为55℃;各种二价金属阳离子在低浓度下均对酶活性存在不同程度的抑制作用,其中以Fe3+对酶活性的抑制作用最强,而低浓度EDTA可通过螯合作用消除金属离子的抑制作用.以上研究结果为植物KDO8PS蛋白结构与功能及其在新型抗生素领域中的工业化应用提供了重要理论基础.

目的:在Bacillus subtilis中表达异源D-海因酶基因(hyd)和D-氨甲酰水解酶基因(adc),构建重组细胞作为催化剂,用于生产D-对羟基苯甘氨酸(D-HPG).方法:构建hyd表达质粒,考察培养基中二价金属离子对D-海因酶活性的影响.过表达acoR基因,考察AcoR蛋白胞内水平与PacoA-hyd基因拷贝数的关系.筛选表达adc基因的启动子,构建hyd和adc基因共表达质粒,考察双酶活性菌株的催化特性.结果:成功构建了海因酶表达质粒pHPS和pUBS,培养基中添加0.8mmol/L的MnCl2·4H2O,使168N/pUBS菌株的D-海因酶活性达到956U/gDCW.整合表达Pcdd-acoR基因,使LSL02/pUBS菌株的D-海因酶活性达到1 470U/gDCW.单拷贝PAE-adc基因的表达水平相对最高.双酶共表达质粒pUBSC被成功构建,菌株LSLO2/pUBSC的最适催化温度为40℃～45℃,催化活性能够持续12h,当底物起始浓度为20g/L时,反应12h生成的D-HPG达到14.32g/L,转化率达到95％,收率超过80％.结论:构建具有D-海因酶和D-氨甲酰水解酶双酶活性的重组Bacillus subtilis作为全细胞催化剂,用于海因酶法生产D-HPG,具有技术上的可行性和优势.

铁(Fe)是植物生长必需的微量元素,适宜的铁含量有利于植物的正常生长和发育.在吸收铁这一生理过程中,禾本科植物和非禾本科植物吸收铁的价态不同,并且铁在植物体内的运输过程也存在着二价与三价铁的相互转化.铁还原酶基因(Fe3+chelate reductase,FRO)具有将三价铁还原成二价铁的功能.因此,在分子水平上研究FRO的具体功能具有非常重要的意义.综述了拟南芥、番茄、大豆、水稻、花生及蒺藜苜蓿等FRO基因在亚细胞定位、还原对象、诱导条件及调控或影响因素等方面的研究进展,以期为后续研究铁的吸收机制奠定理论基础.

[目的]假单胞菌SJTE-1可高效转化17β-雌二醇,但是催化该转化的酶尚不清楚.本文鉴定了该菌株的一个新的3-酮酰基-ACP还原酶(ANI01589.1),并对其进行了功能研究.[方法]首先,我们克隆了该3-酰基-ACP还原酶的编码基因,在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中进行了异源表达;利用金属离子亲和层析法,纯化获得了重组蛋白.体外检测了重组蛋白的活性与酶学性质,并利用高效液相色谱法(HPLC)测定了该酶的催化产物.[结果]3-酮酰基-ACP还原酶可被17β-雌二醇诱导表达,重组蛋白纯化量可达19.6 mg/L.蛋白序列比对结果表明,该蛋白包含短链脱氢酶/还原酶(SDR)的2个共有区域和多个保守残基.该酶以NAD+为辅助因子,将17β-雌二醇转化为雌酮;其Km值为0.071 mmol/L,kcat值为2.4±0.06/s-1,5 min内可转化超过95.8％的雌二醇.该酶的最佳反应温度为42℃C,最佳pH为8.0.不同二价离子对该酶的活性影响不同,Mg2+和Mn2+可增强其酶活性.[结论]这一假单胞菌SJTE-1来源的3-酮酰基-ACP还原酶可高效催化17β-雌二醇的转化,该酶可能在该菌株的雌激素代谢过程中起到重要作用.

植物在逆境条件下会积累过量有毒醛类化合物(如甲基乙二醛),乙二醛酶可有效清除此类化合物以维持体内平衡.为研究萱草乙二醛酶基因的功能,根据萱草转录组测序结果,采用生物信息学方法筛选乙二醛酶候选基因,并通过反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)法首次从萱草中克隆了乙二醛酶的编码序列(coding sequence,CDS)的全长,命名为HfGLXI-1.该CDS全长885 bp,编码295个氨基酸,分子进化树分析显示该基因编码的蛋白质属于乙二醛酶进化枝Ⅰ (Clade Ⅰ),即具有乙二醛酶活性.蛋白质高级结构预测显示HfGLXI-1主要由无规则卷曲、α螺旋和延伸链组成,其配体为二价钴离子和谷胱甘肽,与乙二醛酶的性质相符.通过PCR扩增结果显示扩增得到的基因组DNA条带大小与该基因CDS的分子量相近,测序结果表明上述两者序列完全一致,推测仞-G LXI-1基因不存在内含子.通过构建含有HfGLXI-1 cDNA的过表达载体及采用花粉管通道方法进行转化,获得表达转基因萱草,为进一步研究萱草HFGLXI-1的功能提供参考.

香茅醇假单胞菌SJTE-3能够以17β-雌二醇为唯一碳源并将其高效降解,但其催化雌二醇转化的关键酶仍不明确.本文鉴定了该菌株中降解雌二醇的短链脱氢酶SDR-X1(WP_043267487.1),并对其功能进行了研究.首先利用荧光定量PCR,检测了不同碳源条件下基因sdr-x1的转录水平;克隆基因sdr-x1,在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中诱导表达,利用亲和层析纯化获得了重组蛋白SDR-X1;体外检测了重组蛋白SDR-X1的催化活性与酶学性质,并利用高效液相色谱鉴定了其转化17β-雌二醇的产物.蛋白SDR-X1可被17β-雌二醇诱导表达;蛋白序列比对显示蛋白SDR-X1含有短链脱氢酶的保守基序与氨基酸.该酶以NAD+为辅因子,将 17β-雌二醇氧化为雌酮;其Km 值为(0.039 86±0.004061)mmol/L,Vmax值为(3.168±0.135)mmol/L/min/mg,可在15 min内转化61.75％以上的雌二醇.该酶对温度具有一定耐受性,最佳反应温度为50℃,偏碱性pH可促进其酶促反应.不同二价金属离子对该酶活性具有不同的影响,Mg2+、Mn2+和Ca2+可增强其酶活性.香茅醇假单胞菌SJTE-3中的SDR-X1可高效催化17β-雌二醇转化,参与该菌株的雌激素降解过程,其功能研究将推进细菌的雌激素代谢机制解析.

目的 研究线粒体铁蛋白(FtMt)对非小细胞肺癌细胞顺铂耐药株A549/DDP和非小细胞肺癌细胞株A549上皮-间质转化(EMT)的影响,探讨其改善顺铂耐药的分子机制.方法 流式细胞术检测A549和A549/DDP的凋亡率和细胞周期情况,Western blot检测E-钙黏蛋白(E-cadherin)、N-钙黏蛋白(N-cadherin)和FtMt蛋白表达水平,RT-qPCR法检测细胞中E-cadherin、N-cadherin、snail、slug、twist、波形蛋白(vimentin)、铁转运蛋白(ferroportin,FPn)、二价金属离子转运蛋白1(divalent metal transporter 1,DMT1)、铁调素和转铁蛋白受体1(transferrin receptor1,TfR1)基因表达水平.细胞划痕实验检测细胞迁移情况.结果 随着顺铂使用剂量增加,A549/DDP和A549细胞凋亡率逐渐升高,且A549细胞凋亡率显著高于A549/DDP细胞.顺铂处理后,与0μg/mL顺铂组比较,顺铂各剂量组A549细胞G0/G1期和G2/M期逐渐降低,A549/DDP细胞G0/G1期和G2/M期先升高后降低(P<0.05).A549/DDP细胞E-cadherin和mRNA水平低于A549细胞,A549/DDP细胞N-cadherin和mRNA水平高于A549细胞,A549/DDP细胞中snial、slug、vimentin、FPn、铁调素(hepcidin)和TfR1 mRNA水平高于A549细胞(P<0.05),A549/DDP细胞中DMT1 mRNA水平低于A549细胞(P>0.05),A549/DDP细胞迁移的速度显著快于A549细胞(P<0.05),A549/DDP细胞中FtMt蛋白表达水平显著高于A549细胞(P<0.05).结论 肺癌细胞的顺铂耐药与EMT过程有关,FtMt在肺癌细胞耐受顺铂过程中可能发挥了重要作用.