二氢黄酮醇4-还原酶(DFR)是花青素合成途径中的关键酶.本研究以乌头(Aconitum carmichaeli)不同开放时期的花蕾为材料,测定其花青素含量,并采用同源克隆和cDNA末端快速扩增(RACE)技术从乌头花中获得了DFR基因cDNA全长,命名为AcDFR(GenBank登录号KY272864).结果显示,乌头花青素含量随着花的开放呈先上升后下降的趋势.AcDFR的cDNA全长为1233 bp,开放阅读框为1014 bp,预测编码337个氨基酸.氨基酸序列比对显示,AcDFR在NADPH结合区域和底物结合区域都高度保守,属于NADB_Rossmann超家族.系统进化分析表明,AcDFR与翠雀(Delphinium grandiflorum)DFR亲缘关系最近.AcDFR主要在乌头的花中表达,在根、茎、叶中几乎不表达,其表达量与花青素含量的变化呈正相关,随着不同的开花级数呈现先上升后下降的趋势.

植物色素主要有花青素、类胡萝卜素和生物碱类色素三大类,其中花青素是决定大部分被子植物组织或器官颜色的重要色素.花青素通过类黄酮途径合成,该途径是生物学上研究较多且较为清楚的代谢途径之一.近年来的研究表明,在该途径中除了查尔酮合成酶(chalcone synthase,CHS)、查尔酮异构酶(chalcone isomerase,CHI)和黄烷酮-3-羟化酶(flavanone-3-hydrolase,F3H)起着关键作用外,二氢黄酮醇-4-还原酶(dihydroflavonol 4-reduc-tase,DFR)对花青素的合成也至关重要.DFR可催化3种二氢黄酮醇和2种黄烷酮生成5种不同的花青素前体,且 D FR基因家族不同成员对各个底物的催化效率不同,因此它在一定程度上决定着植物中花青素的种类和含量,从而影响植物组织或器官的颜色.该文对近年来国内外有关DFR在花青素合成过程中的生物学功能与调控,包括DFR的特征、作用机制和系统进化以及环境、转录因子和一些结构基因与DFR的关系等方面的研究进展进行了综述,以期为DFR今后的研究和利用基因工程改变植物组织或器官的颜色提供理论依据.

为探究建兰花色形成的分子调控机理,该研究以同株建兰黄绿色、红色花瓣为实验材料,采用高通量High-seq测序技术进行转录组文库构建,从基因水平探索花色物质的合成代谢通路及关键调控基因的转录活性.结果表明:(1)转录组测序共获得131 110 030条过滤序列(Clean Reads)、106 479条单基因(Unigenes),通过NR、GO、COG、KEGG等公共数据库比对,获得了29 748个有注释信息的Unigenes.(2)建兰黄绿色花瓣与红色花瓣中包括20个类黄酮合成代谢相关差异表达基因,与黄绿色建兰花瓣相比,红色花瓣中776个基因转录表达量上升,589个基因转录表达量下降,在KEGG数据库被注释到93条代谢通路,涉及6条类黄酮合成代谢相关的途径,共20个差异表达基因(83 Unigenes).(3) QRT-PCR分析显示,所选20个基因在建兰2种颜色花瓣中的表达量比值趋势与转录组FPKM比值趋势一致,表明该研究获得的转录组数据具有较高的参考价值;其中分支酸、苯丙氨酸解氨酶、肉桂酸4-羟化酶、4-香豆酸:辅酶A连接酶基因表达上调,有利于类黄酮前体积累;查尔酮合成酶、二氢黄酮醇还原酶、花青素合成酶基因在黄绿色花瓣中几乎不表达,在红色花瓣中表达明显上调,可能与建兰花色形成相关.

花青素苷是影响植物花瓣呈色的重要色素,而花色是决定花卉观赏价值和商业价值的一个重要因素.在花青素苷的生物合成过程中,二氢黄酮醇4-还原酶(DFR)是花青素苷生物合成下游途径中的第一个关键的酶.因此,DFR在高等植物花色的形成过程中发挥极其重要的作用,是形成花青素苷的一个非常重要的调控点.DFR对3种二氢黄酮醇底物具有选择特异性,但决定DFR底物特异性的分子机制目前仍不十分清楚.该文简单概述了花青素苷生物合成途径及其转录调控机制,并结合作者的工作重点综述了DFR的底物特异性以及克隆的DFR基因在植物基因工程中的应用.

为了研究光照对红颜草莓(Fragaria×ananassa Duch.'Benihoppe')果实着色、花青素含量及花青素合成相关基因表达的影响,本文采用高效液相色谱法(HPLC)和实时荧光定量PCR技术测定了不同遮阴处理下(透光率100％、75％、25％)草莓果实花青素含量及色素相关基因的表达情况.结果显示,与100％透光率下的草莓果实相比,在75％和25％透光率下合成的花青素含量分别下降了41.58％和92.54％;和花青素合成相关基因的表达也都有不同程度的下降,其中二氢黄酮醇4-还原酶基因(FaDFR)、类黄酮-3'羟化酶基因(FaF3'H)和类黄酮3-O-糖基转移酶基因(FaUFGT)的表达与花青素含量相关性达到显著水平;此外,在遮光条件下转录因子FaMYB10、FaMYB1表达也明显下调.可见,光照是影响草莓果实着色的关键环境因素,遮光抑制色素相关功能基因和转录因子的表达,阻碍了果实中花青素的合成,最终导致果实着色差异.

该研究利用实时荧光定量(qRT-PCR)检测了Bj uA09 DFR基因的时空表达特异性,并通过克隆BjuA09DFR基因启动子片段,构建该基因的启动子GUS融合表达载体,利用农杆菌介导法将重组质粒转入野生型拟南芥,最后对拟南芥转基因材料不同发育时期的不同组织部位进行GUS组织化学染色,分析BjuA09DFR基因启动子的表达模式,为Bj uA09 DFR基因启动子功能的进一步研究提供理论依据.结果表明:(1)BjuA09DFR基因在芥菜型油菜的多个组织部位都有表达,尤其是在叶、花、角果和授粉后15 d种子中表达量较高.(2)成功构建了BjuA09DFR基因启动子和GUS基因融合表达载体(pBjuA09DFR∷GUS),采用农杆菌介导法将重组质粒转入野生型拟南芥,经卡那霉素筛选和PCR检测抗性苗,获得转基因拟南芥阳性苗.(3)GUS组织化学分析结果显示,转基因拟南芥材料的GUS活性具有明显的时空特异性,在叶、花、角果和种子中的染色较深,具有很强的GUS活性.

为了解中国水仙花青素合成途径关键基因DFR(NtDFR)的表达调控以及中国水仙不能合成花青素的分子机制,采用染色体步移法从中国水仙中克隆NtDFR基因起始密码子上游962 bp的启动子序列.生物信息学分析结果表明启动子序列除包含TATA-box、CAAT-box等基本启动子元件外,还包含光调控元件、植物激素响应元件、胁迫响应元件等多个顺式作用元件.此外,该启动子序列还含有MYB转录因子结合位点.为验证启动子的表达特性,将NtDFR启动子取代植物表达载体pBI121上35S启动子,构建pBI121-pNtDFR∷GUS载体,利用农杆菌转化烟草叶片瞬时表达,通过GUS组织染色法确定了克隆的启动子的活性.将中国水仙R2R3-MYB转录因子NtMYB2、NtMYB5分别和pBI121-pNtDFR∷GUS共同注射烟草,定量PCR和GUS组织化学染色结果表明NtMYB2和NtMYB5都使NtDFR启动子诱导的烟草叶片GUS颜色变浅以及GUS基因表达量下降,表明NtMYB2和NtMYB5是NtDFR的抑制因子.本研究结果有助于了解中国水仙花青素合成途径的分子调控机制.

叶色是羽衣甘蓝重要的观赏性状之一.本研究采用Illumina Hi-Seq2500高通量测序技术,对基因型纯合的紫叶和白叶羽衣甘蓝叶片进行转录组测序,筛选差异基因并与GO和KEGG数据库比对进行注释分析,分析羽衣甘蓝叶色形成相关基因.结果 显示,获得高质量短读序共104 608 770条,筛选出紫叶相对白叶的差异表达基因1 993个,其中上调表达基因1 094个,下调表达基因899个.根据GO功能分类可分为生物过程、细胞组分和分子功能3大类64功能组.根据KEGG代谢通路分析可以分为171类,在叶色相关的类黄酮生物合成途径中黄酮醇合成酶(FLS)、二氢黄酮醇4-还原酶(DFR)上调以及类胡萝卜素生物合成途径中的类胡萝卜素β-环化酶上调与紫叶形成关系密切.本研究丰富了羽衣甘蓝的转录组信息,获得了一些差异表达基因,为进一步研究羽衣甘蓝叶色形成的遗传机制提供了有价值的信息.

二氢黄酮醇-4-还原酶(dihydroflavonol-4-reductase,DFR)是调控花青素合成的关键酶.DFR对底物的选择是决定植物中花色苷种类的重要因素,并在很大程度上决定花青素的比例,最终使植物呈现不同的颜色.此外,DFR基因家族中的不同成员对底物具有不同的催化效率,影响了植物中花青素的种类和含量,从而使植物组织或器官呈现不同的颜色.该文在分析已有毛白杨转录组数据的基础上,以毛白杨二氢黄酮醇-4-还原酶基因为研究对象,设计了一对PCR引物,以毛白杨基因组DNA为模板,通过PCR扩增获得了毛白杨DFR基因家族的1个成员,命名为PtDFR.测序结果表明,该基因序列全长为1 591 bp,包含6个外显子和5个内含子,CDS长度为954 bp,编码317个氨基酸,具有1个NADP(H)保守结构域.氨基酸序列相似性分析和进化分析表明,毛白杨与银白杨、毛果杨DFR的氨基酸相似性分别高达95.65％和94.21％,而与柑橘、枣、葡萄等7个物种DFR的氨基酸相似性达到82.14％～89.29％.转录组数据分析显示,PtDFR在不同组织器官中的表达量存在明显差异,萌动营养芽表达量最高,休眠营养芽最低,且不同时期雌雄花芽表达趋势相似,该研究结果将为深入探究PtDFR的功能奠定基础.

从药用菊花皇菊中克隆二氢黄酮醇还原酶(dihydroflavonol 4-reductase,DFR)基因片段,插入病毒诱导载体中来抑制菊花内源性基因的表达,用于其基因功能分析.根据已报道的菊花DFR基因序列(GenBank登录号GU324979)设计引物,克隆部分基因序列,应用生物信息学方法对其氨基酸序列进行分析.采用病毒诱导基因沉默技术(VIGS),以菊花的扦插苗生长到第3～4片叶期的菊花植株为实验材料,沉默菊花的DFR基因,用半定量和荧光定量PCR检测病毒诱导沉默后DFR基因的表达.克隆得到黄菊DFR基因的最大开放阅读框为1029bp,共编码342个氨基酸,等电点是6.03,分子量是41 089.36,与同一科属植物之间同源性达到80％以上,说明DFR蛋白氨基酸序列在同一科属间具有高度保守性.根据DFR基因全长设计构建病毒诱导载体的引物得到453bp的目的基因,命名为NbD FR.构建病毒载体(TRV)并利用携带目的基因的TRV重组载体病毒感染菊花幼苗,10d后可以看出菊花出现发育迟缓且叶片皱缩干枯的现象,检测DFR基因发现基因表达下调约20％,但未达到显著性.DFR基因是否被成功沉默还进一步验证.病毒诱导的基因沉默技术可在药用菊花中初步快速鉴定相关基因的功能.