目的:构建并鉴定气道上皮细胞条件性Src同源区2蛋白酪氨酸磷酸酶1（SHP-1）基因敲除小鼠，观察慢性阻塞性肺疾病（慢阻肺）患者气道上皮SHP-1表达情况及SHP-1表达缺陷对肺气肿小鼠表型的影响。方法:检测慢阻肺患者肺组织中气道上皮SHP-1的表达情况。采用CRISPR/Cas9技术构建SHP-1 flox/flox转基因小鼠，并将其与气道上皮细胞Clara蛋白10-环化重组酶与雌激素受体融合转基因小鼠（CC10-CreER +/+）进行交配，腹腔注射他莫昔芬后，获得气道上皮SHP-1基因敲除小鼠（SHP-1 flox/floxCC10-CreER +/-，SHP-1 Δ/Δ）。提取小鼠鼠尾和肺组织DNA，经PCR扩增后判别小鼠的基因型；通过qRT-PCR、Western blot、免疫荧光等方法验证气道上皮细胞SHP-1基因的敲除效果。使用弹性蛋白酶构建肺气肿小鼠模型，评估各组小鼠肺气肿严重程度。 结果:慢阻肺患者气道上皮SHP-1表达显著下调。基因型鉴定证实SHP-1 Δ/Δ小鼠表达CC10-CreER及SHP-1-flox。他莫昔芬诱导后，我们从DNA、RNA及蛋白水平证明SHP-1 Δ/Δ小鼠气道上皮细胞中SHP-1蛋白表达缺失，表明气道上皮细胞特异性SHP-1基因敲除小鼠构建成功。肺气肿动物模型中，SHP-1 Δ/Δ小鼠与对照组相比，肺气肿表型更为严重，表现为肺组织肺泡结构紊乱，肺泡壁破裂融合形成肺大疱。 结论:本研究成功建立并鉴定气道上皮细胞SHP-1基因敲除小鼠模型，为深入阐明SHP-1在慢阻肺进程中的作用及其机制提供了新的实验工具。

目的:探讨乙醛脱氢酶2（ALDH2）基因多态性与对乙酰氨基酚（APAP）药物所致肝功能异常的相关性。方法:采用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建ALDH2基因敲除小鼠模型，将获得的杂合子型小鼠与异性杂合子交配，提取子代小鼠鼠尾基因组DNA，采用聚合酶链反应（PCR）方法进行ALDH2基因型鉴定；进一步采用APAP在野生型和ALDH2基因敲除小鼠中诱导急性药物性肝损伤模型，采集小鼠血液和肝脏组织行肝功能指标检测及苏木素-伊红染色、F4/80免疫组织化学检测等。组间均数比较采用单因素方差分析、LSD- t检验方法进行两两比较。 结果:ALDH2基因敲除小鼠成功繁殖，子代小鼠基因型分别为野生型（ALDH2 +/+）、杂合突变型（ALDH2 +/-）、纯合突变型（ALDH2 -/-）。APAP造模后的生化和组织学实验结果表明：空白对照组的丙氨酸转氨酶（ALT）、天冬氨酸转氨酶（AST）、碱性磷酸酶（ALP）、总胆红素（TBil）水平无明显升高；与空白对照组相比，APAP实验组的ALT、AST、ALP和TBil水平均显著升高（ P值均<0.05），其中突变组的ALT（ P ?=?0.004）、AST（ P ?=?0.002）、TBil（ P ?=?0.012）水平显著高于野生型组，且这些指标在纯合突变型的表达水平也显著高于杂合突变型（ P值分别为0.003、0、0.006）。另外，杂合突变组小鼠的ALP水平高于纯合突变组（ P ?=?0.085）和野生型组小鼠，但只与野生型小鼠的比较差异具有统计学意义（ P ?=?0.002）。HE染色结果显示APAP实验组小鼠出现肝细胞变性、坏死，炎性细胞浸润增多，以突变型小鼠最明显；同时，F4/80免疫组织化学染色结果显示APAP实验组小鼠肝组织内可见棕褐色颗粒，其表达水平较空白对照组明显增高。 结论:APAP所致肝功能异常与ALDH2基因多态性相关，ALDH2突变型小鼠在APAP造模后的肝损伤症状有所加重，ALDH2基因缺陷可能在一定程度上加重APAP诱导的肝生物化学指标异常。

目的:探讨运用CRISPR/Cas9基因编辑技术高效构建热休克因子1（heat shock factor 1，HSF1）基因敲除的小鼠模型，为小鼠原发骨肉瘤模型建立前期基础。方法:根据Hsf1基因结构的第9外显子选择相应的gRNA（guide RNA）并进行筛选，通过PCR扩增出sgRNA（small guide RNA）转录模版，得到4个上游引物。随后将sgRNA进行体外转录并通过TubeScreen平台筛选，筛选切割有效的sgRNA，从筛选结果中选取切割效率最高的sgRNA用于后续实验。运用PCR扩增出转录spCas9mRNA的模板，接着体外转录Cas9mRNA。将体外转录得到的sgRNA与Cas9mRNA一起注射入健康的C57BL/6小鼠受精卵内，剪取出生小鼠尾巴提取组织并进行PCR测序鉴定。选取F0代杂合子母鼠与野生型公鼠交配得到F1代子鼠，结合琼脂凝胶电泳和基因测序检测F1代鼠基因碱基的突变情况。选取F1代杂合子公鼠与F0代母鼠回交得到F2代子鼠，剪取鼠尾组织并测序，最终得到F2代纯合子敲基因小鼠。运用PCR观察sgRNA切割效率与鼠尾组织的测序，通过观察凝胶电泳结果来判断小鼠是否为杂合，同时利用snapgene软件进行基因序列比对判断碱基片段缺失。结果:经PCR扩增得到上游引物sgRNA-1primer-F、sgRNA-2primer-F、sgRNA-3primer-F、sgRNA-4primer-F与下游引物sgRNAprimer-R。经过sgRNA的体外转录和筛选，sgRNA-1, sgRNA-2和sgRNA-4切割效率高，被选取用于后续实验。将T7promoter添加到Cas9mRNA的5’端，运用PCR和体外转录试剂盒得到Cas9mRNA。把混合的Cas9-sgRNA溶液注入到小鼠受精卵中并进行培养。把培养至二细胞的受精卵注射到假孕母鼠的壶腹部，并成功获得F0代小鼠。通过琼脂凝胶电泳结果判断共得到F0代杂合子小鼠8只。将F0代3号杂合子母鼠与健康的野生型公鼠繁育后，结合PCR与测序比对，共得到F1代杂合子基因敲除小鼠3只。将三只F1代杂合子公鼠与F0代3号母鼠回交，得到F2代小鼠。通过对F2代小鼠电泳和测序比对的结果观察，证实7只小鼠缺失Hsf1碱基序列，电泳结果为突变型条带且不存在野生型条带，鉴定为纯合子；得到的F2代纯合子小鼠能够稳定繁育，结果证明本实验成功建立Hsf1基因敲除小鼠模型。结论:成功运用CRISPR/Cas9技术构建Hsf1基因敲除小鼠模型，稳定性强，可重复性高，为进一步研究Hsf1基因表达产物及原发骨肉瘤小鼠模型的建立奠定了基础。

目的:构建α细胞特异性血管紧张素转换酶2(ACE2)敲除小鼠模型，为研究胰岛α细胞ACE2功能提供基础。方法:利用Cre/loxP系统，将雌性ACE2 loxP/WT与雄性Gcg-cre +/－小鼠进行交配，取鼠尾组织，通过PCR法鉴定子代基因型。选取基因型为ACE2 loxP/y Gcg-cre +/－的雄性小鼠为实验所需要构建的模型小鼠(αACE2KO小鼠)。采用免疫荧光和免疫组织化学法检测ACE2表达。采用独立样本 t检验。 结果:免疫荧光分析提示，在Gcg-Cre小鼠胰岛中，(55.14±25.33)%的α细胞表达ACE2，然而αACE2KO小鼠胰岛α细胞中未检测到ACE2表达( t＝14.202， P<0.01)，同时αACE2KO小鼠的肝、肾、肺、心和骨骼肌中仍然表达ACE2。 结论:成功利用Cre/loxP原理特异性敲除α细胞ACE2，为研究胰岛局部α细胞ACE2功能提供动物模型和基础。

目的 建立和鉴定整合素β样蛋白1基因(Itgbl1)启动子指导下的Cre重组酶基因敲入小鼠.方法 利用CRISPR/Cas9基因编辑技术研制Itgbl1-Cre基因敲入小鼠.利用Itgbl1-Cre基因敲入小鼠与Cre的报道小鼠ROSALSL-tdTomato交配的子代小鼠进行遗传细胞谱系示踪.通过红色荧光蛋白tdTomato鉴定Itgbl1阳性细胞及其子代细胞的组织表达谱.通过多色免疫荧光染色利用多种细胞特异性的标志物鉴定阳性细胞及其子代细胞的细胞类型.结果与结论 tdTomato蛋白在舌下腺的黏液性腺泡细胞、胰岛细胞和胃的分泌细胞中特异性表达.此外,tdTomato在部分视网膜和脑的神经元细胞以及少量肠的浆膜层、骨关节软骨、骨膜和骨髓的细胞中表达.成功建立了首个在小鼠舌下腺的黏液性腺泡细胞中特异性表达Cre重组酶的转基因小鼠品系.

目的 基于 CRISPR/Cas9 基因编辑技术建立瘦素受体基因(leptin receptor,Lepr)与血管内皮一氧化氮合酶基因(endothelial nitric oxide synthase,eNos)双基因敲除(double-knockout,DKO)小鼠模型,构建晚期糖尿病肾病小鼠模型.方法 根据eNos基因制备对应的gRNA,将CRISPR-Cas9 体系显微注射于C57BL/Ks(BKS)背景小鼠的受精卵内.将受精卵转移至有假孕状态雌性小鼠的输卵管内部.幼鼠出生后经聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)鉴定及测序分析分选出为eNos+/-基因型的F0 代阳性小鼠,获得BKS背景下的Lepr基因杂合小鼠,即基因型为Leprdb/m 的Lepr-F0 代杂合子小鼠.将eNos-F0 与Lepr-F0 代小鼠杂交,获得eNos+/-/Leprdb/m 双杂合F1 代小鼠,将双杂合F1 代小鼠进一步交配,筛选得到Lepr与eNos双基因敲除小鼠.采用PCR法鉴定小鼠基因型,按基因鉴定结果 分为野生型(wild-type,WT)组与DKO组小鼠.监测各组小鼠体质量、血糖与饮水进食量;采用酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测小鼠尿白蛋白与尿肌酐水平,并计算尿白蛋白排泄率;苏木精-伊红(hematoxylin-eosin,HE)与过碘酸六胺银(periodic acid-silver metheramine,PASM)染色检查各组小鼠肾组织病理改变.结果 PCR检测结果 显示,成功构建leprdb/db/eNos-/-DKO小鼠.与同窝对照组相比,DKO小鼠的体质量、血糖水平与饮水进食量均显著高于同窝对照小鼠.DKO小鼠的尿白蛋白与尿白蛋白排泄率显著高于WT小鼠.病理学结果 显示,DKO小鼠的肾小球体积明显增大,系膜基质增生明显.结论 基于CRISPR/Cas9 基因编辑技术可成功构建leprdb/db/eNos-/-DKO小鼠,DKO小鼠可反映糖尿病肾病的典型表现,为深入研究糖尿病肾病的作用机制提供动物模型.

目的 运用Cre-loxP技术构建肝细胞特异性沉默信息调节因子3(silence information regulator 3,Sirt3)基因敲除(Sirt3 Δhep)小鼠,为研究肝细胞Sirt3 基因在疾病中的生物学功能提供重要动物模型.方法 将loxP标记的Sirt3flox/flox小鼠与 Alb-Cre 纯合子(Alb-Cre+/+)小鼠进行交配,F1 代Sirt3flox/-/Alb-Cre+/-小鼠再与Sirt3flox/flox小鼠进行交配并鉴定,F2 代基因型为Sirt3flox/flox/Alb-Cre+/-的小鼠即为本实验所构建的Sirt3 Δhep小鼠,Sirt3flox/flox/Alb-Cre-/-小鼠即为对照小鼠Sirt3flox/flox小鼠.提取鼠尾DNA,通过PCR鉴定子代小鼠的基因型;免疫荧光双染观察Sirt3 在小鼠肝细胞中的表达;提取Sirt3 Δhep小鼠原代肝细胞及心脏、脾脏、肾脏、肺组织蛋白,Western blot法验证Sirt3 在小鼠肝细胞及其他组织中的表达水平;HE染色观察小鼠肝脏及心脏、脾脏、肺等组织结构.结果 成功鉴定出Sirt3 Δhep小鼠;免疫荧光及Western blot结果显示,小鼠肝细胞中Sirt3 蛋白表达水平低于对照组小鼠(P<0.01),而Sirt3 Δhep小鼠的心脏、脾脏、肾脏和肺组织中Sirt3 表达与对照组相比无明显变化(P>0.05);HE染色结果显示Sirt3 Δhep小鼠肝脏、心脏、脾脏、肺、肾脏的组织学特征与对照组小鼠相比无明显变化.结论 成功构建肝细胞特异性Sirt3 基因敲除小鼠,为进一步研究肝细胞Sirt3 基因在相关疾病中的调控作用机制奠定了基础.

目的 构建髓系特异性Spi1 基因敲除小鼠并分析其基因型,为疾病病理机制及药物靶点研究提供动物模型基础.方法 根据CRISPR/Cas9 技术原理和Cre/LoxP系统,设计并构建sgRNA和Donor载体,以第2 号外显子(Exon 2)所在的转录本为敲除区域,在Exon 2 两侧各放置同向Loxp元件;将 Cas9 蛋白、sgRNA 和 Donor 载体混合显微注射到C57BL/6J小鼠的受精卵中,移植受精卵到假孕的C57BL/6J母鼠的子宫中,19～20 d后获得F0 代.将阳性F0 代小鼠与C57BL/6J小鼠交配,得到稳定的F1 代Spi1flox/+小鼠.F1 代Spi1flox/+小鼠雌雄自交得到Spi1flox/flox小鼠.Spi1flox/flox与Lyz2-Cre+小鼠交配得到 Spi1flox/+/Lyz2-Cre+小鼠,再将其与Spi1flox/flox交配,得到的Spi1flox/flox/Lyz2-Cre+小鼠为髓系特异性Spi1 基因敲除(KO)小鼠;Spi1flox/flox/Lyz2-Cre-小鼠作为野生型(WT)小鼠.提取WT和KO小鼠DNA,PCR扩增后琼脂糖凝胶电泳鉴定基因型;Western blot检测WT和KO小鼠免疫细胞中脾病灶形成病毒前病毒整合癌基因-1/富含嘌呤盒1(PU.1)表达.结果 PCR鉴定结果显示,采用flox引物鉴定时仅扩增出 220 bp 条带的小鼠,即基因型为Spi1flox/flox纯合子,采用Lyz2-Cre引物鉴定时扩增出700 bp的小鼠,基因型为Lyz2-Cre+;Western blot结果显示,与WT组比较,KO组小鼠骨髓来源巨噬细胞(BMDMs)和腹腔原位巨噬细胞(PM)中的PU.1 不表达(P<0.01);T细胞中KO小鼠PU.1 表达水平与 WT 小鼠差异无统计学意义;PCR 和Western blot结果均表明髓系特异性Spi1KO小鼠构建成功.结论 成功构建和鉴定髓系特异性Spi1KO小鼠,为进一步揭示PU.1 在免疫调节中的潜在机制研究提供动物模型基础.

目的 构建全身过表达人METRNL基因的小鼠模型(R26-L-METRNL+/-小鼠).方法 基于Cre-loxP系统利用Dppa3-Cre小鼠和实验室前期构建的人METRNL基因条件性过表达(R26-LSL-METRNL+/-)小鼠进行交配繁殖,得到目标R26-L-METRNL+/-小鼠.将该目标小鼠进行基因型鉴定,收集其血液及心、肝、脾、肺、肾、脑、白色脂肪和肌肉组织,利用实时荧光定量PCR技术、蛋白免疫印迹实验和血清酶联免疫吸附实验,考察人METRNL基因在小鼠的表达情况.结果 R26-L-METRNL+/-小鼠的人METRNL在组织mRNA水平、组织蛋白水平和血液蛋白浓度方面都有显著表达,远高于野生对照组小鼠.结论 R26-L-METRNL+/-小鼠模型构建成功.

藏羚(Pantholops hodgsonii)是青藏高原特有物种,多集群生活且具有典型的性别分离现象.除交配季节外,雌雄两性个体组成的同性集群分开活动.本研究于2021年12月下旬在三江源国家公园可可西里片区以藏羚集群为单元采集了 32个集群共188份新鲜粪便样品,利用多态性较高的10个微卫星位点进行亲缘关系鉴定与遗传多样性分析.结果表明:(1)188份新鲜粪便样品来自145只藏羚个体,其中10只藏羚个体(8只雌羚,2只雄羚)出现更换集群现象,导致前后集群发生变化.结合野外实地记录,推测藏羚交配群的变化存在3种方式:集群解散,雄性个体离开(加入),雌性个体离开(加入).新加入的藏羚个体与原集群成员间的亲缘关系较远.雄性藏羚更换的集群中雌性个体均多于之前的集群,能够获得更多交配机会.(2)10个微卫星位点的平均等位基因数为16.1,平均多态信息含量为0.766.观测杂合度(Ho)0.607-0.993,平均值为0.819;期望杂合度(He)0.575-0.930,平均值为0.798,表明藏羚种群遗传多样性丰富.(3)经过亲缘关系鉴定,种群内所有亲子关系中14对(43.75％)发生在集群内并且以母女(71.43％)为主,与雄性个体相关的亲子对(母子/父女/父子)有4对(28.57％).对比集群内及集群间藏羚的平均亲缘系数,结果表明雄性个体对集群内成员间的亲缘关系影响不大.针对集群间藏羚亲缘关系的研究结果也表明,藏羚种群的近交比例处于较低水平.由于藏羚雌性比雄性个体有更多时间和机会组成含有多个雌性成员的集群,因此,集群内雌性个体的亲缘关系较高不仅有利于提高集群的稳定性,还有利于迁徙信息的交流和传递,从而为进一步验证藏羚迁徙的集体记忆猜想提供科学佐证.