目的:探讨Runt相关转录因子2(RUNX2)在肾透明细胞癌(ccRCC)中的表达及其与患者预后和临床病理特征之间的关系。方法:基于肾癌肿瘤基因组图谱(TCGA)数据，分析RUNX2在癌和癌旁组织中的表达及其预后价值。采用多色免疫荧光标记(mIHC)技术分析RUNX2在癌和癌旁组织中的分布特征，并结合临床资料进行 χ2检验。单因素和拟合多因素Cox模型分析RUNX2及其他指标的预后价值。基于TCGA数据库，探讨RUNX2与免疫细胞浸润的相关性。 结果:TCGA数据分析结果显示，RUNX2在癌组织中的表达显著高于正常组织( P<0.001)。mIHC结果表明RUNX2在癌组织表达水平高于癌旁组织( Z＝－2.123， P<0.05)，且其表达水平与患者总生存期呈负相关[ P<0.01，风险比( HR)＝2.768，95%可信区间( CI)：1.120~6.838]。RUNX2表达水平与患者美国癌症联合委员会(AJCC)临床分期明显相关( χ2＝4.505， P<0.05)。多因素Cox回归模型显示年龄( P<0.01， HR＝1.068，95% CI：1.024~1.113)、病理分级( P<0.05， HR＝2.171，95% CI：1.179~3.997)和AJCC分期( P<0.05， HR＝4.638，95% CI：1.086~19.793)均可以作为肾癌患者的独立预后因素。基于TCGA数据库分析，证实肾癌组织中RUNX2与多种免疫细胞的浸润程度相关。 结论:RUNX2高表达与肾癌患者不良预后明显相关。

目的:通过研究中国恒河猴外周血淋巴细胞免疫表型及其功能，为以恒河猴为模型的研究提供数据参考。方法:通过优选抗体克隆和荧光配色，确定了主要淋巴细胞亚群检测和T细胞功能检测Panel，并用此方法分析15只健康中国恒河猴外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)中T、B、NK等多种细胞亚群的比例，以及在非特异性刺激条件下T细胞分泌细胞因子的能力。结果:成功建立了两套多色流式Panel，Panel 1可同时检测细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T-lymphocyte, CTL)、滤泡辅助性T细胞(follicular helper T cell, Tfh)、调节性T细胞(regulatory T cells, Treg)、B细胞和NK细胞等多种淋巴细胞亚群，Panel 2可检测多种T细胞亚群功能和免疫检查点分子的表达。中国恒河猴PBMCs中主要淋巴细胞亚群比例的平均值分别为T细胞(75.32±7.73)%、B细胞(13.22±7.50)%、NK细胞(0.88±0.48)%、Tfh细胞(0.73±0.27)%、Treg细胞(0.75±0.43)%、CD16 +NK细胞(47.87±22.35)%、CD56 +NK细胞(10.69±12.41)%。非特异性刺激后，分泌IL-2和TNF-α的CD4 +T细胞比例高于CD8 +T细胞，分泌CD107a和IFN-γ的CD8 +T细胞比例高于CD4 +T细胞，而这两种细胞分泌IL-17A的比例均较低。 结论:本研究建立了可在单细胞水平同时检测多个细胞表面分子和分泌因子的多色流式检测方案，能够准确、全面地分析恒河猴PBMCs中免疫细胞亚群、免疫功能以及免疫检查点分子的表达，为利用恒河猴模型进行传染病疫苗及药物研发提供新的实验方法和基础数据。

目的:探讨双肾上腺素皮质样激酶1(DCLK1)在胰腺癌中促进细胞迁移、侵袭与增殖的分子机制。方法:基于癌症基因组图谱(TCGA)数据库与基因型-组织表达(GTEx)数据库，分析DCLK1与Hippo通路的相关性并采用胰腺癌组织芯片荧光染色进一步证实。细胞水平上，通过细胞爬片免疫荧光染色以及Western blot实验验证DCLK1对Hippo通路下游效应分子yes相关蛋白1(YAP1)是否具有调控作用，实时荧光定量聚合酶链反应分析YAP1结合转录因子TEA-DNA结合蛋白(TEAD)以及下游促恶性行为分子CYR61、EDN1、AREG、CTGF的表达。利用Hippo通路抑制剂Verteporfin处理细胞，采用Transwell实验检测DCLK1过表达细胞的迁移、侵袭能力是否受到抑制，采用实时无标记细胞分析实验检测细胞增殖指数的变化。结果:TCGA和GTEx数据库数据分析显示，胰腺癌组织中DCLK1和YAP1的表达水平高于癌旁正常组织(均 P<0.05)。相关性热图提示，DCLK1与YAP1所在的Hippo通路有关，其中LATS1( r＝0.53)、LATS2( r＝0.34)、MOB1B( r＝0.40)等均与DCLK1表达呈正相关(均 P<0.05)。胰腺癌患者组织芯片经多色荧光染色显示，胰腺癌DCLK1高表达患者伴随YAP1表达上调。胰腺癌AsPC-1与PANC-1细胞中DCLK1呈低表达，过表达DCLK1可促进YAP1进入细胞核。过表达DCLK1上调YAP1结合转录因子TEAD的表达并增加下游促迁移、侵袭、增殖分子mRNA的表达。使用Hippo通路抑制剂Verteporfin则可降低DCLK1高表达介导的细胞迁移、侵袭、增殖能力增加。AsPC-1 DCLK1过表达细胞的迁移数为(68.33±7.09)个，Verteporfin处理后的细胞迁移数为(22.00±4.58)个，差异有统计学意义( P<0.05)。PANC-1对照组细胞的迁移数为(37.00±6.00)个，DCLK1过表达细胞的迁移数为(65.66±8.73)个，Verteporfin处理后两组细胞迁移数为(19.66±3.05)个和(32.33±9.61)个，差异均有统计学意义(均 P<0.05)。DCLK1过表达胰腺癌细胞侵袭数高于DCLK1对照组细胞以及Verteporfin处理后的DCLK1过表达细胞(均 P<0.05)。实时无标记细胞分析实验证实DCLK1过表达的AsPC-1细胞增殖指数为0.66±0.04，高于AsPC-1对照细胞的增殖指数(0.38±0.01， P<0.05)，高于Verteporfin处理后的DCLK1过表达AsPC1细胞(0.05±0.03， P<0.05)。而PANC-1 DCLK1过表达细胞的增殖指数为0.77±0.04，高于Verteporfin处理后的DCLK1过表达PANC1细胞(0.14±0.05， P<0.05)。 结论:DCLK1与Hippo通路显著相关且通过激活Hippo通路促进胰腺癌细胞迁移、侵袭与增殖。

目的:探讨初始骨转移与肺转移的骨肉瘤基因组学表现差异及发病机制。方法:收集2021年5月1日至10月1日于北京大学人民医院诊治的38例高级别骨肉瘤患者肿瘤新鲜标本及部分石蜡包埋标本，男29例、女9例，年龄（19.6±2.2）岁（范围6~61岁）。38例中12例发生初始骨转移、26例发生初始肺转移，其中15例（40%，15/38）具有原发灶和转移灶的配对标本。应用Illumina NovaSeq 6000平台进行全外显子测序及转录组测序，并随治疗进程获取肿瘤演进过程中的新鲜配对标本，分析不同进展模式的骨肉瘤配对标本的全外显子组测序数据，进一步根据其基因型表现进行疾病亚分类，将基因学表现与临床过程进行关联。结果:骨转移组以单核苷酸变异为主（83%，10/12），肺转移组以结构变异为主（58%，15/26）。骨转移组的肿瘤突变负荷为4.9（2.8，12.0）、新抗原负荷为743.0（316.5，1 034.5），较肺转移组的2.4（1.4，4.5）和128.5（49.0，200.5）更高，差异均有统计学意义（ P=0.010， P=0.003）。突变谱示骨转移组[0.33（0.13，0.60）]和肺转移组[0.10（0.00，0.13）]在与年龄有关的基因特征1上的差异有统计学意义（ P=0.005）。以随机表法每组各选择3例患者进行多色免疫荧光染色，骨转移组中1例发现了三级淋巴结构。通过对配对标本进行进化图谱分析发现骨肉瘤配对标本的已知基因呈高度保守。 结论:以单核苷酸变异为主而非结构变异的骨肉瘤可能容易发生初始骨转移，此类患者年龄更大，肿瘤微环境的免疫源性可能更高。

目的:探讨肾透明细胞癌(ccRCC)肿瘤内胶原纤维丰度和纤维性假包膜状态与患者预后的关系。方法:检索癌症基因组图谱(TCGA)数据库中530例ccRCC患者的资料。男344例，女186例。年龄≤ 60岁264例，> 60岁266例；G 1~2级241例，G 3~4级281例，未确定分级8例；2017年美国癌症联合委员会(AJCC)分期Ⅰ~Ⅱ期322例，Ⅲ~Ⅳ期205例，未确定分期3例；M 0期420例，M 1期78例，无法评估远处转移情况32例。采用R语言和RStudio软件，分析ccRCC中编码Ⅰ型胶原的COL1A1 mRNA水平与患者预后的相关性。回顾性分析北京大学人民医院2005年11月至2017年11月病理证实的158例非囊性ccRCC患者的资料。男112例，女46例；年龄≤ 60岁100例，>60岁58例；G 1~2级111例，G 3~4级47例；AJCC分期Ⅰ~Ⅱ期144例，Ⅲ~Ⅳ期14例。取患者石蜡切片进行Masson染色、天狼星红染色和多色免疫荧光染色，评估肿瘤组织内及假包膜的胶原纤维丰度，采用HE染色评估ccRCC纤维性假包膜状态。Kaplan-Meier生存曲线分析肿瘤内胶原纤维丰度和纤维性假包膜状态与ccRCC患者总生存率的关系。 结果:TCGA数据库的转录组学结果提示，ccRCC肿瘤组织COL1A1 mRNA表达水平高于癌旁正常组织( P<0.001)；COL1A1 mRNA高表达组患者总生存率显著低于低表达组( HR＝1.165， P＝0.002)；高COL1A1/COL3A1 mRNA比值患者的总生存率低于低COL1A1/COL3A1 mRNA比值者( HR＝1.901， P<0.001)。对本中心30例肿瘤组织及癌旁正常组织行Masson染色，结果显示肿瘤组织胶原纤维丰度高于癌旁组织[41.0(14.0~75.0)与15.0(3.0~57.0)， P<0.001]；天狼星红染色结果也显示肿瘤组织胶原纤维丰度高于癌旁组织[42.5(10.0~90.0)与10.0(2.5~60.0)， P<0.001]。高胶原纤维组ccRCC患者的病理分级G 3~4级比例高于低胶原纤维组[38.5%(30/78)与21.3%(17/80)， OR＝2.316，95% CI 1.146~4.681, P＝0.023]。158例中位随访时间73.5(4~135)个月。Kaplan-Meier生存曲线分析结果显示，低胶原纤维组5年总生存率显著高于高胶原纤维组(88.75%与74.36%， HR＝2.630， P＝0.007)。纤维性假包膜不完整者5年总生存率显著低于纤维性假包膜完整者(52.94%与85.11%， HR＝11.140， P<0.001)。 结论:ccRCC肿瘤内胶原纤维水平呈现过度表达，肿瘤内胶原纤维富集、纤维性假包膜不完整可能提示较差的生存预后。

目的 建立和鉴定整合素β样蛋白1基因(Itgbl1)启动子指导下的Cre重组酶基因敲入小鼠.方法 利用CRISPR/Cas9基因编辑技术研制Itgbl1-Cre基因敲入小鼠.利用Itgbl1-Cre基因敲入小鼠与Cre的报道小鼠ROSALSL-tdTomato交配的子代小鼠进行遗传细胞谱系示踪.通过红色荧光蛋白tdTomato鉴定Itgbl1阳性细胞及其子代细胞的组织表达谱.通过多色免疫荧光染色利用多种细胞特异性的标志物鉴定阳性细胞及其子代细胞的细胞类型.结果与结论 tdTomato蛋白在舌下腺的黏液性腺泡细胞、胰岛细胞和胃的分泌细胞中特异性表达.此外,tdTomato在部分视网膜和脑的神经元细胞以及少量肠的浆膜层、骨关节软骨、骨膜和骨髓的细胞中表达.成功建立了首个在小鼠舌下腺的黏液性腺泡细胞中特异性表达Cre重组酶的转基因小鼠品系.

目的:观察组蛋白乳酸化修饰在头颈肿瘤中的表达水平及乳酸对肿瘤细胞增殖能力的影响.方法:应用多色免疫荧光组织芯片检测69例头颈肿瘤组织中泛乳酸化(PKLa)和组蛋白H3K9乳酸化(H3K9La)的修饰水平,分析其与患者临床特征的关系.在头颈肿瘤细胞受到乳酸刺激后,使用蛋白免疫印迹技术检测PKLa、H3K9La的修饰水平改变.采用SPSS 17.0软件包对数据进行统计学分析.结果:头颈肿瘤组织中PKLa修饰水平显著高于正常黏膜组织.临床样本分析表明PKLa修饰水平与年龄、TNM分期显著相关(P＜0.05),而与性别、颈淋巴结转移、病理分化无相关性(P＞0.05).蛋白免疫印迹结果证明,组蛋白是头颈肿瘤细胞乳酸化主要的响应蛋白,乳酸刺激能够提高头颈肿瘤细胞增殖能力,进一步确定头颈肿瘤细胞中H3K9La修饰具有乳酸依赖上调.免疫荧光染色证明,头颈肿瘤组织H3K9La水平较高.结论:头颈肿瘤患者中具有较高的组蛋白乳酸化修饰水平,与头颈肿瘤进展有潜在关系.

目的:分析慢性粒细胞白血病(CML)免疫学表型,探讨其特点和意义.方法:用多色流式细胞术分析40例CML患儿和40例对照骨髓免疫表型,CD45/SSC基础设门圈出中性粒细胞,分析粒细胞表面CD分子表达率在≥ 1％、≥5％、≥ 20％3个范围的分布情况,并统计比较两组CD分子的表达率(≥ 1％的纳入统计)和平均荧光强度(MFI)差异.结果:CML组的粒细胞比例为(82.1±6.4)％,显著高于对照组的(57.8±11.8)％(P＜0.001).CML组和对照组粒细胞CD15/CD11b/CD33/CD13表达率较高,均分布在≥ 20％的范围,CD33/CD13分化轨迹正常且表达率和MFI无显著差异,但CML组CD11b表达率以及CD15 MFI都显著低于对照组(P＜0.001).两组CD10表达率和MFI无显著差异且表达水平在不同范围分布情况一致.CML组CD56异常表达病例数多,表达率高,有52.5％的病例CD56表达率≥5％,42.5％的病例CD56表达率≥20％,而对照组不表达CD56(＜1％).两组CD117的表达率分布不同,在表达率≥ 5％区间,CML组有35.0％的病例,而对照组只有2.5％.CML组CD117表达率高于对照组(P＜0.001),而MFI无显著差异.结论:CML的免疫分型表现为成熟的中性粒细胞比例升高、CD15 MFI减弱、CD11b比例减少、CD117表达增高以及可伴异常CD56表达,用流式细胞术分析免疫表型可以有效区分正常粒细胞和慢性粒细胞,有助于慢性粒细胞白血病辅助诊断.

目的 探讨Runt相关转录因子2(RUNX2)在肾透明细胞癌(ccRCC)中的表达及其与患者预后和临床病理特征之间的关系.方法 基于肾癌肿瘤基因组图谱(TCGA)数据,分析RUNX2在癌和癌旁组织中的表达及其预后价值.采用多色免疫荧光标记(mIHC)技术分析RUNX2在癌和癌旁组织中的分布特征,并结合临床资料进行x2 检验.单因素和拟合多因素Cox模型分析RUNX2及其他指标的预后价值.基于TCGA数据库,探讨RUNX2与免疫细胞浸润的相关性.结果 TCGA数据分析结果显示,RUNX2在癌组织中的表达显著高于正常组织(P＜0.001).mIHC结果表明RUNX2在癌组织表达水平高于癌旁组织(Z=-2.123,P＜0.05),且其表达水平与患者总生存期呈负相关[P＜0.01,风险比(HR)=2.768,95％可信区间(CI):1.120～6.838].RUNX2表达水平与患者美国癌症联合委员会(AJCC)临床分期明显相关(x2=4.505,P＜0.05).多因素Cox回归模型显示年龄(P＜0.01,HR=1.068,95％CI:1.024～1.113)、病理分级(P＜0.05,HR=2.171,95％CI:1.179～3.997)和 AJCC 分期(P＜0.05,HR=4.638,95％CI:1.086～19.793)均可以作为肾癌患者的独立预后因素.基于TCGA数据库分析,证实肾癌组织中RUNX2与多种免疫细胞的浸润程度相关.结论 RUNX2高表达与肾癌患者不良预后明显相关.

目的 建立多色流式胞内细胞因子检测方法,明确慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B,CHB)免疫清除期患者外周血Th淋巴细胞亚群细胞因子的分泌特点,探讨CHB患者多重细胞因子的表达模式.方法 选取2017年3月至2017年4月就诊于首都医科大学附属北京地坛医院的CHB免疫清除期患者10例及健康对照者10例为研究对象.根据多色流式荧光搭配原则,确立外周血T淋巴细胞CD3、CD4、CD8及细胞因子GM-CSF、TNF-α、IFN-γ的六色流式细胞配色方案.利用健康对照者外周血单个核细胞(peripheral blood mo-nonuclear cell,PBMC)调节最适检测电压及荧光补偿,明确PMA-Ionomycin的体外刺激方案.分离10例CHB患者外周血PBMC细胞,PMA-Ionomycin体外刺激5小时后,行多重流式细胞因子染色,利用多色流式细胞仪LSR Fortessa获取细胞,Flowjo10.0流式细胞软件分析健康对照者及CHB患者外周血Th细胞亚群胞内细胞因子共表达水平.采用GraphPadPrism 7.0对所得数据进行统计分析.结果 建立了多重细胞因子的胞内染色方案,明确了GM-CSF、TNF-c、IFN-γ在Th细胞上的共表达分析策略,确认存在分泌双重细胞因子GM-CSF+TNF-α+、GM-CSF+IFN-γ+的Th细胞亚群.通过检测CHB患者外周血样本,发现CHB患者分泌GM-CSF、GM-CSF+ TNF-α+、GM-CSF+ IFN-γ+的Th细胞亚群百分率均显著高于健康对照组,差异具有统计学意义(t=2.576、4.208、2.671,P均＜0.05).结论 建立的多色流式细胞因子胞内染色方案可用于明确CHB患者外周血分泌双重细胞因子的Th细胞亚群的分布模式;双重细胞因子分泌的Th细胞亚群的检测可能为临床上CHB患者免疫状态的评估提供可靠依据.