目的:描述我国0~5岁儿童食物过敏流行情况，并探讨影响因素。方法:数据来源于2016-2017年中国儿童与乳母营养健康监测，采用多阶段分层随机抽样方法，在全国31个省（自治区、直辖市）抽取275个监测点开展营养健康监测。最终纳入70 107名0~5岁儿童作为研究对象。以面对面问卷调查的方式收集调查对象的人口学特征和食物过敏等相关信息。对数据经过复杂加权后计算食物过敏患病率，采用logistic回归模型分析食物过敏患病率相关的影响因素。结果:0~5岁儿童食物过敏自报患病率为4.81%，其中，0~5月龄、6~23月龄婴幼儿以及2~5岁学龄前儿童的食物过敏自报患病率分别为0.81%、4.68%和5.26%。logistic分析结果提示，6月龄至5岁、城市、西南地区、头胎、大专及以上文化程度母亲的儿童食物过敏自报患病率较高。常见的过敏食物为虾类、禽蛋类、蟹贝类、水果、奶类和鱼类，食物过敏自报患病率分别为1.55%、1.25%、0.99%、0.97%、0.87%和0.86%。过敏儿童中对单一食物过敏的比例为69.85%。结论:我国0~5岁儿童的食物过敏自报患病率随着年龄的增长而上升，常见的过敏食物为虾类、蟹贝类、鱼类、禽蛋类、奶类和水果等，大部分食物过敏儿童属于单一食物过敏。

目的:对一株自脓毒血症患者血液中分离的罕见螺原体DGKH1进行菌种鉴定和生物学特性分析。方法:对DGKH1进行常规细菌培养、染色与形态学观察、生理生化鉴定、16S rRNA基因测序和系统发育分析，以及基因组测序和基因组相关指数分析，从而确定其分类学地位；参考人型副支原体和解脲脲原体进行药敏试验。结果:分离株DGKH1可以在哥伦比亚血平板、巧克力平板和嗜血巧克力平板上微弱生长，在含有四环素(4 μg/ml)、多西环素(1 μg/ml)、米诺环素(1 μg/ml)、交沙霉素(2 μg/ml)、罗红霉素(1 μg/ml)、克拉霉素(1 μg/ml)和特利霉素(1 μg/ml)的支原体液体培养基中不生长。在商品化的支原体固体培养基上，DGKH1可形成"油煎蛋样菌落"，与人型副支原体相类似。采用常规革兰染色，DGKH1不着色；以磷酸盐缓冲液为基质进行透射电镜观察，其菌体呈螺旋形。16S rRNA基因测序显示，分离株与中华绒螯蟹螺原体CCTCC M 207170 T相似性最高(99.85%)，但尿素分解试验阳性，与已知螺原体属菌种存在差异。全基因组系统发育分析显示，该菌株与中华绒螯蟹螺原体CCTCC M 207170 T聚类为同一个小的分支，但两者之间的全基因组平均核苷酸一致性(ANI)和数字DNA-DNA杂交(dDDH)值分别为94.14%和56.00%，均低于原核生物的种鉴定阈值。 结论:分离株DGKH1隶属于螺原体属，是一种与中华绒螯蟹螺原体亲缘关系密切的潜在新种，其部分微生物学特性与支原体相类似，但自然宿主来源和流行病学资料还有待于更深入研究。

通过对长江口水域环境DNA(eDNA)样品的采集和荧光定量PCR(qPCR)分析,并结合中华绒螯蟹亲蟹资源调查数据,探讨了eDNA技术在渔业资源监测中的应用前景.结果显示,2022年冬季长江口中华绒螯蟹亲蟹单位捕捞渔获量(CPUE)为(269.14±184.77)g/(net·h),表层水和底层水的中华绒螯蟹eDNA浓度分别为(14332.06±30560.85)和(15691.27±45132.77)copies/mL,两者与亲蟹的CPUE均呈极显著正相关关系,相关系数分别为0.912和0.883;CPUE与标准化后的表层水及底层水的eDNA浓度间的最佳拟合模型均为直线模型;影响表层水中华绒螯蟹eDNA浓度变化的主要环境因子为表层水盐度和底层水浊度.研究通过监测冬季长江口中华绒螯蟹CPUE与eDNA的关系,建立了中华绒螯蟹的资源监测定量分析模型,研究结果不仅能为水生生物资源监测等研究提供参考,对资源保护、生境修复等也具有重要的参考作用.

为探索喀斯特地区人工草地蜘蛛群落物种多样性及其分布的影响因子,该研究于2019年9月-2020年1月结合样方、陷阱、样线取样三种方法对黔西北油杉河新西兰牧场的蜘蛛群落物种多样性及影响蜘蛛分布的生境因子开展调查.结果表明:(1)捕获蜘蛛1642头,隶属于15科53属69种,不同功能群排序为:结圆网型蜘蛛＞伏击型蜘蛛＞游猎型蜘蛛＞结皿网型;优势科4科,分别为园蛛科(25.15％)、球蛛科(20.52％)、逍遥蛛科(15.1％)、和蟹蛛科(13.28％);优势种2种分别为远亲园蛛(17.17％)和虚逍遥蛛(14.49％).(2)12月时蜘蛛个体数量、物种数和Shannon-wiener指数与1月时蜘蛛优势度指数、11月时蜘蛛的均匀度指数均显著低于其他月份(P＜0.05),而蜘蛛丰富度指数先减后增,12月时最低,且11月、12月的蜘蛛丰富度指数均显著低于9月、10月、1月(P＜0.05).(3)对9个生境因子与蜘蛛多度进行线性拟合发现,海拔、空气湿度、植被物种数3个环境因子对蜘蛛多度有显著正效应(P＜0.05).(4)对9个生境因子与蜘蛛物种多样性进行CCA分析发现,9个环境因子对蜘蛛物种多样性的总解释度为70.98％,其中植被均匀度指数对蜘蛛物种多样性具有显著负效应(P＜0.05),土壤温度和空气温度对蜘蛛物种多样性具有显著正效应(P＜0.05).喀斯特地区人工草地蜘蛛的群落物种多样性与季节、气候、植被等因子有较强的相关性,利用蜘蛛进行草地病虫害防治一定要密切结合当地特定的环境、气候及土壤等因子.

目的:建立2种灵敏度高、特异性好且快速的ELISA方法,用以检测食蟹猴血浆中的聚乙二醇重组人促细胞生成素(EP0)含量.方法:建立了2套双抗夹心的ELISA方法对聚乙二醇重组人EPO进行定量,包括PEG特异性ELISA(检测完整药物)及EPO特异性ELISA(检测总EPO).完整药物检测:包被小鼠抗重组人EPO单抗,加入稀释的血浆样品,之后加入稀释的生物素标记的兔抗PEG单抗(检测抗体)及链亲和素-HRP(酶标抗体),再加入TMB底物显色,2 mol/L硫酸终止,在酶标仪上用双波长读取D450/600nm值.总EPO检测:包被小鼠抗重组人EPO单抗,加入稀释的血浆样品,之后加入稀释的兔抗重组人EPO多抗-HRP(酶标抗体),再加入TMB底物显色,2 mol/L硫酸终止,在酶标仪上用双波长读取D450/600nm值.结果:建立并验证了2套ELISA方法,定量范围均为4～54 ng/mL,定量下限均为4 ng/mL,准确度和精密度(板内和板间)均在±15％之内(总EPO检测时以聚乙二醇重组人EPO为标准品),同时室温稳定性、冻融稳定性、长期稳定性及稀释线性(空白猴血浆稀释)均良好.结论:方法学确证表明,2套ELISA方法具有良好的灵敏度、准确度、特异性和可重复性,可用于定量测定食蟹猴血浆中聚乙二醇重组人EPO的浓度.

在长江口中华绒螯蟹亲蟹生殖洄游期间,通过研究中华绒螯蟹放流群体和自然群体繁殖力随壳宽的变化规律,比较放流群体和自然群体繁殖力的差异,从而评估人工增殖放流亲蟹的繁殖力.结果显示,随着壳宽的增大,中华绒螯蟹放流群体和自然群体的繁殖力都显著增加(P＜0.05).在相同壳宽范围内,放流群体和自然群体的繁殖力之间没有显著差异(P＞0.05).回归分析显示,放流群体繁殖力(F)与壳宽(CW)呈幂函数关系:F=3.979 CW6.208(R2=0.822);自然群体F-CW呈幂函数关系:F=1.696CW6.636(R2=0.673).协方差分析显示,放流群体与自然群体F-与CW的两条曲线在显著性为0.05时拟合较好.研究结果表明,放流群体与自然群体的繁殖力与壳宽之间无显著性差异,推断放流亲蟹能够适应长江口天然水域环境,并与自然群体的繁殖力水平相当.

C型溶菌酶是存在于各种生物组织中的重要的先天性免疫蛋白,是开发天然抑菌剂的良好候选者.以甲壳类动物三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)C型溶菌酶成熟肽为研究对象,首先通过RT-PCR克隆其编码基因"ptlyC";以pPICZαA为表达载体,构建重组表达载体pPICZαA-ptlyC,电转至毕赤酵母(Pichia pastoris)X-33后,通过高浓度的博来霉素筛选到高拷贝酵母转化子;在28℃、250 r/min和pH6.0的条件下,经1%的甲醇诱导表达72 h,得到含重组ptlyC的培养液上清;经固化金属离子亲和层析(IMAC)纯化,得到分子量约为25.3 kD的纯化产物.通过菌落计数法证明含重组ptlyC的培养液上清具有抑制革兰氏阳性的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的活性;通过琼脂糖凝胶扩散法证明纯化的重组ptlyC具有抑制革兰氏阴性的铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)和沙门氏菌(Salmonella lignieres)的活性.

采用cDNA末端快速扩增技术(RACE)克隆获得了中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)胰脂酶基因(pancreatic lipase,PL)的cDNA序列全长.该序列全长1 970 bp,开放阅读框长度为1 374 bp,编码457个氨基酸,5'和3'非编码区(UTR)长度分别为372 bp和224 bp.理化分析表明其预测分子量为51.066kD,理论等电点为4.65.其序列中检测到脂肪酶典型的催化三联体结构、“盖子”结构以及“亲核弯”结构.蛋白同源性和进化树分析表明,中华绒螯蟹胰脂酶和其他物种同源性较高(50％左右),且和甲壳动物聚为一支而与脊椎动物相聚较远.组织表达模式分析表明,EsPL基因主要在肝胰腺、肠道、胸神经节表达较高;幼体发育阶段表达模式分析表明,EsPL基因在溞状幼体Ⅰ～Ⅲ期表达量逐渐递增,Ⅳ期显著下降,V期较Ⅳ又显著增加,大眼幼体阶段表达最低;同一脂肪水平下,相比于含高不饱和脂肪酸的鱼油而言,植物油如豆油和亚麻油的添加均会增加胰脂酶基因的表达,且亚麻油鱼油混合油组促进效果最显著.上述结果表明饵料脂类显著影响中华绒螯蟹胰脂酶,从而为提高中华绒螯蟹对饵料脂类利用率提供了研究依据.

Crustin是一系列富含半胱氨酸的甲壳动物来源的抗菌肽,是甲壳动物非特异性免疫机制中的重要免疫因子,其生物学功能由C端的成熟肽区域决定.参考三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)PtCrustin2成熟肽的cDNA序列,根据毕赤酵母(Pichia pastoris)的密码子偏爱性对其相关密码子进行优化,合成5''端含XhoⅠ限制性位点和Kex2信号肽酶切位点、3''端含XbaⅠ限制性位点和6×his标签的目的基因"smPtCrustin2";以pPICZαA为表达载体,构建重组表达载体pPICZαA-smPtCrustin2,将其转入毕赤酵母X-33细胞后,通过含高浓度博来霉素的抗性平板筛选高拷贝甲醇利用快速型酵母转化子;筛选获得的酵母转化子在28℃、250 r/min条件下,使用0.5％甲醇诱导表达目的蛋白,并通过固化金属离子亲和层析(IMAC)对其进行分离纯化.Tricine-SDS-PAGE分析显示:纯化的重组体smPtCrustin2的分子量约为9.6 ku,并形成分子量约20 ku的二聚体.Western Blot分析进一步证明了纯化产物为预期的目的蛋白.建立的毕赤酵母表达系统获得了表达量为22.4 mg/L的重组体smPtCrustin2.

甲壳素酶具有广泛的工业应用前景,如可将虾壳、蟹壳和其他甲壳废物降解成以几丁寡糖为主的高附加值产品,但野生型甲壳素酶催化效率低,大大限制了几丁寡糖的生产.笔者在前期研究中表达了一个具有较高效催化效率的甲壳素酶Chisb,并对其酶学性质进行了初步研究.为进一步提高甲壳素酶Chisb的催化效率,以R13NprB-C-SP-H为亲本,采用易错PCR(Error-prone PCR)技术构建随机突变体文库,对甲壳素酶Chisb进行定向进化.经过96孔板初筛和摇瓶复筛,获得了两个催化效率进一步提高的突变体C43D和E336R.对突变体的酶学性质进行分析,C43D和E336R的最适催化温度为55℃,C43D的最适pH为5.0,E336R的最适pH为9.0;其催化效率相比对照分别提高了1.35倍和1.57倍;而E336R和C43D催化产几丁寡糖的含量分别为2.53 g/L和2.06 g/L,相比对照(0.89 g/L)分别提高了2.84倍和2.31倍;底物转化率分别为84.3％和68.7％,相比对照(29.7％)分别提高了54.6％和39％.研究表明,通过易错PCR引入随机突变的方法能够有效提高甲壳素酶Chisb的催化效率.上述研究获得的催化效率提高的正向突变体及其酶学性质分析对生物转化合成几丁寡糖具有重要研究意义和应用价值.