目的:探讨来自不同家系12例遗传性蛋白C（PC）缺陷症先证者的基因突变类型与临床特征。方法:采用发色底物法检测血浆PC活性，酶联免疫吸附法检测PC抗原含量。采用PCR直接测序法分析先证者PROC基因9个外显子及其侧翼序列，对发现的疑似突变用反向（缺失突变用克隆）测序予以验证。结果:12例先证者的PC活性均明显下降（18%~55%），其中10例先证者的PC抗原水平显著降低（13%~58%）。共发现11种PROC基因突变，其中c.383G>A（p.Gly128Asp）、c.997G>A（p.Ala291Thr）、c.1318C>T（p.Arg398Cys）和c.532G>C（p.Leu278Pro）4种杂合突变为首次发现；6种突变发生在丝氨酸蛋白酶结构域、4种发生在表皮生长因子同源区域（EGF）、1种突变在EGF和丝氨酸蛋白酶结构域之间的激活肽区域；缺失突变（p.Met364Trp fsX15和p.Lys192del）2种，其余为错义突变。有3例无亲缘关系的先证者检出p.Phe181Val和p.Arg189Trp纯合或杂合突变。所有基因突变可能来自先证者的父亲和（或）母亲，其中2个家系存在近亲婚配。先证者有9例出现静脉血栓形成、2例有不良妊娠表现、1例出现紫癜。结论:PROC基因缺陷导致的PC缺陷症患者易发生静脉血栓形成，尤其当同时存在其他易栓因素时。

目的:探讨儿童多原发肿瘤的临床病理学特征及识别相关遗传肿瘤综合征。方法:收集上海交通大学医学院附属新华医院病理科2011—2023年诊断的4例儿童多原发肿瘤患者的临床病理资料，采用HE染色、免疫组织化学染色、PCR、Sanger测序及二代测序等方法观察组织学、免疫表型以及分子特征，并随访患者。结果:例1男，8岁，首发肾上腺皮质癌，5年后检出胃低分化腺癌；例2男，2岁，首发左侧侧脑室脉络丛癌，8个月后检出肝母细胞瘤；例3女，9个月，首发肾脏横纹肌样瘤，3个月后发现颅内非典型畸胎样/横纹肌样瘤；例4男，7岁，首发胶质母细胞瘤，3年后检出乙状结肠腺癌。4例患儿多原发肿瘤形态学及免疫组织化学均与相应的单发肿瘤相似，例1和例2经相关分子检测未检出特征性种系突变，例3经二代测序检测证实为横纹肌样瘤易感综合征，例4结合分子检测及临床特征明确与体质错配修复缺陷相关。结论:儿童多原发肿瘤是一类罕见的疾病，组织学形态和免疫表型与散发肿瘤相似，或散发，或与遗传肿瘤综合征相关。两种肿瘤可同时或异时发生，及早识别与遗传肿瘤综合征有关的患儿有助于实施定期肿瘤筛查并得到及时治疗。

目的:探究内质网氨基肽酶1（endoplasmic reticulum aminopeptidase 1， ERAP1）是否为子痫前期发病的遗传易感基因，以及 ERAP1参与子痫前期发病的分子机制。 方法:回顾性选择2018年9月至2021年4月在青岛大学附属医院、枣庄市妇幼保健院等6家山东省地级市三甲医院的990例子痫前期患者（病例组）和1 240例健康孕妇（对照组）。收集所有孕妇的外周血样本，提取DNA，通过Taqman探针聚合酶链反应技术进行rs30187、rs27044及rs469783位点的基因分型；并在构建 ERAP1野生型质粒的基础上使用点突变法构建2种错义变异质粒：rs30187（c.1583A>G）、rs27044（c.2188C>G），将不同的转染分子转染至Htr8细胞中，检测ERAP1的表达水平，并通过Transwell迁移实验、Transwell侵袭实验、细胞划痕实验和细胞增殖实验检测不同转染对细胞功能的影响，根据转染分子的不同，分为以下6组：敲低对照组、敲低组、过表达对照组、过表达组、变异1组及变异2组。采用两独立样本 t检验、秩和检验和 χ 2检验进行统计学分析。 结果:（1）rs30187位点的遗传学分布（基因型： χ 2=29.25；等位基因： χ 2=4.68）、rs27044位点的基因型分布（ χ 2=28.95）、rs469783位点的遗传学分布（基因型： χ 2=7.01，等位基因： χ 2=6.45）在病例组和对照组间差异有统计学意义（ P值均<0.05）。病例组中rs30187和rs27044位点均是隐性基因CC的频率更高（ χ 2值分别为20.82和19.97， P值均<0.05），而rs469783位点的显性基因中CC基因型的频率更低（ χ 2=5.82， P=0.016）。（2）细胞转染后，与敲低对照组相比，敲低组ERAP1的表达水平明显下降（mRNA：0.5±0.1与1.0±0.0， t=7.49；蛋白：0.4±0.1与0.7±0.1， t=2.81； P值均<0.05）；划痕48 h后，敲低组细胞迁移率明显下降［（16.5%±1.8%）与（23.8%±2.4%）， t=3.33， P=0.031］；细胞培养24 h后，敲低组Transwell细胞数量明显下降（423.7±21.3与499.0±24.6， t=3.29， P=0.031）。转染变异1组和变异2组后，与过表达组相比，ERAP1的mRNA和蛋白表达也均明显下降，Transwell小室细胞穿过的数量明显下降，划痕48 h后细胞迁移率均表现出下降趋势［变异1组： P=0.004，变异2组：（21.1±4.6）%与（28.3±1.1）%， t=2.10， P=0.099］。转染过表达组至细胞后，与过表达对照组相比，ERAP1的mRNA和蛋白表达明显上升，细胞的增殖能力增强，细胞划痕48 h后迁移率升高，24 h穿过Transwell小室的细胞数量增多，细胞侵袭能力增强（ P值均<0.05）。 结论:ERAP1基因rs30187、rs27044和rs46978与子痫前期易感性相关，rs30187和rs27044位点上子痫前期患者CC基因型携带者更多，而rs469783位点上健康孕妇CC基因型的携带者更多。ERAP1可能通过影响滋养层细胞的迁移侵袭能力参与子痫前期的发病。

目的:探讨气管血管球瘤（glomus tumor）的临床病理及分子遗传学特征，提高小活检及术中冷冻切片诊断的准确率，并准确评估其恶性潜能。方法:收集广州医科大学附属第一医院2012年1月至2020年7月诊断的血管球瘤10例，分析其临床病理及免疫组织化学特征，采用PCR-Sanger测序法对3例血管球瘤行BRAF及KRAS基因突变检测。结果:5例为良性血管球瘤，2例为恶性潜能未定，3例为恶性。肿瘤位于黏膜下层，呈实性片状围绕毛细血管排列，瘤细胞圆形或卵圆形，大小相对一致，胞质淡染。免疫组织化学染色显示肿瘤细胞均表达α-平滑肌肌动蛋白、Ⅳ型胶原及波形蛋白。3例血管球瘤均未见BRAF第15号外显子V600E突变，3例均出现BRAF第16号外显子同义突变，1例良性和1例恶性血管球瘤出现BRAF第3号外显子M117R错义突变；1例良性血管球瘤出现KRAS第3号外显子D69N错义突变；1例恶性潜能未定血管球瘤出现KRAS第5号外显子同义突变。结论:气管血管球瘤罕见，在小活检及术中快速冷冻诊断中极易误诊为类癌。分子遗传学上BRAF基因未出现V600E突变及蛋白表达，BRAF和KRAS基因出现了罕见位点的突变。

目的:探讨1例 CYP11B2/CYP11B1融合基因所致11β羟化酶缺乏症(11β-OHD)患儿的遗传学特征，并为其父母提供产前遗传咨询。 方法:选取1例2020年8月24日就诊于河南省儿童医院内分泌科的患儿为研究对象。收集患儿临床资料，采集患儿及其父母的外周血样，对患儿进行全外显子组测序(WES)，对候选变异进行Sanger测序家系验证。用RT-PCR及Long-PCR确定患儿的融合基因。结果:患儿为5岁男性，第二性征发育提前，生长加速，诊断为21羟化酶缺乏症(21-OHD)。WES检测提示患儿 CYP11B1基因存在杂合错义变异c.1385T>C(p.L462P),同时染色体8q24.3区存在37.02 kb的杂合缺失。根据美国医学遗传学与基因组学学会(ACMG)相关指南，将c.1385T>C(p.L462P)评级为可能致病变异(PM2_Supporting+PP3_Moderate+PM3+PP4)。RT-PCR及Long-PCR联合检测结果提示为 CYP11B1和 CYP11B2基因重组，形成 CYP11B2 exon 1~7/ CYP11B1 exon 7~9融合基因。患儿被确诊为11β-OHD，经氢化可的松及曲普瑞林治疗有效。患儿父母经遗传咨询后娩1个健康后代。 结论:因 CYP11B2/CYP11B1融合基因所致的11β-OHD易被误诊为21-OHD，需采用多种基因检测手段联合进行诊断。

DNA错配修复(MMR)功能的丧失及微卫星(MS)重复序列的改变均可导致微卫星不稳定性(MSI)发生.错配修复缺陷/微卫星不稳定性(dMMR/MSI)检测对子宫内膜癌(EC)早期诊断、预后判断、化疗敏感性判断以及高危人群的判定等具有重要意义.目前,可从蛋白质层面使用免疫组化法(IHC)检测MMR蛋白,或从基因组层面使用PCR毛细管电泳(PCR-CE)、二代测序(NGS)方法检测MSI状态.IHC检测的优势是检测成本低、耗时短,但容易出现部分病例漏诊或误诊;PCR-CE检测的优势是能进行外部能力测试、结果重复性高、标准化程度高,但在临床检测时可能出现误判的情况;NGS-MSI检测的优势是检测位点多,测序量大,准确率高,能够检测MMR系统的功能状态,但目前尚无统一的算法及评判标准对NGS-MSI进行规范及标准化.了解各种检测方法的优势和不足,能够为EC的临床诊断及个体化治疗提供更准确、系统的决策方案.

目的 调查复合杂合突变导致遗传性蛋白C缺陷症家系的临床特征与基因突变情况,并分析其基因型与临床表型的关系.方法 采集先证者及其家系成员(3代5人)外周静脉血,检测蛋白C活性、蛋白S活性和抗凝血酶活性等指标以明确表型诊断.采用PCR对先证者PROC基因所有外显子及侧翼序列进行扩增,PCR产物纯化后进行直接测序.运用ClustalX-2.1-win软件分析突变的保守性;使用在线生物信息学软件预测突变的致病性.结果 家系中有 4 人存在遗传性蛋白C缺陷症,先证者临床表现为肺栓塞和下肢深静脉血栓栓塞,其他家系成员无明显的血栓形成事件表现.基因测序发现先证者PROC基因第7 号外显子存在 c.541T＞G 杂合错义突变(p.Phe181Val)和 c.577-579delAAG 杂合缺失突变(p.Lys192deletion),其父亲为c.541T＞G突变杂合子,母亲和妹妹为c.577-579delAAG突变杂合子.保守性分析显示Phe181 和Lys192 在同源物种间均高度保守,生物信息学软件预测该 2 个突变位点均为有害突变.结论 该遗传性蛋白C缺陷症家系存在c.541T＞G杂合错义突变和c.577-579delAAG杂合缺失突变,该复合杂合突变可能引起先证者蛋白C活性明显降低,从而导致反复深静脉血栓栓塞和肺栓塞.

目的 研究血小板输注效果与KIR受配体的关联性.方法 33例HLA抗体检测阳性白血病患者与供者血小板进行交叉配型试验,选取合适供者的血小板输注,以24 h血小板校正计数指数(CCI)判定输注效果.采用PCR-SSP方法分别对患者和供者的血液标本进行KIR及配体基因分型,分析血小板输注效果和受者KIR、供者HLA配体的相关性.结果 在74次血小板输注中,输注无效42人次,输注有效32人次.供者存在C2基因、HL-BBw480T基因,受者输注血小板无效的频率分别为69.0％(29/42),52.4％(22/42),显著高于有效组25.0％(8/32),25.0％(8/32).供者存在C1基因,受者输注血小板有效的频率分别为100.0％(32/32),高于无效组83.3％(35/42).当受者-供者匹配模式为KIR2DL1-C2和KIR3DL1-(HLA-BBw4-80T)受者输注血小板发生无效的频率为69.0％(29/42)和40.5％(22/42),高于有效组的频率25％(8/32)和18.8％(6/32).当受者-供者匹配模式为KIR2DL3-C1,受者输注血小板发生有效为32例(100.0％)高于无效组35例(83.3％).受者iKIR与供者HLA配体发生错配,错配模式为KIR2DL1-C2错配,受者输注血小板有效的频率为78.1％(25/32),远高于无效组的31.0％(13/42).当错配模式为KIR3DL1-(HLA-B Bw4-80T)错配,受者血小板输注有效的频率为68.8％(22/32)高于无效组的42.9％(18/42).以上各组比较差异均具有统计学意义,P＜0.05.结论 在血小板输注中HLA-C1和HL4-C2基因是影响血小板输注效果的关键性因素,HLA-C1是血小板输注无效的保护性基因,而HLA-C2和HLA-B Bw4-80T是血小板输注无效的易感性基因,受者iKIR+供者HLA的受配体模式可能在血小板输注无效中的扮演重要作用.

目的 为提高杀菌/渗透性增强蛋白N端功能片段BPI23对内毒素(lipopolysaccharides,LPS)的亲和性,通过易错聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)和DNA改组技术,对其编码序列BPI600进行突变,在大肠杆菌XL10-Gold中构建BPI600基因突变体库.方法 通过控制Mg2+和Mn2+的浓度进行易错PCR,获得BPI600随机突变基因片段,经测序和基因比对,确定BPI600的随机突变率.再对易错PCR产物进行DNA改组,将改组产物克隆至pYD1载体中,转化大肠杆菌XL10-Gold,从Amp抗性(LuriaBertani,LB)固体培养平板上任选10个单菌落,增菌后提取质粒,得到pYD1-shuffled BPI600重组质粒,将质粒进行Hind Ⅲ/ XhoⅠ酶切鉴定,取5个阳性质粒进行DNA测序,通过基因和氨基酸比对鉴定突变情况.结果 测序和基因比对显示,BPI600经易错PCR所获突变文库的随机突变率达2.3％;改组后重组质粒的酶切结果表明,在随机选择的10个菌落所提质粒中,有6个含BPI600,表明构建了重组质粒pYD1-shuffled BPI600;在5个阳性质粒中,有4个重组质粒的BPI23编码序列分别发生了6、9、11和14个碱基突变;1个不仅有10个碱基突变,还存在1个碱基的缺失.氨基酸比对表明,有2个质粒(分别有6和14个碱基突变)具有正确的读码框,能够翻译完整的蛋白质,各有4或14个氨基酸突变.3个质粒因含终止密码子而不能表达完整目的蛋白.结论成功构建pYD1-shuffled BPI600重组质粒,获得库容量为2×105的突变文库,为高内毒素亲和力突变体的筛选奠定了基础.

运用体外分子进化技术易错PCR方法,高通量筛选热稳定性提高的弯曲芽孢杆菌Bacillus flexus CCTCC 2015368 β-淀粉酶突变体.利用LB琼脂淀粉板显色、96-孔板DNS法测酶活和酶标仪检测等,最终筛选到了一株热稳定性显著提高的突变体D476N.野生型和突变体D476N分别纯化后,酶学性质测定表明:突变体D476N的最适pH为6.5,与野生型相比降低了0.5.突变体D476N和野生型的最适温度均为55℃,突变体D476N在55℃下的半衰期为35 min,比野生型提高了95％.突变体D476N的T50值比野生型提高4℃.突变体D476N的Km值为97.98 μmol/L,是野生型(85.86 μmol/L) 1.14倍;突变体稳定性提高的同时,催化活力相对于野生型有略微下降.通过SWISS-MODEL同源模拟野生型和突变体D476N的三维结构,并通过PyMol软件分析,发现突变后的氨基酸残基Asn476位于蛋白质表面的loop环上,通过MOE软件计算,D476N的分子自由能(△G)为106.01kcal/mol,比野生酶降低10.3％,这一结果与蛋白质分子自由能和热稳定性呈负相关的理论相符.