目的:构建共表达P1和3CD的重组杆状病毒，利用昆虫细胞重组表达2型脊髓灰质炎病毒(poliovirus type 2，PV2)的病毒样颗粒(virus-like particle, VLP)，制备PV2-VLP进行初步免疫原性研究。方法:基于粉纹夜蛾细胞(High 5)密码子偏好性，将PV2的P1基因和3CD基因进行序列优化，并对P1基因进行稳定性突变，构建突变型rBac-PV2-P1s-3CD和野生型rBac-PV2-P1-3CD杆状病毒。Western blot分别检测目的蛋白表达量，离子交换层析纯化PV2-VLP，透射电镜观察VLP高级结构确定组装效率。免疫大鼠评估免疫原性。结果:成功构建了可稳定表达P1s蛋白和3CD蛋白的重组杆状病毒。Western blot结果表明热稳定性突变后VLP产量相比野生型有所提高。电镜观察发现直径约30 nm的三维结构，表明VLP成功组装。动物实验结果表明，重组制备的PV2-VLP具有免疫原性，且能有效刺激产生中和抗体。结论:用昆虫细胞-杆状病毒表达系统可成功制备有效的VLP类疫苗，为PV-VLP疫苗的研制提供参考。

目的:通过蛋白重组技术低成本、快速制备高浓度人视黄醇结合蛋白4（hRBP4）参考物质，解决临床hRBP4高值参考物质难以获取的需求。方法:在美国国立生物技术信息中心NCB查找hRBP4的互补DNA序列，经大肠埃希菌密码子优化后人工合成，然后将DNA片段克隆至原核表达质粒pET-28a（+）中，以构建重组hRBP4表达载体。将重组质粒转化至 E. coli BL21感受肽中，优化诱导表达条件（如温度、转速和异丙基硫代半乳糖苷IPTG浓度等）、诱导质粒表达并对重组蛋白进行His融合标签纯化，获取纯化后的hRBP4重组蛋白。 结果:DNAMAN软件对比显示编码hRBP4蛋白的碱基序列完全正确，成功构建重组hRBP4原核表达质粒；SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果显示亲和纯化产物中可清晰可见约相对分子质量26 000电泳条带；临床尿液和血清hRBP4常规检测系统均可检测到纯化的hRBP4蛋白，且稀释倍数与检测浓度间呈现良好线性关系。结论:成功构建重组hRBP4高水平表达系统，重组hRBP4蛋白纯度大、浓度高、生产周期短，有望在室间质量评价质控品和有证参考物质研制中发挥重要作用。

目的:基于脂质多聚复合物(lipopolyplex, LPP)递送平台和保守抗原开发的新型流感病毒mRNA疫苗在小鼠体内的免疫原性评价。方法:将4个拷贝的甲型流感病毒基质蛋白2胞外域(extracellular domain of matrix 2 protein，M2e)与核蛋白(nucleoprotein，NP)编码基因按照真核密码子优化，串联构建融合抗原并体外转录为4M2eNP-mRNA，利用LPP技术平台制备甲型流感病毒mRNA疫苗(LPP-4M2eNP)。转染真核细胞后通过免疫荧光体外验证NP和M2e表达；BALB/c小鼠经肌肉注射10 μg、30 μg mRNA疫苗，间隔4周加强免疫一次，酶联免疫法检测免疫后血清抗体滴度，免疫斑点法检测细胞免疫应答。结果:间接免疫荧光检测表明4M2eNP-mRNA转染真核细胞后NP和M2e正确表达。单针免疫可明显诱导抗原(NP和M2e)特异性细胞免疫应答，加强免疫后在小鼠中诱发了抗原特异性体液免疫应答呈Th1型偏向；NP细胞免疫应答显著提高，但M2e细胞免疫应答强度无明显改变。结论:本研究制备的LPP-4M2eNP疫苗在小鼠中单针免疫即可诱导较强的细胞免疫应答，加强免疫后可诱导明显的体液和细胞免疫应答，表明该疫苗具有较好的研发和应用前景。

目的:构建并制备表达人CD137L蛋白的5型重组腺病毒（Ad5-CD137L），并初步研究其在小鼠中的抗肿瘤免疫效果。方法:将密码子优化CD137L蛋白的表达基因插入pDC316穿梭质粒,并与pBH-GloxΔE1,3Cre腺病毒骨架质粒，共同转染HEK293细胞，构建Ad5-CD137L种子。扩增并纯化后，对所得Ad5-CD137L重组腺病毒的插入目的基因与蛋白表达情况进行鉴定。检测Ad5-CD137L在C57BL/6小鼠体内的特异性细胞免疫和抗肿瘤免疫水平。结果:成功地构建了Ad5-CD137L，PCR和测序结果表明插入目的基因与构建理论值相符。免疫荧光法鉴定Ad5-CD137L能在HEK293细胞中表达目的蛋白，经Western印迹法鉴定该目的蛋白的相对分子质量约为25 000，与理论值相符。与空腺病毒相比，Ad5-CD137L能显著诱导小鼠特异性IFN-γ（ t=6.315， P=0.003），抗肿瘤免疫效果更显著（ t21 d=8.275， t29 d=4.492； t39 d=5.101， P均<0.001）。 结论:成功构建了Ad5-CD137L，该重组病毒具有特异性细胞免疫原性和抗肿瘤免疫效果。

目的:获取具有生物活性的狂犬病病毒核蛋白在大肠埃希菌表达系统中高效表达。方法:实验使用密码子优化技术重新编码狂犬病病毒CTN-1株核蛋白基因，人工合成全长基因并克隆至pET-43.1a表达载体，在大肠埃希菌BL21(DE3)株中诱导表达，并使用Western blot检测其反应原性。结果:诱导后SDS-PAGE分析显示在相对分子质量50×10 3处出现明显的表达条带，与预期蛋白质条带大小一致。其中在大肠埃希菌 A600为0.5左右，37℃诱导5 h时表达产量最高(约为32.3%)。大量表达时核蛋白的表达形式主要为包涵体，后经Ni 2+螯合层析纯化，获得纯度为95%以上的目的蛋白。纯化产物经Western blot鉴定，与疫苗免疫小鼠血清呈阳性反应，表明大肠埃希菌表达CTN-1株核蛋白具有生物活性。 结论:本实验成功建立了CTN-1株核蛋白在大肠埃希菌表达系统的高效表达方法，并获得了高纯度目的蛋白，为进一步的临床诊断和新型疫苗制备提供基础资料。

目的:表达纯化猴痘病毒A29L、B6R以及M1R抗原蛋白并分析三种蛋白在痘苗病毒免疫血清检测中的应用。方法:将猴痘病毒A29L、B6R以及M1R抗原按照人源密码子优化合成后插入pVRC载体，转染HEK293T细胞后收获上清，通过Western blot方法验证蛋白表达，通过镍柱和离子交换层析柱纯化蛋白，并采用SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色鉴定蛋白纯度。分别以纯化A29L、B6R与M1R作为包被抗原，通过ELISA检测痘苗病毒免疫后的小鼠、恒河猴与人血清中IgG抗体滴度，并分析它们与血清中抗痘苗病毒、抗猴痘病毒中和抗体滴度的相关性。结果:猴痘病毒A29L、B6R、M1R蛋白在细胞上清中均可大量分泌表达。经镍柱及离子交换层析柱进行蛋白纯化后，纯度均可达90%以上。痘苗病毒免疫的动物与人血清中均可检出针对三种蛋白特异的IgG抗体，三个抗原检测的IgG滴度显著相关，痘苗免疫血清中A29L、B6R、M1R特异的IgG与抗痘苗病毒中和抗体水平也显著相关，但与抗猴痘病毒特异中和抗体水平相关性较弱。结论:在痘苗病毒免疫血清中可检测到与猴痘病毒A29L、B6R、M1R蛋白交叉反应的IgG抗体，且IgG滴度与抗痘苗病毒中和抗体水平显著相关，但与猴痘病毒特异中和抗体水平相关性较弱。该研究可为正痘（包括猴痘）病毒免疫学检测方法的应用及疫苗研发提供参考。

目的 采用成簇的规律性间隔的短回文重复序列(CRISPR)/Cas9系统对斑马鱼胱硫醚-β-合成酶b基因(cbsb)进行编辑,并制备稳定的斑马鱼cbsb敲除品系.方法 使用ClustaIX软件分析斑马鱼cbsb编码蛋白(Cbsb)的保守结构域,利用生物信息学选取向导RNA(gRNA)靶点,体外合成并纯化gRNA和密码子优化的Cas9 mRNA,在刚受精的斑马鱼胚胎(1-cell期)中显微注射混合的gRNA和Cas9mRNA,提取受精后3 d的斑马鱼幼鱼基因组,通过PCR扩增并测序分析靶点的切割效率,通过基因组扩增和测序筛选并获得cbsb敲除的稳定品系.结果 斑马鱼Cbsb与人、小鼠胱硫醚-β-合成酶(CBS)高度同源.在斑马鱼Cbsb保守结构域的编码序列处设计4个靶点,其中4#靶点具有高效的切割效率,利用该靶点制备并筛选获得多个cbsb敲除斑马鱼,选取-3+13 bps和-228 bps移码突变的两种品系,进一步筛选获得稳定的cbsb敲除品系.结论 利用CRISPR/Cas9系统成功制备了两种斑马鱼cbsb敲除的稳定品系,为进一步在斑马鱼活体中研究Cbsb的功能奠定了基础.

[背景]口蹄疫(foot-and-mouth disease,FMD)是由口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)引起的感染牛、羊和猪等偶蹄动物的主要疫病之一.口蹄疫病毒的结构蛋白VP1 包含多个能够引起机体免疫反应的主要位点,因此 VP1 是研究亚单位疫苗的方向靶标.谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)作为安全生产菌株,是医药用蛋白生产的优势细胞工厂.[目的]利用C.glutamicum作为受体菌株表达外源蛋白的优势实现VP1 的外源表达.[方法]根据VP1 结构蛋白的基因序列、相应功能和C.glutamicum的密码子偏好性设计并合成VP1 基因,与pXMJ19载体连接构成重组质粒pXMJ19-VP1.C.glutamicum CGMCC 1.15647 菌株用于表达VP1-6×his蛋白,并对蛋白表达元件启动子、5′非翻译端(5′UTR)、目的蛋白自身N端等进行优化,同时对培养条件等进一步优化,采用SDS-PAGE和Western blotting技术检测VP1 蛋白的表达情况.最后应用间接酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)测定本研究中生产的VP1 的免疫活性.[结果]SDS-PAGE和Western blotting分析结果表明VP1 蛋白能在C.glutamicum CGMCC 1.15647 菌株成功表达,将Ptac启动子替换为合成型启动子PH36 能提高蛋白产量.在此基础上,通过插入不同的 5′UTR序列和VP1 蛋白N端氨基酸的改变能进一步提高蛋白产量并可利用CspB信号肽实现分泌表达.发酵试验表明,VP1 摇瓶发酵培养最优条件为 30℃、24 h.ELISA试验表明,本研究中的 VP1 可与阳性血清特异性结合.[结论]本研究在谷氨酸棒状杆菌中成功表达 FMDV的VP1蛋白,并通过优化蛋白表达元件的方法进一步提高了产量,为开发新型FMD免疫诊断试剂和安全高效的亚单位疫苗奠定了良好的基础.

非天然氨基酸是一类不受遗传密码子约束的特殊氨基酸,它们具有独特的空间构型和化学性质,为多个领域提供了新的资源和机会.当前,非天然氨基酸可以通过化学合成和生物合成两种方式合成,其中相较于化学合成,生物合成具有更高的效率和立体选择性、更低的成本和污染,是一种有潜力的合成方式.本文综述了非天然氨基酸在蛋白质探针、酶工程、抗体药物偶联物、抗菌肽等方面的研究进展和应用案例,展示了非天然氨基酸如何突破天然氨基酸的限制,拓展蛋白质的结构和功能多样性.同时介绍了非天然氨基酸的生物合成策略,包括代谢工程中的静态调控和动态调控策略以及发酵优化策略.最后,展望了非天然氨基酸的生物合成和应用的未来发展趋势和挑战,为非天然氨基酸的合成和开发提供参考和启示.

目的 制备日本血吸虫谷胱甘肽S-转移酶相对分子质量(Mr)26 000亚基(Sj26gst)mRNA并评价其免疫原性.方法 根据Sj26gst编码区序列(NC_002544.1),用人类常用的密码子优化Sj26gst编码序列,两端加β球蛋白3'和5'非编码区(UTR),合成后连接至pcDNA3.1(+),构建pcDNA3.1/Sj26gst质粒,以线性化的pcDNA3.1/Sj26gst质粒为模版,体外转录Sj26gst mRNA.用脂质体将Sj26gst mRNA转染至HeLa细胞中,转染后2、6、12、24、48 h取HeLa细胞,免疫荧光定量PCR(qRT-PCR)检测Sj26gst mRNA的相对水平,蛋白质免疫印迹(Western blotting)检测Sj26GST蛋白的表达水平.雌性BALB/c小鼠随机均分为Sj26gstmRNA组、pcDNA3.1/Sj26gst组、pcDNA3.1组和PBS组(每组6只),分别于小鼠左后腿股四头肌肌内注射100 μg的Sj26gst mRNA、pcDNA3.1/Sj26gst质粒、pcDNA3.1质粒和PBS(100 μl),共免疫3次,每次间隔2周.分别采集免疫前(0),首次免疫后2、4、6、8周小鼠尾静脉血,制备血清,ELISA检测血清Sj26GST特异性IgG抗体水平.首次免疫后8周,无菌分离小鼠脾组织,制备脾淋巴细胞悬液,37 ℃培养48 h后,加入10 μl细胞增殖试剂培养4 h后测定脾细胞刺激指数,ELISA法检测脾淋巴细胞上清中Th1型[肿瘤坏死因子α(TNF-α)、干扰素γ(INF-γ)],Th2型[白细胞介素4(IL-4)、IL-10]和Th17型(IL-17)细胞因子的水平.组间比较采用单因素方差分析.结果 优化后的Sj26gst编码序列长858 bp,GC含量为63.2％,二级结构的自由能变为-485.6 kcal/mol.电泳结果显示,体外转录的Sj26gst mRNA条带呈单一且无弥散的条带.RT-PCR结果显示,Sj26gst mRNA转染后2 h,HeLa细胞Sj26gst mRNA相对水平为6.21±0.83,6 h达到峰值(14.26±1.23),随后下降;Western blotting结果显示,Sj26gst mRNA转染后6、12、24、48h均检出Mr 26 000的Sj26GST蛋白条带.ELISA检测结果显示,首次免疫后8周,Sj26gst mRNA组、pcDNA3.1/Sj26gst组、pcDNA3.1 组和 PBS 组的 A45.分别为 0.85±0.16、0.42±0.21、0.14±0.03 和 0.11±0.02,Sj26gst mRNA 组与 pcDNA3.1/Sj26gst组、pcDNA3.1/Sj26gst组与pcDNA3.1组之间差异均有统计学意义(t=16.46、12.35,均P＜0.05).首次免疫后8周,Sj26gst mRNA组、pcDNA3.1/Sj26gst组小鼠脾淋巴细胞增殖指数分别为11.25±1.22、6.37±2.45,高于pcDNA3.1 组(2.56±0.38)和 PBS 组(1.27±0.45)(t=9.98、5.25,均 P＜0.05).ELISA 检测结果显示,Sj26gst mRNA组小鼠脾淋巴细胞上清中TNF-α、INF-γ、IL-10和IL-17的表达水平分别为(756.23±134.35)、(598.46± 50.47)、(713.42±118.25)、(301.45±48.23)pg/ml,pcDNA3.1/Sj26gst组分别为(587.26±32.48)、(401.45±46.25)、(386.27±23.75)、(175.24±41.23),均高于 pcDNA3.1 组的(19.34±2.01)、(35.14±5.25)、(32.11±15.20)、(19.75±7.21)pg/ml和PBS组的(18.75±1.98)、(34.12±4.78)、(29.36±8.72)、(15.34±2.51)pg/ml(t=54.59、19.57、52.36、26.47,均P＜0.05).结论 构建了稳定表达Sj26gst mRNA的质粒,Sj26gst mRNA可诱导产生高水平的特异性Sj26GST蛋白抗体并诱导Th1型细胞免疫应答.