目的 观察诱导性共刺激分子(ICOS)靶点用于小鼠佐剂诱导型关节炎(AIA)模型的可行性.方法 选取20只BALB/c小鼠,于右后爪分别注射等剂量完全弗氏佐剂(AIA组,n=10)或磷酸盐缓冲液(对照组,n=10),之后经尾静脉分别注射ICOS-IRD680 mAb探针(AIA组)或IgG-IRD680 mAb探针对照组,比较24及48 h后2组近红外荧光成像右爪与左爪荧光强度比值;提取小鼠总RNA行转录组测序,筛选并分析差异表达基因.针对对照组提取脾脏原代T细胞并分选磁珠阴性T细胞,以佛波酯/离子霉素刺激、诱导活化T细胞形成,检测其表面ICOS蛋白表达水平,并进行安全性评价.结果 相比对照组,AIA组ICOS基因表达显著上调、T细胞占比增高,FoxP3+调节性T细胞、CD8+T细胞及CD4+T细胞中ICOS分布较多.对照组分选磁珠阴性T细胞前、后CD3+T细胞纯度分别为65.31％和90.14％;其中,ICOS蛋白阳性小鼠CD4+T细胞在活化前、后占比分别为7.14％及31.20％,且活化CD4+T细胞ICOS蛋白平均荧光强度(586±25)显著高于未活化者(161±31)(t=25.390,P＜0.001).注射探针后24及48 h,AIA组右爪/左爪荧光强度比值均高于对照组(t=34.600、P＜0.001;t=23.380、P＜0.001).相比对照组,AIA组小鼠心、肝、肾组织未见明显病理改变,且组间血清谷丙转氨酶、谷草转氨酶及肌酐无明显差异(P均＞0.05).结论 ICOS靶点用于小鼠AIA模型安全、可行.

[目的]为解决在D-乳酸工业发酵生产中使用农业粗加工或废弃物等廉价原料(含有少量L-乳酸)而导致终产物D-乳酸光纯降低的问题.[方法]构建了带有不同启动子的L-乳酸脱氢酶基因lldD的表达质粒:pUC19-PLD(PpflBp6)、pUC19-NLD(PnirB)及pUC19-PNLD(PpflBp6-PnirB),并将它们分别转化入大肠杆菌D-乳酸工程菌HBUT-D中,得到菌株HBUT-D3、HBUT-D5 和HBUT-D7.通过LldD的酶活检测以及对NBS培养基(添加 1 g/L L-乳酸)发酵结果的TOPSIS多元评估,优选出可快速去除L-乳酸且不影响D-乳酸发酵的菌株,并使用农业廉价原料进行发酵.[结果]HBUT-D7 的LldD比酶活为64 U/g,L-乳酸的消耗速率为 34 mg/(L·h),D-乳酸的生产强度为 4.09 g/(L·h),综合评估为最优菌株.以玉米浆为原料进行发酵时,HBUT-D及HBUT-D7 的L-乳酸消耗速率分别为 10.41 mg/(L·h)及 34.75 mg/(L·h);D-乳酸生产强度分别为 4.24 g/(L·h)及 3.87 g/(L·h);D-乳酸光学纯度分别为 99.07%及 99.92%.以糖蜜为原料进行发酵时,HBUT-D及HBUT-D7 的L-乳酸消耗速率为6.87 mg/(L·h)和 17.18 mg/(L·h);D-乳酸生产强度分别为 1.93 g/(L·h)及 1.88 g/(L·h);D-乳酸光学纯度分别为 99.22%及 99.99%.[结论]厌氧诱导启动子的表达质粒可提高菌株HBUT-D7 的L-乳酸脱氢酶酶活,使其在使用廉价原料发酵时能有效消除L-乳酸,提高发酵终产物D-乳酸的光学纯度.

目的 设计二茂铁(Fc)偶联阳离子多肽(以下简称"多肽")的2种同分异构多肽[Fc-K(C8)FFHK、C8-K(Fc)FFHK]以及对照多肽[C8-K(C8)FFHK],探究Fc位置异构对多肽自组装行为及其抗菌效果的影响.方法 采用标准固相合成法合成位置异构的多肽,采用反相高效液相色谱法进行纯化;采用紫外可见分光光度法检测紫外吸收光谱,Zeta电位分析仪测定Zeta电位以分析多肽的稳定性;采用圆二色光谱(CD)、傅里叶红外光谱(FTIR)、硫代黄素T(ThT)荧光光谱、透射电子显微镜(TEM)等进行二级结构表征;通过体外活性氧(ROS)生成效率实验、生长曲线法测定实验、平板法实验、细胞毒性实验和溶血性实验评价2种同分异构多肽在抗菌活性和生物相容性上的差异.结果 合成了3种纯度均高于95%的多肽.稳定性实验结果显示,室温下放置24、96 h时,Fc-K(C8)FFHK、C8-K(Fc)FFHK的紫外吸收图谱几乎没有改变,二者的Zeta电位分别减少了0.3、0.5 mV.二级结构表征结果显示,Fc-K(C8)FFHK、C8-K(Fc)FFHK分别自组装成扭曲纳米带和短纳米纤维结构,C8-K(C8)FFHK自组装成圆柱状纳米纤维结构;光学图谱结果显示,3种多肽的β-折叠、α-螺旋等结构含量具有一定差异.体外ROS生成实验结果显示,Fc-K(C8)FFHK在pH 6.0时的ROS生成效率高于C8-K(Fc)FFHK.体外抗菌活性结果显示,对于耐甲氧西林金黄色葡萄球菌,2种同分异构多肽的最低抑菌浓度(MIC)值均为50 μg/mL,远低于对照多肽的MIC值(400 μg/mL);对于大肠杆菌,Fc-K(C8)FFHK的抗菌活性优于C8-K(Fc)FFHK.细胞毒性实验和溶血性实验均结果显示,2种同分异构多肽均具有较好的生物相容性.结论 通过偶联Fc,能够提高多肽的抗菌活性;调节Fc在多肽序列中的位置,可调控多肽的自组装行为和抗菌效果.

目的:探讨小鼠骨髓来源肥大细胞体外大量培养及鉴定方法.方法:采用IL-3(10 ng/mL)和不同浓度的SCF联合刺激小鼠骨髓细胞,培养四周,采用普通光学显微镜观察细胞形态,牛鲍氏血细胞计数板进行细胞计数,甲苯胺蓝染色观察其胞浆颗粒物质,流式细胞仪检测细胞表面CD117和FcεRI的表达情况,β-己糖苷酶释放试验评估肥大细胞活化能力.结果:培养条件为10ng/mL IL-3和20 ng/mL SCF时,悬浮细胞数目能达到1x 108细胞,其中CD117和FcεRI双阳性细胞比例迭90％以上;甲苯胺蓝染色可见细胞胞浆含有大量紫红色颗粒;细胞经IgE-DNP致敏及DNP-HSA激发后,β-己糖苷酶释放率明显增加,且SCF能促进肥大细胞释放β-己糖苷酶.结论:采用10 ng/mLⅡ-3和20 ng/mL SCF诱导骨髓细胞能够获得大量高纯度的小鼠骨髓来源肥大细胞,为肥大细胞特性及功能学研究提供了基础.

L-正缬氨酸是合成抗高血压药物培垛普利的重要中间体,其合成主要通过化学方法,具有产品纯度低、环境污染等缺点.提出一种基于多酶介导拆分DL-正缬氨酸结合不对称还原生产高纯度L-正缬氨酸的方法.首先,将混合型DL-正缬氨酸中的D型经过D-氨基酸氧化酶氧化成相应酮酸,然后利用亮氨酸脱氢酶将酮酸不对称还原生成L-正缬氨酸,同时NADH被氧化成NAD+,最后利用甲酸脱氢酶构建NADH循环再生系统.D-正缬氨酸被氧化过程中会产生副产物过氧化氢(H2O2),通过外源添加过氧化氢酶消除该副产物.基于前期最适转化温度、最适转化pH优化基础上,对过氧化氢酶添加量和单次底物添加量进行优化,利用分批补料策略提高L-正缬氨酸产量.结果显示,在最适条件下,L-正缬氨酸产量达到61.09 g/L对映体过量值(e.e.)和转化率分别为99％和96.1％.本研究合成L-正缬氨酸较之化学方法,具有环境污染少、产品纯度高等特点,为制药行业中光学纯L-正缬氨酸的生产提供了一种有效的方法.

目的 优化合成工艺,制备高光学纯度的减肥药盐酸绿卡色林半水合物(lorcaserin hydrochloride hemihydrate)及有关物质.方法 以4-氯苯乙酸为起始原料,经过酯化、还原、溴代、胺化、氯代、傅克烃化、拆分、游离、成盐共9步反应得到盐酸绿卡色林半水合物,同时合成一种异构体杂质,分离出一种中间体杂质,并对其进行LC-MS初步结构确证.结果与结论 改进后的合成路线总收率为17.8％(4-氯苯乙酸计),含量为99.5％(滴定法).目标化合物的结构经氢谱、碳谱及质谱确证.该路线原料廉价易得,溶剂可回收套用,收率有大幅度提高,产品化学和光学纯度高,反应操作简便稳定,适合工业化生产.

[背景]手性乙酸苏合香酯是重要的手性香料产品,在食品及精细化工等领域都有重要的应用.酶催化不对称合成手性乙酸苏合香酯产品具有极好的工业应用前景.[目的]研究酯酶EstC 11的基本酶学性质及其在制备手性乙酸苏合香酯中的应用.[方法]对来自西太平洋深海热液口芽孢杆菌Bacillus sp.CX01中的新颖微生物酯酶基因EstCll进行克隆、表达及酶学性质鉴定.通过对pH、温度、有机溶剂等反应条件的优化提高酯酶手性拆分乙酸苏合香酯的光学纯度.[结果]酯酶EstC 11的最适反应pH为8.5,最适温度为25℃,一些金属离子和有机溶剂对酯酶EstC 11的水解活性具有不同程度的抑制作用.通过对反应条件的优化,在最适反应条件下(pH 9.0 50 mmol/L Tris-HC1,20℃,50 mmol/L底物浓度)反应3h后,(R)-乙酸苏合香酯的光学纯度达98％,得率为39％.[结论]通过对酯酶拆分条件的优化,手性拆分乙酸苏合香酯生成(R)-乙酸苏合香酯的光学纯度明显提高,为酯酶EstC11在工业化上的应用奠定了基础.

背景:原代软骨细胞体外培养是研究骨骼生长的重要方法之一.目前原代软骨细胞的分离方法主要有单独消化法和分步消化法,但两种方法对软骨细胞生物学性能的影响尚不清楚.目的:比较两种方法对新生大鼠软骨细胞生物学性能的影响,为软骨发育的程序化研究提供实验基础.方法:无菌条件下取出新生SD大鼠关节软骨,分别采用Ⅱ型胶原蛋白酶单独消化法、胰蛋白酶和Ⅱ型胶原蛋白酶分步消化法分离软骨细胞,并进行体外培养.光学显微镜下观察软骨细的形态,CCK-8法检测软骨细胞的增殖活性,半定量免疫荧光分析软骨细胞的Ⅱ型胶原蛋白表达.结果与结论:①单独消化法和分步消化法都可以得到大量软骨细胞,但分步消化法较单独消化法所得软骨细胞的纯度更高;②光学显微镜下观察,两种方法消化所得细胞在形态学上无明显差异;③单独消化法所得细胞生长速度更快;④免疫荧光半定量分析显示两种方法所得软骨细胞Ⅱ型胶原蛋白表达一致;⑤以上结果表明,分步消化法更适于新生大鼠原代软骨细胞的分离培养.

目的 优化改进手性丹参素异丙酯的不对称合成方法.方法 以3,4-二羟基苯甲醛经过苄基保护、Knoevenagel 缩合和酯化反应生成(E)-3-(3,4-二苄氧基苯基)丙烯酸异丙酯,并通过Sharpless不对称双羟化反应构建手性中心,以三乙氧基硅烷(Et3 SiH)及三氟乙酸(CF3COOH)为选择性脱氧试剂,最后常温常压条件下催化加氢脱保护得到目标产物.结果 该方法中原料、Et3SiH与CF3COOH最佳比例为1∶3∶10,手性丹参素异丙酯对映选择性(ee)大于99.9％且化学产率良好,其化学结构式均由核磁(1H-NMR)及高分辨质谱(HRMS)证实.结论 实验证实了手性丹参素异丙酯优化改进的不对称合成方法简单可行,光学纯度高,具有一定的实际应用价值.

目的 建立一种实验环境更贴合人体、方便快捷、细胞活性和纯度较高的支气管上皮细胞原代培养方法.方法 通过纤维支气管镜刷检获取新乡市第一人民医院收治的63例患者正常的支气管上皮细胞,采用无血清的支气管上皮细胞培养基(BEGM)进行纯化、分离,行原代培养并传代,锥虫蓝染色,光学显微镜下观察细胞存活状态并测定细胞存活率,通过倒置生物式显微镜和免疫组织化学染色观察鉴定细胞.结果 人支气管上皮细胞的平均存活率为(96.8±0.5)％,细胞免疫荧光角蛋白染色阳性,兔抗人细胞角蛋白8单克隆抗体免疫组织化学染色显示细胞质着色为绿色,细胞核复染为蓝色,鉴定为人原代支气管上皮细胞.结论 经纤维支气管镜刷检获取并采用无血清BEGM培养人原代支气管上皮细胞操作简便、快捷有效,细胞存活率较高,能够提高上皮细胞纯度,可以为研究呼吸系统疾病提供良好的模型.