目的 评价健脾消渴方对2型糖尿病大鼠的药效,并探讨其可能的作用机制.方法 40只SD大鼠随机分为正常对照组、模型对照组、健脾消渴方组及盐酸二甲双胍组,每组10只,STZ+高脂饮食建立2型糖尿病大鼠模型,给予相应药物,持续4周.实验结束后取材,考察大鼠空腹血糖变化情况;ELISA法检测大鼠血清中白细胞介素-1(interleukin-1β,IL-1β)、白细胞介素-10(interleukin-10,IL-10)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、D-氨基酸氧化酶(D-amino acid oxidase,DAO)、D-乳酸含量;考察血清血脂四项[甘油三酯(triglycerides,TG)、总胆固醇(total cholesterol,TC)、高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein cholesterol,HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(low-density lipoprotein cholesterol,LDL-C)]含量;HE染色法观察各组大鼠胰腺及回肠的组织形态学改变;免疫荧光法检测大鼠回肠L细胞的免疫荧光法检测大鼠回肠L细胞的胰高糖素样肽-1(glucagon-like peptide-1,GLP-1)阳性表达;Western blotting法检测大鼠结肠组织中紧密连接蛋白(occludin)、闭锁小带蛋白-1(zonula occludens-1,ZO-1)、黏蛋白2(Muc2)蛋白相对表达.结果 健脾消渴方可有效降低2型糖尿病大鼠的空腹血糖,下调血清中IL-1β、TNF-α含量,上调IL-10含量,抑制DAO、D-乳酸含量;同时,显著性下调TG、TC、LDL-C含量,但在提高HDL-C含量方面上仅具有趋势性;此外,健脾消渴方可改善大鼠胰腺及回肠损伤,提高GLP-1阳性表达,并有效降低2型糖尿病大鼠结肠occludin、ZO-1、Muc2蛋白相对表达.结论 健脾消渴方对2型糖尿病大鼠具有较好的治疗效果,其作用可能与改善血清炎症、调节血脂,减轻肠道功能损伤,改善肠道屏障通透性与保护肠道屏障生理结构等作用有关.

目的:探究D-氨基酸氧化酶（D-amino acid oxidase，DAAO）在砷暴露致仔鼠学习记忆损害中的作用。方法:将18只昆明种妊娠小鼠采用随机数字表法分为未处理组（蒸馏水， n = 6）和染砷组[饮用水中含60 mg/L亚砷酸钠（NaAsO 2）， n = 12]，自由饮水；自妊娠第1天至仔鼠断乳前经母鼠染砷，仔鼠断乳后至实验结束以自由饮水方式染砷。仔鼠出生后6周，根据母鼠的组别，将染砷组仔鼠分为NaAsO 2组和NaAsO 2 + DAAO抑制剂6-氯苯并[d]异恶唑-3-醇（6-chlorobenzo[d]isoxazol-3-ol，CBIO）组，未处理组仔鼠为对照组；对照组和NaAsO 2组仔鼠腹腔注射0.5%羧甲基纤维素钠，NaAsO 2 + CBIO组仔鼠腹腔注射60 mg/kg CBIO，连续干预2周。干预结束后，采用Y迷宫实验测定仔鼠空间学习记忆能力；仔鼠经心脏灌流后取脑组织，并分离海马，经苏木素-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色观察仔鼠海马组织神经细胞形态；超高效液相串联三重四级杆质谱法测定D-丝氨酸含量；实时荧光定量PCR测定突触素（synaptophysin，SYP），突触小体相关蛋白25（synaptosomal-associated protein 25，SNAP25），突触后致密物95（postsynaptic density 95，PSD95），DAAO和N-甲基-D-天冬氨酸受体（N-methyl-D-aspartate receptor，NMDAR）亚基NR1、NR2A、NR2B mRNA水平。 结果:对照组、NaAsO 2组、NaAsO 2 + CBIO组仔鼠Y迷宫实验交替反应率[（58.06 ± 3.78）%、（48.61 ± 5.75）%、（56.25 ± 6.76）%]比较，差异有统计学意义（ F = 4.87， P = 0.023），且NaAsO 2组明显低于对照组和NaAsO 2 + CBIO组（均 P < 0.05）。HE染色结果显示，对照组仔鼠海马组织CA1、CA3区神经细胞数量较多，状态良好；NaAsO 2组神经细胞数量较少，形态不规则，细胞形态轮廓不清晰；NaAsO 2 + CBIO组神经细胞数量较多，细胞轮廓有所改善，组织损伤减轻。对照组、NaAsO 2组、NaAsO 2 + CBIO组仔鼠海马D-丝氨酸含量及SYP、SNAP25、PSD95、DAAO、NR1、NR2A、NR2B mRNA水平比较，差异均有统计学意义（ F = 5.41、4.41、10.16、7.60、6.98、5.63、6.53、4.33， P = 0.017、0.031、0.002、0.005、0.007、0.015、0.009、0.033）；其中，NaAsO 2组仔鼠海马D-丝氨酸含量和SYP、SNAP25、PSD95、NR1、NR2B mRNA水平均明显低于对照组和NaAsO 2 + CBIO组，NR2A mRNA水平明显低于对照组，DAAO mRNA水平明显高于对照组和NaAsO 2 + CBIO组（均 P < 0.05）。 结论:砷暴露能够损害仔鼠学习记忆能力，降低海马D-丝氨酸含量以及NMDAR亚基和突触相关基因转录水平，上调DAAO转录水平；而抑制DAAO可使D-丝氨酸含量以及NMDAR亚基和突触相关基因转录水平升高，改善砷暴露所致的仔鼠学习记忆能力损害。

为探究根肿菌胁迫对菘蓝生物碱及其合成关键酶基因表达的影响,该研究对根肿菌侵染后0、7、14、21 d的菘蓝进行病情形态分级、组织学观察、生理生化指标测定以及转录组学和代谢组学分析.结果表明:(1)接菌后0、7、14、21 d菘蓝根部分别发展为0级、1级、3级、5级的肿根,并且7 d是皮层入侵的关键时间点.(2)接种根肿菌14 d后,菘蓝叶内可溶性蛋白、丙二醛的含量,超氧化物歧化酶、过氧化物酶、多酚氧化酶、过氧化氢酶的活性与同时间对照组比较显著提高,并随着接菌时间的延长呈增加的趋势.(3)代谢组学一共检测到161种生物碱,其中吲哚类生物碱数量较多;与未接菌相比,菘蓝接菌后7、14、21 d分别存在16种、17种、39种差异代谢物且各组差异代谢物多富集在生物碱和氨基酸代谢通路.(4)转录组测序结果显示,与未接菌相比,菘蓝接菌后7、14、21 d分别存在2 439个、256个、6 437个差异表达基因,这3组共同富集到11个生物碱相关的代谢通路;与未接菌相比,接菌后7、14、21 d有9个基因(编码4种酶THS、TAT、YUCCA、ALDH)表达量均上升.该研究结果揭示了芸薹根肿菌与菘蓝之间的互作机制,探究了芸薹根肿菌对吲哚生物碱合成及其关键酶基因的影响,为后期菘蓝根肿病抗性基因及生物碱次生代谢途径的研究奠定了基础.

植物应答非生物胁迫与微管的动态变化有着密切的联系,而微管蛋白的结构和功能通过微管结合蛋白(microtubule-associated proteins,MAPs)进行调控.MAP70-1 是一种微管结合蛋白,为了揭示MAP70-1 响应干旱胁迫的分子机制,该研究以苹果砧木M26 为材料,采用PCR 方法,克隆MdMAP70-1基因(登录号XM_008390949),并进行生物信息学分析;采用叶盘法转化'黄珍珠'番茄,并进行抗旱性分析.结果显示:(1)成功克隆得到苹果MdMAP70-1,其开放阅读框(ORF)为1 860 bp,编码619 个氨基酸,相对分子量为68.77 kD,等电点8.64;多序列比对和系统进化分析表明,苹果MdMAP70-1 具有MAP70 家族蛋白的保守结构域,与葡萄VvMAP70-1 蛋白(Vitis vinifera VIT_201s0011g05790)的亲缘关系较近.(2)用农杆菌介导的叶盘法转化野生型番茄,经抗性筛选获得12株阳性植株,PCR检测获得分别含有目的条带(1 860 bp 和680 bp)的8个过表达株系,证明Md MAP70-1 基因已转入番茄中;qRT-PCR检测并选择表达量显著高于野生型的3 个转基因番茄株系OE-1、OE-2 和OE-3.(3)T3代转基因番茄干旱胁迫抗性分析表明,干旱胁迫0d和5 d,过表达番茄株系叶片的相对含水量(RWC)、脯氨酸(Pro)含量、可溶性蛋白(SP)含量及抗氧化酶活性等与野生型(WT)对照无差异;胁迫10 d和15 d时,过表达Md MAP70-1 转基因番茄植株的RWC、Pro含量、SP含量及抗氧化酶活性显著高于WT,而相对电导率(REC)和MDA含量较WT降低.研究表明,番茄中过表达苹果Md MAP70-1 基因能够提高番茄体内RWC、Pro、SP含量以及SOD、POD和CAT活性,并降低REC和MDA含量,增强番茄的抗旱性;该研究结果为利用MdMA P70-1基因提高植株的耐旱性研究以及微管结合蛋白的功能研究奠定了基础.

目的:克隆编码滇重楼赤霉素合成代谢途径中关键酶GA氧化酶(Gibberellic oxidase,GAox)的全长cDNA序列,并进行生物信息学分析.方法:根据滇重楼转录组测序序列,设计特异性PCR引物,利用RT-PCR技术扩增目标基因编码区的全长序列连接至pMD18-T载体上,进行序列测定及序列同源性比较分子系统进化树构建、结构域搜索及蛋白质三维结构预测等生物信息学分析.结果:成功克隆了滇重楼的的6条GAox基因,大小在1000 bp左右,分别命名为PpGA2ox1、PpGA2ox2、PpGA2ox3、PpGA2ox4、PpGA20ox1和PpGA3ox1.6条基因分别属于GA氧化酶三个不同的亚家族.滇重楼GAox蛋白氨基酸数量均在300～ 400,理论等电点在4～7左右,带正电荷.PpGA2ox1、PpGA2ox2和PpGA2ox4为不稳定蛋白,PpGA2ox3、PpGA20ox1和PpGA3ox1为稳定蛋白,均为没有跨膜结构域和信号肽的亲水蛋白.除了PpGA2ox1亚细胞定位在叶绿体,其他蛋白均定位在细胞质.滇重楼GAox蛋白与不同物种同源序列的序列相似性较高,保守性比较强.结论:首次从滇重楼中克隆了6条GAox基因并对其进行了初步的生物信息学分析.

L-正缬氨酸是合成抗高血压药物培垛普利的重要中间体,其合成主要通过化学方法,具有产品纯度低、环境污染等缺点.提出一种基于多酶介导拆分DL-正缬氨酸结合不对称还原生产高纯度L-正缬氨酸的方法.首先,将混合型DL-正缬氨酸中的D型经过D-氨基酸氧化酶氧化成相应酮酸,然后利用亮氨酸脱氢酶将酮酸不对称还原生成L-正缬氨酸,同时NADH被氧化成NAD+,最后利用甲酸脱氢酶构建NADH循环再生系统.D-正缬氨酸被氧化过程中会产生副产物过氧化氢(H2O2),通过外源添加过氧化氢酶消除该副产物.基于前期最适转化温度、最适转化pH优化基础上,对过氧化氢酶添加量和单次底物添加量进行优化,利用分批补料策略提高L-正缬氨酸产量.结果显示,在最适条件下,L-正缬氨酸产量达到61.09 g/L对映体过量值(e.e.)和转化率分别为99％和96.1％.本研究合成L-正缬氨酸较之化学方法,具有环境污染少、产品纯度高等特点,为制药行业中光学纯L-正缬氨酸的生产提供了一种有效的方法.

D-丝氨酸由丝氨酸消旋酶 (Serine racemase, Srr) 催化L-丝氨酸生成,由D型氨基酸氧化酶(D-amino-acid oxidase, DAAO) 催化降解,是谷氨酸能系统的重要神经递质.D-丝氨酸与N-甲基-D-天门冬氨酸(NMDA)受体的甘氨酸位点结合,与激动剂共同激活NMDA受体.偏头痛是一种反复发作的原发性头痛,在影响人类生活质量的同时也给社会造成了巨大负担.多项研究证实,NMDA受体激活在偏头痛发生发展中发挥重要作用.目前,D-丝氨酸调节NMDA受体在偏头痛中的作用机制尚无具体研究,但其在偏头痛相关疾病如神经病理性疼痛、抑郁、双相障碍、癫痫、精神分裂症中却有不同程度的研究.本文将通过总结D-丝氨酸在偏头痛相关疾病中的研究进展得出一定规律,从而为D-丝氨酸在偏头痛中的研究提供新的思路.

为探究汉黄芩苷是否具有抗衰老作用,本研究以果蝇为模型,考察汉黄芩苷对果蝇自然寿命的影响.采用RT-PCR和UPLC-MS/MS代谢组学技术,探索汉黄芩苷发挥抗衰老作用的潜在机制.结果显示,0.02和0.5 mg/mL汉黄芩苷均可整体延长果蝇寿命,并能够分别延长果蝇平均寿命5.64％和5.39％,延长最高寿命2.74％和5.1 2％;与30 d组相比,汉黄芩苷能够显著上调果蝇体内抗氧化酶基因SOD1、SOD2和CAT的表达水平,下调MTH的表达水平.果蝇代谢组学分析共找到17个潜在生物标志物,主要参与氨基酸代谢(D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代谢,丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢,精氨酸和脯氨酸代谢,缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸代谢)和能量代谢(氮代谢).该结果表明,汉黄芩苷延缓衰老与上调抗氧化基因表达和调控不同代谢途径有关.

D-丝氨酸( D-Ser)作为神经递质发挥重要作用的同时,其与氧化代谢酶D-氨基酸氧化酶(DAAO)具有细胞毒性,与癫痫、精神分裂症、老年痴呆症、抑郁症、焦虑症、成瘾等神经精神疾病的发生、发展有密切关系.本文将对D-Ser代谢途径及其与相关疾病的研究进展进行综述.

[目的]通过定点突变探究腾冲嗜热厌氧菌MB4中生物合成型丙氨酸消旋酶TtAlr底物通道内氨基酸位点A172和S173的功能.[方法]利用定点突变PCR技术构建突变体,通过亲和层析法纯化酶蛋白,采用D-氨基酸氧化酶偶联法检测各突变蛋白的活性及其稳定性.[结果]通过定点突变PCR成功得到8个突变体,酶学特性分析发现,A172位点突变为丝氨酸(S)后酶蛋白的相对活性有所提升,但含有该位点突变的酶蛋白稳定性均大幅下降;S173位点突变为天门冬氨酸(D)后导致突变体蛋白的最适反应温度提升了15℃,半衰期大幅延长,但相对活性明显下降.[结论]丙氨酸消旋酶TtAlr底物通道内A172和S173位点均是影响酶蛋白催化活性和稳定性的关键位点.