目的:建立人真皮成纤维细胞（HDF）高糖老化模型，探讨人蜕膜间充质干细胞（dMSC）来源外泌体对高糖老化HDF增殖、迁移、凋亡的影响及其可能机制。方法:采用实验研究方法。收集2021年1—3月解放军总医院第四医学中心收治的4例男性包茎患者（18~22岁）环切术后废弃包皮组织，分离培养获取原代HDF。取第6代HDF，按照随机数字表法分为低糖组和高糖组，分别采用低糖完全培养基和高糖完全培养基进行每72小时换液、不传代培养，10 d后取细胞，于接种后24 h，采用β-半乳糖苷酶试剂盒检测细胞衰老情况；于接种后48 h，采用蛋白质印迹法检测细胞衰老相关蛋白p16、p53表达情况；于接种后24、48、72 h，采用细胞计数试剂盒8（CCK-8）法检测细胞增殖情况；于接种后48 h，采用脱氧尿嘧啶核苷（EdU）染色法检测细胞增殖情况，采用流式细胞术检测细胞周期及凋亡情况；于接种后24 h，采用Transwell实验测定细胞迁移能力。取人dMSC培养48~72 h，采用差速高速离心法获取其外泌体，采用透射电子显微镜观察dMSC外泌体形态，采用纳米颗粒追踪分析法检测dMSC外泌体的粒径分布，采用蛋白质印迹法检测dMSC外泌体标志蛋白CD9、肿瘤易感基因101（TSG101）的表达。取dMSC外泌体及前述高糖完全培养基诱导老化的HDF共孵育24 h，采用PKH67试剂盒检测细胞摄取外泌体的情况。取前述高糖完全培养基诱导老化的HDF，同前分为单纯高糖组、高糖+低浓度外泌体组、高糖+高浓度外泌体组，分别于高糖完全培养基中加入等体积的磷酸盐缓冲液、终质量浓度为50 μg/mL dMSC外泌体、终质量浓度为100 μg/mL dMSC外泌体进行常规细胞培养。分组后同前于对应时间点采用CCK-8法和EdU染色法、流式细胞术、Transwell实验分别检测细胞增殖、细胞周期和凋亡及细胞迁移情况。根据前述结果，另取经高糖完全培养基诱导老化的HDF，分为单纯高糖组、高糖+高浓度外泌体组并同前处理。分组培养48 h，采用实时荧光定量反转录PCR法检测单纯高糖组和高糖+高浓度外泌体组细胞衰老相关的微小RNA-145-5p（miR-145-5p）、miR-498、miR-503-5p及其靶基因钙/钙调素依赖性蛋白激酶1D（CAMK1D）、人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源的基因（ PTEN基因）和细胞周期蛋白D1的mRNA表达情况。对数据行析因设计方差分析、单因素方差分析、LSD- t检验和独立样本 t检验。 结果:接种后24 h，高糖组HDF β-半乳糖苷酶阳性染色率为（38.4±4.2）%，明显高于低糖组的（16.5±2.2）%（ t=4.65， P<0.01）。接种后48 h，高糖组HDF的衰老相关蛋白p16和p53的表达量均明显高于低糖组（ t值分别为11.85、3.02， P<0.05或 P<0.01）。接种后24、48、72 h，高糖组HDF的增殖活性均明显低于低糖组（ t值分别为4.13、9.90、15.12， P<0.01）。接种后48 h，高糖组HDF的EdU阳性染色率明显低于低糖组（ t=3.83， P<0.05）。接种后48 h，高糖组HDF周期的G2/M+S亚群在3个亚群（G0/G1、S和G2/M）的占比明显低于低糖组（ t=8.74， P<0.01）。接种后24 h，高糖组HDF穿过Transwell滤膜到达下室的细胞数量为（37±6）个，明显少于低糖组的（74±7）个（ t=8.42， P<0.01）。接种后48 h，高糖组HDF凋亡率明显高于低糖组（ t=8.48， P<0.01）。dMSC外泌体为边缘清晰、大小分布均匀的杯状或者圆形囊泡，粒径基本处于80~200 nm。dMSC外泌体标志性蛋白CD9、TSG101表达均呈阳性。共孵育24 h，外泌体被HDF摄入胞内，主要分布于细胞核周围。分组培养24、48、72 h，高糖+低浓度外泌体组和高糖+高浓度外泌体组HDF增殖活性均明显高于单纯高糖组（ t值分别为6.36、6.10、7.76，8.92、12.17、10.74， P<0.01），高糖+高浓度外泌体组HDF增殖活性均明显高于高糖+低浓度外泌体组（ t值分别为7.92、4.82、4.72， P<0.01）。分组培养48 h，与单纯高糖组比较，高糖+低浓度外泌体组和高糖+高浓度外泌体组HDF EdU阳性染色率均明显升高（ t值分别为5.32、9.88， P<0.01）；与高糖+低浓度外泌体组比较，高糖+高浓度外泌体组HDF EdU阳性染色率显著升高（ t=5.27， P<0.01）。分组培养48 h，与单纯高糖组比较，高糖+低浓度外泌体组和高糖+高浓度外泌体组HDF中的G0/G1期亚群占比均显著降低（ t值分别为3.81、4.31， P<0.05），G2/M+S亚群占比均明显升高（ t值分别为3.81、4.31， P<0.05）。分组培养24 h，与单纯高糖组相比，高糖+低浓度外泌体组和高糖+高浓度外泌体组HDF穿过滤膜的数量均明显增多（ t值分别为10.14、13.39 ，P<0.01）；与高糖+低浓度外泌体组相比，高糖+高浓度外泌体组HDF穿过滤膜的数量明显增多（ t=6.27 ，P<0.01）。分组培养48 h，与单纯高糖组比较，高糖+低浓度外泌体组和高糖+高浓度外泌体组HDF凋亡率均明显降低（ t值分别为3.72、5.53， P<0.05或 P<0.01）。分组培养48 h，与单纯高糖组相比，高糖+高浓度外泌体组HDF的miR-145-5p、miR-498 mRNA表达量均明显上升（ t值分别为13.03、8.90， P<0.01），miR-503-5p mRNA表达量明显下降（ t=3.85， P<0.05）；高糖+高浓度外泌体组中HDF的CAMK1D、 PTEN基因mRNA表达量均明显低于单纯高糖组（ t值分别为8.83、5.97， P<0.01），细胞周期蛋白D1 mRNA表达量明显高于单纯高糖组（ t=4.03， P<0.05）。 结论:人dMSC来源外泌体可显著提高高糖老化HDF的增殖和迁移能力，抑制其凋亡。这可能与HDF内miR-145-5p和miR-498表达增高抑制了CAMK1D和 PTEN基因的表达及miR-503-5p表达下降促进了细胞周期蛋白D1的表达有关。

目的:探讨水通道蛋白3（AQP3）在皮肤光老化过程中的作用及机制。方法:将正常人皮肤成纤维细胞（NHDF）分为NHDF组（未转染）、AQP3 cDNA组（转染AQP3 cDNA）、AQP3 siRNA组（转染AQP3 siRNA）、核内不均一核糖核蛋白Q（hnRNPQ）cDNA组（转染hnRNPQ cDNA）、hnRNPQ siRNA组（转染hnRNPQ siRNA）、AQP3-hnRNPQ cDNA组（转染AQP3 cDNA和hnRNPQ cDNA）、AQP3-hnRNPQ siRNA组（转染AQP3和hnRNPQ siRNA）、cDNA空载体组（转染cDNA空载体）、siRNA空载体组（转染siRNA空载体）。用长波紫外线（UVA，10 J·cm -2·d -1）连续照射已经转染或未转染的NHDF 3 d来建立细胞衰老模型，同时以未接受UVA照射的NHDF作为对照。用细胞计数法评估各实验组细胞增殖活性，衰老相关-β半乳糖苷酶染色试剂盒对各实验组进行染色来评估HDF的衰老水平，用荧光素酶报告基因技术检测p53转录调控活性，用Western印迹分析NHDF中AQP3、hnRNPQ及衰老相关蛋白p53、p21的表达水平。两组间比较采用独立样本 t检验，多组间比较采用ANOVA检验。 结果:用UVA连续照射各组NHDF 3 d后，NHDF中p53、p21的表达水平和β半乳糖苷酶阳性细胞百分率明显高于未照射的对照组（ P<0.05），但是AQP3的表达水平和照射后第5、6、7天细胞增殖活性明显低于对照组（ P<0.05）。在接受UVA连续照射3 d后，AQP3 siRNA组中UVA诱导的NHDF的衰老相关表型较siRNA空载体组明显加重，两组间p53、p21、hnRNPQ的表达水平和β半乳糖苷酶阳性细胞百分率、p53转录调控活性、细胞增殖活性差异均有统计学意义（均 P<0.05），进一步沉默hnRNPQ能够逆转上述反应。与siRNA空载体组相比，hnRNPQ siRNA组中UVA诱导的NHDF的衰老相关表型明显减轻，两组间p53、p21表达水平、β半乳糖苷酶阳性细胞百分率、p53转录调控活性和细胞增殖活性差异均有统计学意义（均 P<0.05）。在接受UVA连续照射3 d后，cDNA空载体组中p53、p21、hnRNPQ的表达水平、β半乳糖苷酶阳性细胞百分率、p53转录调控活性和细胞增殖活性分别为0.56 ± 0.08、0.70 ± 0.07、0.92 ± 0.03、（81.53 ± 7.62）%、7.16 ± 0.25、（2.15 ± 0.23）× 10 6/ml，而AQP3 cDNA组中UVA诱导的NHDF的衰老相关表型明显轻于cDNA空载体组，其上述指标分别为0.25 ± 0.06、0.23 ± 0.06、0.82 ± 0.09、（31.23 ± 6.54）%、2.52 ± 0.36、（2.93 ± 0.33）× 10 6/ml，两组比较，差异均有统计学意义（均 P<0.05），进一步过表达hnRNPQ能够逆转上述效应。在接受UVA连续照射3 d后，hnRNPQ cDNA组中p53、p21的表达水平、β半乳糖苷酶阳性细胞百分率、p53转录调控活性和细胞增殖活性分别为1.41 ± 0.09、1.42 ± 0.06、（91.06 ± 4.24）%、12.35 ± 0.88、（1.23 ± 0.41）× 10 6/ml，与cDNA空载体组相比，hnRNPQ cDNA组中UVA诱导的NHDF的衰老相关表型明显加重，两组比较，上述指标差异均有统计学意义（均 P<0.05）。 结论:AQP3可能通过调控hnRNPQ下调p53的表达来减缓UVA诱导的NHDF衰老。

目的 观察蜕皮甾酮对皮肤光老化和黑色素生成的影响.方法 ①实验分为正常对照组、1.0 μmol/L蜕皮甾酮组、1.5 μmol/L蜕皮甾酮组、2.0 μmol/L蜕皮甾酮组,各组分别处理角质形成细胞(HaCaT细胞)、黑素细胞(B16F10 细胞)和人真皮成纤维细胞(HDF细胞)后,MTT法检测细胞活力.②实验分为正常对照组、UVB组、1.0 μmol/L 蜕皮甾酮组、1.5 μmol/L蜕皮甾酮组、2.0 μmol/L 蜕皮甾酮组,Annexin V-FITC/PI 双标法检测 HaCaT 细胞凋亡情况,Hoechst 33258 染色法检测凋亡细胞的形态,Western blot 法检测HaCaT细胞中基质金属蛋白酶-1(MMP-1)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)、环氧化酶-2(COX-2)、沉默调节蛋白1(Sirt-1)表达情况.③实验分为正常对照组、1.0 μmol/L 蜕皮甾酮组、1.5 μmol/L蜕皮甾酮组、2.0 μmol/L蜕皮甾酮组,Western blot 法检测HaCaT细胞中透明质酸合成酶 2(HAS-2)、转谷氨酰胺酶 1(TGM1)和HDF细胞中Ⅰ型胶原蛋白Iα1 肽链(COL1A1)表达情况.④实验分为正常对照组、黑色细胞刺激素组、1.0 μmol/L蜕皮甾酮组、1.5 μmol/L蜕皮甾酮组、2.0 μmol/L蜕皮甾酮组、熊果苷组,采用分光光度仪检测B16F10 细胞黑色素生成及分泌情况.⑤实验分为正常对照组、左旋多巴组、1.0 μmol/L蜕皮甾酮组、1.5 μmol/L蜕皮甾酮组、2.0 μmol/L蜕皮甾酮组,采用分光光度仪检测各组蘑菇酪氨酸酶活性.结果 不同浓度的蜕皮甾酮对HaCaT细胞、B16F10 细胞、HDF细胞活力均无明显影响.蜕皮甾酮各组HaCaT细胞凋亡率及HaCaT细胞中MMP-1、MMP-9、COX-2 蛋白相对表达量均明显低于UVB组(P均<0.05),HaCaT细胞中Sirt-1 蛋白相对表达量均明显高于UVB组(P均<0.05).蜕皮甾酮各组HaCaT细胞中HAS-2、TGM1 蛋白相对表达量和HDF细胞中COL1A1蛋白相对表达量均明显高于正常对照组(P均<0.05).蜕皮甾酮各组和熊果苷组B16F10 细胞黑色素生成和分泌吸光度值均明显低于黑色细胞刺激素组(P均<0.05).蜕皮甾酮各组蘑菇酪氨酸酶活性均明显低于左旋多巴组(P均<0.05).结论 蜕皮甾酮可能具有延缓皮肤光衰老、抗皱和抗黑色素生成作用.

目的 探讨miR-181-5p靶向10 号染色体上缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因(PTEN)/蛋白激酶B(AKT)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)通路对氧化应激诱导下人皮肤成纤维(HDF)细胞自噬及老化的影响.方法 以HDF细胞为研究对象,利用不同浓度H2 O2(0、100、200、500 μmol/L)处理细胞,通过CCK-8 法检测细胞存活率,确定构建细胞老化模型的适宜H2 O2 浓度,并将该浓度H2 O2 诱导的HDF细胞命名为H2 O2 模型细胞;双荧光素酶报告基因实验验证miR-181-5p与PTEN的靶向关系;利用Lipofectamine2000 试剂盒对H2 O2 模型细胞进行转染,细胞分组为:空白组(细胞未转染)、miR-181-5p mimics组、miR-NC组、anti-miR-181-5p组、anti-miR-NC组;荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测细胞中miR-181-5p表达水平;Western印迹检测细胞中PTEN/AKT/mTOR通路相关蛋白、自噬相关蛋白(Beclin)-1、微管相关蛋白轻链(LC)3Ⅱ/Ⅰ表达水平;β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)试剂盒观察各组细胞形态及SA-β-gal染色阳性比例.结果 随着H2 O2 浓度的升高,HDF细胞存活率逐渐降低,有统计学差异(P<0.05),H2 O2 浓度为200 μmol/L时,细胞存活率为51.64%,所以选择200 μmol/L H2 O2作为适宜诱导浓度;与HDF细胞相比,H2 O2 模型细胞中miR-181-5p、磷酸化(p)-AKT、p-mTOR蛋白表达明显上调,PTEN蛋白表达明显下调(P<0.05);双荧光素酶报告基因实验证实PTEN和miR-181-5p存在靶向关系;与空白组和miR-NC组比较,miR-181-5p mimics组中miR-181-5p、p-AKT、p-mTOR蛋白表达明显上调,PTEN、Beclin-1、LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表达明显下调(P<0.05),细胞排列不规则、变大,轮廓不清楚,折光性差等老化状态更加明显,SA-β-gal染色阳性率显著升高(P<0.05);与空白组和anti-miR-NC组比较,anti-miR-181-5p组中miR-181-5p、p-AKT、p-mTOR蛋白表达明显下调,PTEN、Beclin-1、LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表达明显上调(P<0.05),大多数细胞呈长梭形,轮廓清晰,折光性好,且SA-β-gal染色阳性率显著降低(P<0.05).结论 抑制miR-181-5p可能通过靶向上调PTEN蛋白表达,抑制AKT/mTOR通路,促进细胞自噬,进而延缓氧化应激诱导下HDF细胞老化.

目的:研究异补骨脂素对光老化人真皮成纤维(HDF)细胞ER/TGF-β1/Smads信号通路的调控效应.方法:建立长波紫外线(UVA)损伤HDF模型,给予不同浓度异补骨脂素和通路阻断剂进行干预,MTT法检测细胞增殖率,Western blotting和Real Time-PCR法检测各组细胞内信号转导分子(Smad3)、转化生长因子(TGF-β1)、Ⅰ型胶原(COL1A1)蛋白和对应mRNA的表达.结果:与正常对照组比较,模型组增殖率及Smad3、TGF-β1、COL1A1蛋白和mRNA表达均显著降低(P＜0.01);与模型组比较,各给药组增殖率和Smad3、TGF-β1、COL1A1蛋白及mRNA表达均显著升高(P＜0.01);与异补骨脂素高浓度组比较,TGF-β1、Smad3、ER三个阻断剂组相对应的TGF-β1、Smad3和COL1A1蛋白及相应mRNA表达均显著降低(P＜0.01).结论:异补骨脂素能增加HDF细胞TGF-β1、Smad3、COL1A1蛋白及mRNA表达,对光老化HDF细胞胶原合成有促进作用;但这种作用能被TGF-β1、Smad3和ER阻断剂所抑制,推测异补骨脂素促进胶原合成的作用机制与ER/TGF-β1/Smads信号通路有关.

目的 研究异补骨脂素对人真皮成纤维细胞(human dermal fibroblasts, HDF)增殖活性及抗老化相关蛋白表达的影响,并探讨其作用机制.方法 将细胞按随机数字表法分为空白组、模型组、雌二醇组、异补骨脂素组、雌激素受体拮抗剂+雌二醇组、雌激素受体拮抗剂+异补骨脂素组、P38通路阻断剂组.分别给予不同药物进行干预24 h.除空白组外,其余各组细胞给予紫外线照射,照射剂量为150 mJ/cm2.采用MTT法检测细胞增殖率,采用Western blot法检测细胞中胶原蛋白Ⅰ(collagenⅠ, COLⅠ)、MMP-1、雌激素受体β(estrogen receptor β, ERβ)、P38、p-P38蛋白表达量,实时荧光定量PCR法检测MMP-1 mRNA表达.结果 与模型组比较,异补骨脂素10、1、0.1、0.01 μmol/L组HDF细胞增殖率升高(P<0.01);异补骨脂素10 μmol/L组HDF细胞COLⅠ[(0.326±0.006)比(0.176±0.007)]、ERβ[(0.281± 0.011)比(0.143 ± 0.006)]蛋白表达升高(P<0.01),MMP-1[(0.256 ± 0.006)比(0.395 ± 0.006)]和p-P38[(0.224±0.003)比(0.318±0.005)]蛋白表达降低(P<0.01);与异补骨脂素10 μmol/L组比较,雌激素受体拮抗剂+异补骨脂素组 ERβ[(0.120 ± 0.007)比(0.281 ± 0.011)]蛋白表达下降、MMP-1 mRNA[(1.377±0.012)比(1.024±0.010)]表达升高(P<0.01).结论 异补骨脂素可能通过ER-P38 MAPK信号通路使MMP-1降解,进而促进胶原合成,达到预防和治疗光老化的目的.

目的 从分子生物学水平探讨杜仲中松脂醇二葡萄糖苷(PDG)对光老化人真皮成纤维细胞(HDF)ER/TGF-β1/Smads信号通路的调控机制.方法 建立以长波紫外线模型损伤HDF细胞.给予不同浓度PDG和通路阻断剂进行干预,用MTT检测细胞增殖率,Real time-PCR和Western blot法检测各组细胞内含有的信号转化生长因子(TGF-β1)、转导分子(Smad3)、I型胶原(COL1A1)对应mRNA和蛋白的表达.结果 与空白组比较,模型组增殖率及TGF-β1、Smad3、COL1A1 mRNA和蛋白表达均显著降低(P<0.01);与模型组比较,各给药组增殖率和TGF-β1、Smad3、COL1A1 mRNA和蛋白表达均显著升高(P<0.01);与PDG高浓度组比较,TGF-β1、Smad3、ER三个阻断剂组相对应的TGF-β1、Smad3和COL1A1相应mRNA和蛋白表达均显著降低(P<0.01).结论 PDG能增加HDF细胞TGF-β1、Smad3、COL1A1对应mRNA和蛋白表达,对光老化HDF细胞胶原合成有促进作用;但这种作用能被TGF-β1、Smad3和ER阻断剂所抑制,PDG促进胶原合成的作用机制可能与ER/TGF-β1/Smads信号通路有关.

目的:观察人参皂苷Rg1抗长波紫外线(Ultravio1et A,UVA)对人皮肤成纤维细胞(Human dermal fibroblasts,HDF)的损伤作用,为研究开发光老化防护剂提供依据.方法:分离HDF进行原代培养及冻存;复苏HDF传代培养至第6～8代用于样品活性检测;采用改良MTT法检测UVA照射前后给予人参皂苷Rg1 HDF存活率的变化情况,用维生素C作阳性对照.结果:在照射前24h预先给予人参皂苷单体Rg1,在2.5～40μg/ml浓度时细胞存活率较模型组明显提高,差异有统计学意义(P<0.05);且5、10μg/ml组的细胞存活率优于阳性对照组(P<0.05).照射后给予人参皂苷单体Rg1,在2.5～40μg/ml浓度时细胞存活率均较模型组明显提高(P<0.05).结论:人参皂苷Rg1在2.5～40μg/ml范围内对HDF的UVA损伤有较好的预防和治疗作用.

目的 探讨薏苡仁提取物(ESC)对中波紫外线(UVB)照射、体外培养人皮肤成纤维细胞(HDF)的基质金属蛋白酶1、3(MMP1、MMP3)mRNA表达的影响.方法 采用酶消化法和组织块法培养HDF.四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法(MTT)检测ESC对HDF增殖的影响.用逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)检测1、2.5、5μL/mL ESC及基质对中波紫外线(UVB)照射后HDF中MMP1、MMP3 mRNA表达水平的变化.结果 UVB照射可以显著降低HDF中MMP1、MMP3 mRNA的表达,差异有统计学意义(P<0.05).30 mJ/cm2 UVB照射细胞组加入不同浓度基质及ESC,MMP1、MMP3 mRNA与对照组的差异有统计学意义(P<0.05).结论 ESC可有效降低UVB照射后的HDF中MMP1、MMP3 mRNA表达,且有剂量-效应关系.为后续研究抗皮肤光老化提供基础.

目的 探讨人脐带间充质干细胞来源外泌体(exosomes derived from human umbili-cal cord mesenchymal stem cells,hucMSC-exo)对中波紫外线(UVB)诱导的光老化人真皮成纤维细胞(human dermal fibroblasts,HDF)的影响.方法 使用超高速离心法从hucMSC条件培养基中分离hucMSC-exo.体外培养HDF,用UVB照射建立细胞光老化模型.实验分为正常对照组、模型组和实验组.使用hucMSC-exo于UVB干预前24 h对HDF进行预处理.培养48 h后,使用流式细胞仪检测细胞周期,使用CCK-8法检测细胞增殖活力,使用微丝绿色荧光探针标记细胞骨架;培养72 h后,使用β-半乳糖苷酶染色检测细胞衰老水平,分别使用实时荧光PCR和Western blot 检测基质金属蛋白酶-1(matrix metalloproteinases,MMP-1)、Ⅰ 型胶原蛋白(type Ⅰ collagen,COL-Ⅰ)和白介素 1(interleukin-1,IL-1)的相对表达水平.结果 hucMSC-exo可以提高光老化HDF增殖活力,调控细胞周期,缓解细胞衰老的改变.hucMSC-exo可以下调MMP-1 mRNA和蛋白的表达并上调COL-Ⅰ的mRNA和蛋白的表达,实验组同模型组及对照组相比,差异均具有统计学意义(P＜0.05).结论 hucMSC-exo预处理对皮肤光老化HDF具有保护作用.这可能与hucMSC-exo参与调控MMPs与COL-Ⅰ的表达相关.