目的:构建EGFR-MEK-TZ三联合靶向分子LN-1，探讨其对去势抵抗性前列腺癌细胞的作用。方法:设计LN-1的分子结构，并据此展开药物分子合成步骤的研究。以去势抵抗性前列腺癌细胞株LNCap和PC3作为研究对象，分别分为实验组和对照组，前者为LN-1处理组（50 mmol）。利用细胞技术试剂盒CCK-8法、克隆形成实验和EdU荧光染色法检测LN-1对LNCap和PC3细胞增殖活性的影响，采用RT-qPCR法检测各组去势抵抗性前列腺癌细胞中凋亡相关基因的表达水平。结果:设计的LN-1分子由EGFR片段、MEK片段和TZ烷基化片段三个活性片段通过二乙醇胺片段相互连接构成，并且EGFR片段、MEK片段通过碳酸酯酰胺键进行偶联。以MEK片段作为起始原料，获得43.3%产率的目标产物LN-1。LN-1可有效抑制LNCap和PC3肿瘤细胞的增殖活性（P<0.05）。此外，Caspase-3、p53和Bax mRNA水平在实验组明显较对照组升高，差异有统计学意义（P<0.05）。结论:EGFR-MEK-TZ三联合靶向分子LN-1的成功构建提示该分子结构设计的合理性和可行性，其可通过抑制去势抵抗性前列腺癌细胞LNCap和PC3的增殖，并诱导其凋亡，从而发挥抗肿瘤作用。

目的 通过噬菌体展示技术,从免疫骆驼的外周淋巴血液中获得与RSPO1结合的纳米抗体,纯化后构建RSPO1噬菌体展示文库,并进行免疫淘选.方法 将RSPO1基因与pCMV-Fc载体连接后,构建质粒RSPO1-pCMV-Fc,瞬时转染 HEK-293F 细胞,表达 RSPO1 蛋白;经 Protein A 凝胶柱、HiLoadTM 16/600 SuperdexTM 200pg 柱、Super-dexTM 24 Increase10/300GL柱依次纯化RSPO 1蛋白后,免疫骆驼,收集外周血并分离淋巴细胞;提取细胞RNA,反转录合成cDNA,通过2步巢式PCR扩增VHH片段,克隆至pMECS噬菌粒载体中,构建噬菌体展示文库,经2轮淘选使与RSPO1结合的噬菌体得到聚集后,进行ELISA鉴定并测序.结果 质粒RSPO1-pCMV-Fc经PCR及测序鉴定证明构建正确.表达的RSPO1蛋白相对分子质量约172 000,纯度约为70％;RSPO1噬菌体展示文库库容为1.2× 108cfu,经2轮淘选使噬菌体富集度达到12;共获得19个纳米抗体序列.结论 获得了多样性良好的纳米抗体序列,为了解与RSPO1相关的Wnt信号通路提供了可能.

目的 探讨长链非编码RNA(lncRNA)肺癌相关转录本1(LUCAT1)喉癌细胞增殖和转移的影响及其分子机制.方法 选取2022年6月至2023年12月商丘市第一人民医院收治的39例喉癌组织和对应癌旁组织作为研究对象,采用实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)技术分析喉癌组织和癌旁组织中lncRNA LUCAT1表达水平.喉癌细胞系AMC-HN-8随机分为lncRNA对照组、lncRNA LUCAT1 KD 和 lncRNA LUCAT1 组,分别采用脂质体转染 lncRNA 对照、lncRNA LUCAT1 短发卡RNA(shRNA)和lncRNA LUCAT过表达质粒,转染72 h后,采用细胞计数试剂盒(CCK-8)和克隆形成实验分析3组细胞增殖能力;采用划痕实验和Traswell实验分析细胞的迁移和侵袭能力;RNA沉淀分析lncRNA LUCAT结合蛋白.蛋白质免疫应激分析lncRNA LUCAT结合蛋白缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)水平,荧光定量PCR分析HIF-1α靶基因表达水平.组间比较采用t检验.结果 喉癌组织lncRNA LUCAT1表达水平(1.65±0.23)明显高于癌旁组织(1.01±0.20),差异有统计学意义(t=12.920,P＜0.05).lncRNA对照组细胞吸光度值和EDU阳性率[1.71±0.12、(74.17±8.13)％]明显高于 lncRNA LUCAT1 KD 组[0.71±0.09、(45.50±9.35)％],差异有统计学意义(t=16.490、5.665,P＜0.05).lncRNA 对照组细胞吸光度值和 EDU 阳性率[1.71±0.12、(74.17±8.13)％]明显低于 lncRNA LUCAT1 组[1.87±0.08、(87.83±2.14)％],差异有统计学意义(t=2.806、3.980,P＜0.05).lncRNA 对照组细胞迁移数量和侵袭数量[(116.83±8.61)、(93.17±4.62)个]明显高于 lncRNA LUCAT1 KD 组[(68.33±10.15)、(49.33±7.11)个],差异有统计学意义(t=8.924、12.650,P＜0.05).lncRNA 对照组细胞吸光度值和 EDU 阳性率[(116.83±8.61)、(93.17±4.62)个]明显低于 lncRNA LUCAT1 组[(143.83±7.28)、(132.83±7.25)个],差异有统计学意义(t=5.886、11.300,P＜0.05).HIF-1α 蛋白与 lncRNA LUCAT1 存在相互作用.lncRNA 对照组细胞血管内皮生长因子(VEGF)、3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1(PDK1)和葡萄糖转运蛋白1(GLUT1)表达水平(0.97±0.10、0.93±0.06、1.67±0.11)明显高于 lncRNA LUCAT1 KD 组(0.38±0.10、0.36±0.51、0.51±0.5),差异有统计学意义(t=10.400、16.170、8.560,P＜0.05).VEGF、PDK1 和 GLUT1 表达水平(0.97±0.10、0.93±0.06、1.67±0.11)明显低于 lncRNA LUCAT1 组(1.55±0.14、1.51±0.11、1.44±0.09),差异有统计学意义(t=8.220、11.140、4.584,P＜0.05).结论 lncRNA LUCAT1在喉癌组织呈高表达,通过与HIF-1α结合,调节下游基因表达,进而影响喉癌细胞增殖和转移过程.

目的 探讨人乳头瘤病毒E6 蛋白(human papillomavirus E6 protein,HPV E6)对宫颈癌Hela细胞增殖、侵袭和迁移的影响及潜在分子机制.方法 基于Illumina Hiseq 4000 转录组测序技术检测 12 例不同程度的宫颈病变组织之间的基因表达特征,筛选与HPV相关的差异基因;利用GO、KEGG Pathway 方法对差异基因进行生物学功能富集分析;Western blotting检测正常宫颈上皮细胞 HCerEpic、宫颈癌细胞 Hela中 Rap、Rap1GAP蛋白表达水平;通过平板克隆实验、Transwell实验和划痕实验检测其增殖、侵袭及迁移能力;通过sh-E6 慢病毒转染下调细胞内HPV E6 表达,分为对照组(Hela细胞)、空载组(sh-NON)和sh-E6 组(低表达HPV E6);下调HPV E6 表达,采用平板克隆和CCK-8 实验分别检测每组细胞增殖能力和细胞活力;Transwell和划痕实验检测细胞侵袭、迁移能力;Western blotting检测各组细胞中E6、Rap1、Rap1GAP、CyclinD1、E-cadherin、N-cadherin蛋白的表达水平.在sh-E6 组基础上过表达Rap1,Western blot检测细胞中Rap1 通路及相关蛋白的表达水平;平板克隆实验、Transwell实验和划痕实验分别检测细胞增殖、侵袭和迁移能力.结果 测序结果显示,与正常宫颈HPV阴性比较,HPV阳性的正常宫颈、CIN、宫颈癌组织中差异上调表达的基因分别有 340、864 和 1036 个;3 个数据集寻找共有差异基因共 24 个.GO|KEGG 富集分析 24 个差异表达基因主要富集在Rap1 相关信号通路.与HCerEpic细胞相比,Hela细胞内Rap1 表达升高,Rap1GAP表达降低(P<0.01);其细胞的增殖、侵袭和迁移能力增强(P<0.01);下调HPV E6 表达后,与Hela组比较,sh-E6 组细胞的增殖、细胞集落形成、侵袭和迁移能力降低(P<0.001);Western blotting表明,与Hela组比较,sh-E6 组细胞内Rap1、CyclinD1、N-cadherin蛋白表达降低,Rap1GAP和E-cadherin蛋白表达升高(P<0.001).与sh-E6 组相比,过表达Rap1 组(sh-E6/OE Rap1)细胞内Rap1/Rap1GAP、CyclinD1、E-cadherin和N-cadherin蛋白表达被恢复(P<0.001),细胞增殖、侵袭迁移能力被恢复(P<0.01).结论 在宫颈癌发展过程中,HPV E6 通过激活Rap1 信号通路促进宫颈癌细胞增殖、侵袭及迁移.

目的:探究组蛋白甲基转移酶Kmt2c基因杂合缺失对小鼠血液系统的影响.方法:使用CRISPR/Cas9技术构建Kmt2c基因杂合缺失的模型小鼠,血常规连续监测小鼠全血细胞计数的变化;通过体外集落形成实验探究骨髓细胞的克隆性扩增能力;流式细胞术分析突变小鼠体内原始造血细胞群(长期造血干细胞、短期造血干细胞、多能祖细胞)的比例变化.结果:成功构建Kmt2e基因杂合缺失小鼠(Kmt2c+/-)模型,其Kmt2c mRNA表达水平是C57BL/6J小鼠的28％.Kmt2c+/-小鼠骨髓细胞体外集落形成能力随着传代次数的增加而增强,并在第四代时集落数显著高于对照组(P＜0.05).Kmt2c+/-小鼠原始造血细胞群中的长期造血干细胞和短期造血干细胞比例分别为19.6％±3.3％及28.9％±4.9％,较对照组的16.9％±2.6％及18.9％±2.5％有增高趋势,但差异无统计学意义(P＞0.05).Kmt2c+/-小鼠的白细胞计数在监测的第12周后逐渐上升,在第14周时为(9.8±1.0)× 109/L,显著高于对照组的(7.3±1.4)×109/L(P＜0.05).结论:Kmt2c+/-小鼠的骨髓细胞具有克隆性扩增的潜能.

目的 合成一种拉帕替尼的衍生物,探讨其抗HER2阳性乳腺癌的作用和作用机制.方法 以阿司匹林为酰化试剂,应用Steglich酯化反应,经DCC-DMAP催化合成了乙酰化拉帕替尼(化合物Ⅰ).应用CCK8及平板克隆法考察化合物Ⅰ抗HER2阳性乳腺癌细胞增殖的能力,采用分子对接技术预测化合物Ⅰ的作用靶点,通过Western blot法揭示化合物Ⅰ对BT474细胞AMPK/mTOR通路蛋白的影响.结果 化合物Ⅰ的结构经1H NMR、13C NMR和MS确证.化合物 Ⅰ 对 BT474 细胞的IC50 分别为(112.05+3.21)nmol·L-1(24h)、(35.87±0.79)nmol·L-1(48 h)和(4.98±0.05)nmol·L-1(72 h);化合物 Ⅰ 可显著抑制 BT474 细胞的克隆形成;分子对接结果显示化合物Ⅰ与EGFR、HER2、AMPK、mTOR和AKT1均有较好的结合;Western blot结果显示化合物Ⅰ可显著上调p-AMPK、AMPK,且激动作用较拉帕替尼更强,化合物Ⅰ亦可显著下调EGFR、HER2、p-AKT1、AKT1、p-mTOR和mTOR.结论 化合物Ⅰ较拉帕替尼有更强的抗HER2阳性乳腺癌增殖活性,其主要通过激动AMPK,抑制AKT1和mTOR,调节AMPK/mTOR通路发挥作用.

目的 探讨牙龈卟啉单胞菌(Pg)的毒力因子RgpB在食管鳞癌化疗耐药中的作用机制.方法 采用免疫沉淀-质谱联用技术筛选与Pg的毒力因子RgpB互作的自噬调节因子;运用免疫共沉淀实验探索RgpB和自噬调节因子TBC1D5之间的相互作用;采用蛋白免疫印迹法测定Pg感染对食管癌细胞膜受体分子Cx43表达的影响;使用细胞免疫荧光检测Lamp1、Cx43与TBC1D5的关系;利用自噬双荧光观察Pg感染对自噬小体与溶酶体融合的影响;使用平板克隆及CCK-8法检测Pg感染及Cx43抑制剂在使用化疗药后对食管癌细胞系增殖作用的影响.结果 免疫沉淀-质谱联用技术筛选出与RgpB互作的自噬调节因子TBC1D5;免疫共沉淀结果显示,Pg分泌的毒力因子 RgpB可与自噬调节因子TBC1D5直接结合并相互作用;蛋白免疫印迹法结果显示,感染Pg后食管癌细胞膜Cx43表达量高于未感染组(P<0.05);细胞免疫荧光结果显示,在感染Pg后,Cx43在细胞膜表面的表达量增加(P<0.05);stubRFP-sensGFP-LC3自噬双荧光结果显示,在Pg感染时,自噬体与溶酶体融合受到阻断;平板克隆及CCK-8法结果显示,使用化疗药后,Cx43抑制剂能够逆转Pg感染对食管癌细胞系的促进作用.结论 Pg入侵食管癌,其毒力因子RgpB阻碍自噬小体与溶酶体融合,从而使膜受体分子Cx43免受溶酶体降解,导致食管癌化疗耐药.

目的 通过生物信息学和细胞实验探究HNRNP A1在结直肠癌中的临床意义及其在肿瘤组织中的表达情况.方法 使用HPA、TIMER和GEPIA数据库,分析HNRNP A1在结直肠癌组织中的表达水平,并检验HNRNP A1与Ki-67/VEGFA在结直肠癌中表达的相关性.使用Kaplan-Meier Plotter数据库评估HNRNP A1 mRNA水平与结直肠癌患者生存率之间的联系.通过基因富集途径分析,预测HNRNP A1在结直肠癌中的潜在生物学作用.通过免疫组织化学(IHC)和Western blotting技术检测HNRNP A1在结直肠癌及其癌旁组织中的蛋白表达.利用TIMER数据库网站对HNRNP A1在免疫浸润细胞中的表达进行预测.使用慢病毒敲低RKO/Caco2细胞中HNRNP A1的表达;通过CCK-8实验检测细胞增殖,使用克隆形成实验检测HNRNP A1对细胞增殖能力的影响;利用细胞划痕实验和Transwell迁移实验评估两组细胞(RKO/Caco2-nc、RKO/Caco2-sh)的迁移能力.最后验证HNRNP A1小分子抑制剂(VPC-80051)对肿瘤细胞增殖的影响.结果 在结直肠癌(CRC)肿瘤组织中HNRNP A1的表达显著上调并与患者的不良预后显著相关(P<0.01).TIMER数据库的分析结果指出,HNRNP A1与肿瘤微环境中的免疫细胞之间存在一定的相关性.根据GEPIA数据库的分析,CRC组织中HNRNP A1、MKI67和VEGFA的表达均较高(P<0.05),且HNRNP A1与这两者之间存在正相关关系.通过Kaplan-Meier Plotter进行的生存分析表明,在CRC中,HNRNP A1的高表达预示着较差的总生存期(P=0.0081)和无进展生存期(P=0.012).基因富集通路分析的数据显示,HNRNP A1可能参与到多个与CRC进展相关的生物途径中.HNRNP A1影响RKO/Caco2细胞的增殖和迁移能力,对照组(RKO/Caco2-nc)的增殖能力、克隆形成能力和迁移能力均优于实验组(RKO/Caco2-sh),差异有统计学意义(P<0.05);HNRNP A1小分子抑制剂(VPC-80051)可以有效抑制结直肠癌增殖活性,并具有时间和浓度依赖性;IHC显示HNRNP A1在结直肠癌中高表达,且与肿瘤分期有密切关系(P<0.0001).结论 HNRNP A1基因在CRC组织中表达较高,并可调节细胞的增殖和迁移能力,与不良预后密切相关,同时HNRNP A1小分子抑制剂(VPC-80051)也可以抑制结直肠癌细胞的增殖,因而可作为CRC治疗过程中新的潜在治疗靶点.

目的:观察AFAP1L1基因在胃癌中的表达及与患者预后的相关性，并探讨其在胃癌发生、发展中的相关功能及可能机制。方法:利用癌症基因组图谱(TCGA)数据分析AFAP1L1在泛癌中的表达差异情况，并通过Kaplan-Meier分析AFAP1L1与胃癌及其他肿瘤预后的相关性。在胃癌中选择与AFAP1L1正相关的前300个基因进行基因本体(GO)富集、京都基因与基因组百科全书(KEGG)信号通路分析。最后利用RNA干扰技术沉默胃癌细胞中AFAP1L1表达后进行细胞计数试剂盒(CCK-8)测定，集落形成测定和裸鼠皮下移植瘤实验评估AFAP1L1对胃癌细胞增殖的影响。多组间比较应用单因素方差分析，两组间比较采用 t检验。 结果:TCGA数据分析显示，AFAP1L1在包括胃癌在内的多种肿瘤中高表达。生存分析结果显示AFAP1L1高表达与胃癌的预后差相关( P<0.05)。基因富集与功能分析显示ALKBH1高表达与细胞增殖相关基因密切相关，沉默AFAP1L1能抑制胃癌细胞的增殖和克隆形成能力，差异有统计学意义( F＝23.412、29.153， P<0.05)，同时沉默AFAP1L1后裸鼠移植瘤的体积和重量也明显小于对照组，差异有统计学意义( t＝12.462、9.541， P<0.05)。 结论:AFAP1L1在胃癌组织中高表达可作为患者预后不良的分子标志物，可通过促进细胞增殖促进胃癌发生和发展。

目的:研究miR-27b-3p对乳腺癌细胞辐射抵抗的影响。方法:通过检索基因表达(GEO)数据库，筛选分析miR-27b-3p在正常乳腺组织和乳腺癌组织中的表达水平。利用实时荧光定量PCR技术分析其在不同乳腺癌细胞系中的表达水平。通过细胞克隆形成、免疫荧光和5-乙炔基-2′-脱氧尿苷(EDU)检测技术评价miR-27b-3p对乳腺癌细胞辐射抵抗作用。采用荧光素酶报告基因技术确定miR-27b-3p的靶基因PLK2，并在乳腺癌细胞中进一步验证miR-27b-3p的辐射抵抗作用。结果:与正常乳腺组织和细胞相比，miR-27b-3p在乳腺癌组织( t＝2.99， P<0.01)和乳腺癌细胞中表达水平显著上调( t＝21.21、32.88， P<0.05)。尤其在抗辐射细胞MCF-7R中升高更加明显( t＝25.63， P<0.05)。过表达miR-27b-3p增强了MCF-7细胞的克隆形成能力( t＝10.32， P<0.05)，且随着辐照剂量的增加，miR-27b-3p对MCF-7增殖能力的保护效应逐渐凸显( t＝8.77、8.26、8.03， P<0.05)；干扰miR-27b-3p则抑制MCF-7R细胞克隆形成数( t＝40.00， P<0.05)，且随着辐照剂量的增加，进一步削弱了MCF-7R细胞的增殖能力( t＝8.54、8.32、8.23， P<0.05)。报告基因实验结果表明，PLK2是miR-27b-3p的直接靶标。过表达PLK2抑制了miR-27b-3p介导的乳腺癌细胞辐射抵抗(MCF-7： t＝9.66， P<0.05；MCF-7R： t＝6.42， P<0.05)。 结论:miR-27b-3p可通过靶向PLK2提高乳腺癌细胞的辐射抗性。