目的:掌握克里米亚-刚果出血热病毒（CCHFV）核蛋白（NP）和糖蛋白（GP）片段的精细抗原表位谱分布，明确优势抗原表位在克里米亚-刚果出血热（CCHF）实验室检测中的价值。方法:2014—2021年在新疆大学生命科学院实验室将CCHFV YL04057株采用改良生物肽合成方法分段表达出由8个氨基酸组成的最小合成短肽，以CCHFV多克隆抗体或单克隆抗体14B7（IgM）或CCHFV阳性羊血清为抗体，用免疫印迹方法鉴定出NP和GP片段上具有抗原活性的最小抗原表位（BCE），并采用邻接法将获得的具有序列多态性的BCE与不同地区的CCHFV进行空间聚类，确定BCE组合方式与地理区域分布的相关性，探讨其在建立血清学诊断中的应用价值。采用原核表达质粒（pET-32a、pGEX-KG）和带有不完整谷胱甘肽（GST188）标签的原核表达质粒（pXXGST-ST-1）构建和表达NP片段上6个不同肽段长度的优势抗原表位，建立间接酶联免疫吸附测定（ELISA）检测方法，以经免疫荧光法（IFA）鉴定的CCHF羊血清为对照，统计分析不同肽段长度的抗原表位重组蛋白与IFA检测结果的特异度、敏感度和总符合率。结果:CCHFV NP和GP片段共有30个具有抗原活性的BCE，其中NP片段抗原表位集中的核心中间片段NP 2（aa 170~305）有6个BCE，两端的NP 1（aa 1~200）和NP 3（aa 286~482）有9个BCE；GP片段的Gc（aa 1~558）和Gn（aa 533~708）片段有14个BCE和1个包含15个氨基酸的长抗原肽（AP），NP片段BCE氨基酸序列的同源性为97.1%，GP片段对应的同源性为89.1%。在GP片段9个具有序列多态性的BCE中，由GnEc1、GnE2、GnE4、GcE3、GcE6和GcAP-4（Ap）6个组合BCE可将15株来自全球不同地区的CCHFV聚类成亚洲Ⅰ、亚洲Ⅱ、非洲Ⅰ、非洲Ⅱ和欧洲 5个地理类群。构建表达的PET-32a-NP（全长）、PGEX-KG-NP 2（aa 170~305）、pGEX-KG-NP 2-1（aa 235~275）、PGEX-KG-NP 2-1-1（aa 237~256）、pXXGST-1-NP 2-1-2（aa 250~265）和PGEX-KG-NP 2-1-3（aa 260~276）6个重组蛋白CCHFV NP兔多克隆抗血清（pAb）免疫印迹反应阳性，以33份经IFA CCHF检测的羊血清为参照，以NP 2和NP 2-1 2个片段构建的重组蛋白为抗原建立的间接ELISA检测方法检测敏感度、特异度和总符合率最好，敏感度分别为73.4%（11/15）和66.7%（10/15），特异度分别为100%（18/18）和94.4%（17/18），总符合率分别为87.9%（29/33）和81.8%（27/33）。 结论:CCHFV NP和GP上分布着数量较多的具有抗原免疫活性的BCE，其中，优势抗原表位在CCHF实验室血清学诊断中具有较高的应用价值。

目的:通过检测血清抗体滴度和杀菌抗体检测(SBA)评价重组H因子结合蛋白(factor H binding protein，fHBP)的免疫原性。方法:选择并合成fHBP序列，连接至pET43.1a质粒，转化大肠杆菌BL21(DE3)，表达两个亚家族的重组fHBP蛋白，fHBPA和fHBPB，经过纯化后免疫家兔和小鼠，通过ELISA和SBA试验检测免疫抗血清效价和B群脑膜炎球菌流行菌株的杀菌滴度。结果:fHBP免疫兔血清效价均大于2.0×10 6，免疫小鼠血清效价高于1.0×10 6。69株流行株SBA试验中fHBP免疫兔血清对41株A亚家族和20株B亚家族均有大于1∶128杀菌滴度，亚家族靶菌之间没有交叉保护作用。fHBPA小鼠血清对A亚家族流行株Nm210902、Nm211009、Nm450522平均滴度为1∶1 024、1∶608、1∶861，对Nm510703、Nm311304、Nm431002流行株的滴度为1∶234、1∶861、1∶430；fHBPB小鼠血清对B亚家族流行株Nm311302、Nm311113和Nm321114的杀菌滴度分别是1∶2 896、1∶1 878和1∶430。而fHBPA和fHBPB混合蛋白质免疫鼠血清Nm210902、Nm510703和Nm311302平均滴度分别1∶876、1∶274、1∶1858，对3株靶菌均存在有效杀菌。 结论:fHBP免疫抗血清效价均在1.0×10 6水平以上，对61株B群流行株的杀菌滴度大于1∶128，对69株B群脑膜炎球菌流行株有94.2%的保护效果。

目的:原核表达人腺病毒（HAdV）7型DNA结合蛋白（DBP），制备DBP蛋白多克隆抗体。方法:合成HAdV-7 DBP基因并克隆至pET30a载体，转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞，IPTG诱导进行原核表达。经镍离子金属螯合层析纯化后免疫家兔制备多克隆抗体，使用间接酶联免疫吸附试验（ELISA）测定该抗体效价；使用Western blotting方法与间接免疫荧光方法（IFA）检测抗体特异性。以rDBP包被ELISA反应板使用间接ELISA对HAdV感染儿童急性期血清中抗DBP蛋白IgM和IgG抗体进行检测。结果:成功构建HAdV-7 DBP原核表达载体，表达的重组DBP蛋白经镍柱亲和层析纯化后纯度>95%，间接ELISA方法测得制备的多克隆抗血清的抗体效价为1∶1 024 000，Western blotting方法和IFA方法显示该抗体具有较高的特异性，间接ELISA方法检测HAdV感染儿童 急性期血清中抗DBP蛋白IgM和IgG抗体的阳性率分别为50.0%（19/38）和63.2%（24/38）。结论:成功构建HAdV-7 DBP蛋白的原达表达载体，获得了HAdV-7型DBP重组蛋白和高效价的兔多克隆抗体。

目的 制备水痘-带状疱疹病毒(varicella-zoster virus,VZV)收获物,纯化后免疫日本大耳白兔,制备VZV抗血清,并进行各项检定.方法 将VZV Oka株(vOka)在人二倍体细胞2BS株中传代培养,病毒收获后经超速离心纯化,制备免疫原,与弗式佐剂混合后经背部多点注射免疫雌性日本大耳白兔5只,制备VZV抗血清.Western blot检测血清抗体的特异性;测定膜抗原荧光抗体(fluorescent antibody to membrane antigen,FAMA)效价和血清抗体中和效价,并对两种检测方法的结果进行相关性分析.利用抗体效价较高的血清对麻疹、腮腺炎和风疹病毒进行异种病毒干扰试验.结果 制备的VZV抗血清可特异性结合vOka和Oka-7S病毒收获物及gE和ORF7蛋白等多种VZV抗原;3免血清FAMA抗体效价可达1∶16 384,血清抗体中和效价达1∶256;根据Karl Pearson相关系数分析得出两种检测方法结果呈线性相关.异种病毒干扰试验中试验组与对照组病毒滴度差值均＜0.50 lgCCID50/mL,表明VZV抗血清对麻疹、腮腺炎和风疹病毒滴度均无干扰.结论 成功制备了特异性强,亲和力高的VZV抗血清,为VZV成分疫苗的检定奠定了基础.

目的 构建结核分枝杆菌Rv2626c蛋白的重组表达载体,在大肠埃希菌(Escherichia coli,E.coli)中表达、纯化后研究Rv2626c重组蛋白的抗原性.方法 将GenBank公布的结核分枝杆菌H37Rv株Rv2626c蛋白的氨基酸序列(登录号:CCP45424.1)按E.coli密码子偏好转换为对应的DNA序列,合成该DNA序列并克隆至pET24a(+)质粒上,构建pET24a(+)-Rv2626c重组质粒,转化至E.coli BL21(DE3)中,以不同的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl β-D-thio-galactopyranoside,IPTG)浓度、温度和时间条件下诱导表达Rv2626c蛋白,通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)和蛋白免疫印迹法(Western Blot)对Rv2626c重组蛋白进行鉴定.利用镍螯合亲和层析法纯化Rv2626c重组蛋白并将其免疫青紫蓝兔,制备抗Rv2626c抗血清,采用Western Blot和酶联免疫吸附法分别检测抗血清的特异性和效价.结果 pET24a(+)-Rv2626c重组质粒构建成功.SDS-PAGE检测显示:转入该重组质粒的E.coli经IPTG诱导后表达Rv2626c重组蛋白,分子量约14 500,大小与预期相符;Rv2626c重组蛋白的最佳诱导表达条件为31 ℃ 1.0 mmol/L IPTG诱导表达6h,目的蛋白主要以可溶性形式存在,与Western Blot检测结果一致.Rv2626c重组蛋白免疫青紫蓝兔获得的高免血清特异性良好,经酶联免疫吸附法测定该血清效价为1∶256 000.结论 在E.coli中成功表达结核分枝杆菌Rv2626c蛋白,且纯化的Rv2626c重组蛋白具有较好的纯度和抗原活性,为进一步揭示其生物学功能奠定基础.

目的:制备了PGEX-4T-3/Myo5a原核表达载体,并表达与纯化融合蛋白,制备其多克隆抗体.方法:通过PCR扩增Myo5a末端一个基因小片段,Bam HⅠ和XhoⅠ双酶切后,连接到原核载体pGEX-4T-3,制备原核表达载体PGEX-4T-3/Myo5a.鉴定后,在BL21菌中诱导表达蛋白并对重组蛋白进行纯化,重组蛋白PGEX-4T-3/Myo5a采用聚丙烯酰胺凝胶电泳和免疫印迹进行鉴定.采用融合蛋白免疫家兔,制备其抗血清,测定抗血清效价和特异性.结果:经鉴定后原核表达载体PGEX-4T-3/Myo5a制备成功,表达的重组蛋白相对分子量约为30 kD.免疫家兔后抗血清滴度为1∶128 000,免疫印迹和间接免疫荧光证明其特异性.结论:实验成功制备了PGEX-4T-3/Myo5a原核表达载体,融合蛋白具备了较高的免疫反应性,并得到了其多克隆抗体,为进一步探讨Myo5a的生物学意义做了铺垫.

目的:亮氨酸拉链转录因子1(LZTFL1)是一种与纤毛信号转导相关的蛋白质,关于其如何在信号转导中发挥作用以及作用机制目前尚不清楚.莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)是研究纤毛信号传导的模式生物,而目前对莱茵衣藻LZTFL1蛋白的研究甚少,尚未有相应的检测抗体,因此制备LZTFL1多克隆抗体用于后续实验研究.方法:采用RT-PCR技术从C.reinhardtii CC125中提取总RNA,扩增981bp的目的基因Lztfl1,插入到pET-28a(+)原核表达载体,成功构建pET-28a(+)-Lztfl1重组质粒,转入E.coli BL21(DE3)经IPTG诱导后成功表达6×His-LZTFL1融合蛋白,融合蛋白经亲和纯化后免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,最后采用间接ELISA法测得抗血清效价达到1∶512 000,经Westem blot对C.reinhardtii CC125检测具有较高特异性.结果:首次实现了莱茵衣藻LZTFL1蛋白的原核表达,制备出一支兔抗莱茵衣藻LZTFL1蛋白的多克隆抗体,为后续研究LZTFL1蛋白在莱茵衣藻中的结构功能及在纤毛信号转导中的相互作用奠定了基础.

为制备抗卡他莫拉菌(Moraxella catarrhalis,Mc)表面蛋白UspA1胞外结构域的多克隆抗体(PcAb),对UspA1蛋白进行生物信息学分析,获取胞外结构域中抗原表位最为丰富的肽段,找到其对应的基因序列并引入大肠杆菌偏好性密码子,对其优化后化学合成全基因序列.将该基因序列按常规方法克隆入表达载体pET-28a(+)后表达重组UspA1-His融合蛋白并纯化.以该纯化抗原免疫新西兰大白兔,经4次免疫后,用Protein A亲和层析柱从抗血清中纯化出抗UspA 1-His融合蛋白PcAbIgG.经免疫荧光法、酶联免疫吸附法及Western blotting鉴定,抗UspA1-His融合蛋白PcAb能特异性识别UspA1蛋白的表面暴露区.该多抗的制备为下一步建立卡他莫拉菌快速检测技术奠定了基础.

目的 采用非亲和纯化方法从人血清中制备获得高纯度转铁蛋白(T RF),并用此为免疫抗原免疫新西兰大白兔,验证T RF蛋白的免疫原性.方法 首先采用两步硫酸铵沉淀法从血清中粗纯 T RF蛋白,再用两步阴离子交换层析柱进行纯化,最终得到 TRF.结果 TRF蛋白的聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-PAGE)纯度与外购纯品相当,且高效液相色谱(HPLC)纯度达到96.8%,纯化回收率为78.6%.对于同一批TRF样品, T RF检测试剂盒(免疫法)测得的活性浓度与紫外分光光度计法测得的蛋白浓度比值(Rc)约为0.95,说明制备的T RF与免疫检测试剂盒中的T RF抗体具有良好的抗原反应性.最后用纯化样品免疫新西兰大白兔,经过4次免疫后的抗血清效价滴度达到1:128000,说明制备的 T RF具有良好的免疫原性.结论 制备的高纯度T RF具有良好的抗原反应性及免疫原性,可用于动物免疫以制备抗T RF抗体,为配制T RF检测试剂(免疫法)提供良好的原料基础.

目的:筛选兴义维蚋幼虫气管鳃发育早期特异表达的基因.方法:将发育成熟的1～7龄期的蚋幼虫气管鳃蛋白作为抗原免疫新西兰家兔,制备兴义维蚋气管鳃蛋白多克隆抗血清,用Western blot法分析气管鳃特异表达蛋白;以LC-MS/MS对气管鳃特异蛋白进行质谱分析,采用GO分析及手工检索FlyBase数据库分析蛋白组成.结果:发现63 kDa处存在整个幼虫期均表达的蛋白,对63～75 kDa蛋白进行质谱分析,发现具有几丁质结合特性的蛋白质Gasp和Cda4.结论:初步确定Gasp和Cda4基因可作为气管鳃早期发育特异表达候选基因.