目的:掌握克里米亚-刚果出血热病毒（CCHFV）核蛋白（NP）和糖蛋白（GP）片段的精细抗原表位谱分布，明确优势抗原表位在克里米亚-刚果出血热（CCHF）实验室检测中的价值。方法:2014—2021年在新疆大学生命科学院实验室将CCHFV YL04057株采用改良生物肽合成方法分段表达出由8个氨基酸组成的最小合成短肽，以CCHFV多克隆抗体或单克隆抗体14B7（IgM）或CCHFV阳性羊血清为抗体，用免疫印迹方法鉴定出NP和GP片段上具有抗原活性的最小抗原表位（BCE），并采用邻接法将获得的具有序列多态性的BCE与不同地区的CCHFV进行空间聚类，确定BCE组合方式与地理区域分布的相关性，探讨其在建立血清学诊断中的应用价值。采用原核表达质粒（pET-32a、pGEX-KG）和带有不完整谷胱甘肽（GST188）标签的原核表达质粒（pXXGST-ST-1）构建和表达NP片段上6个不同肽段长度的优势抗原表位，建立间接酶联免疫吸附测定（ELISA）检测方法，以经免疫荧光法（IFA）鉴定的CCHF羊血清为对照，统计分析不同肽段长度的抗原表位重组蛋白与IFA检测结果的特异度、敏感度和总符合率。结果:CCHFV NP和GP片段共有30个具有抗原活性的BCE，其中NP片段抗原表位集中的核心中间片段NP 2（aa 170~305）有6个BCE，两端的NP 1（aa 1~200）和NP 3（aa 286~482）有9个BCE；GP片段的Gc（aa 1~558）和Gn（aa 533~708）片段有14个BCE和1个包含15个氨基酸的长抗原肽（AP），NP片段BCE氨基酸序列的同源性为97.1%，GP片段对应的同源性为89.1%。在GP片段9个具有序列多态性的BCE中，由GnEc1、GnE2、GnE4、GcE3、GcE6和GcAP-4（Ap）6个组合BCE可将15株来自全球不同地区的CCHFV聚类成亚洲Ⅰ、亚洲Ⅱ、非洲Ⅰ、非洲Ⅱ和欧洲 5个地理类群。构建表达的PET-32a-NP（全长）、PGEX-KG-NP 2（aa 170~305）、pGEX-KG-NP 2-1（aa 235~275）、PGEX-KG-NP 2-1-1（aa 237~256）、pXXGST-1-NP 2-1-2（aa 250~265）和PGEX-KG-NP 2-1-3（aa 260~276）6个重组蛋白CCHFV NP兔多克隆抗血清（pAb）免疫印迹反应阳性，以33份经IFA CCHF检测的羊血清为参照，以NP 2和NP 2-1 2个片段构建的重组蛋白为抗原建立的间接ELISA检测方法检测敏感度、特异度和总符合率最好，敏感度分别为73.4%（11/15）和66.7%（10/15），特异度分别为100%（18/18）和94.4%（17/18），总符合率分别为87.9%（29/33）和81.8%（27/33）。 结论:CCHFV NP和GP上分布着数量较多的具有抗原免疫活性的BCE，其中，优势抗原表位在CCHF实验室血清学诊断中具有较高的应用价值。

目的:原核表达淋病奈瑟菌NGO2105蛋白的660 ~ 1 468肽段，制备并鉴定其多克隆抗体。方法:将pCold TF-NGO2105 660-1468 aa重组质粒转化至 E.coli BL21（DE3）菌中进行蛋白表达。包涵体蛋白经变性复性处理后纯化目的蛋白。目的蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗血清；采用ELISA法检测抗体效价，Western印迹分析抗体对淋病奈瑟菌中NGO2105蛋白的特异性，流式细胞仪分析抗血清与淋病奈瑟菌的亲和力，黏附抑制实验评估抗NGO2105 660-1468 aa抗体对淋病奈瑟菌对人宫颈上皮细胞ME-180细胞黏附作用的抑制能力。不同处理组间比较采用 t检验。 结果:NGO2105 660-1468 aa蛋白以包涵体的形式呈现，通过变复性和纯化后得到了可溶性NGO2105 660-1468 aa蛋白，以该蛋白免疫小鼠后抗血清的效价为5.12 × 10 6，流式细胞仪分析结果显示，该抗体能较好与淋病奈瑟菌的NGO2105 660-1468 aa片段结合。黏附抑制实验结果提示，相比未处理组的黏附率（100%），抗NGO2105 660-1468 aa抗体在20和40倍稀释时均能显著抑制淋病奈瑟菌的黏附作用（黏附率= 52.9%、79.2%； t = 8.40、5.29； P < 0.001、= 0.006），呈现一定的浓度梯度依赖。 结论:成功表达及纯化出NGO2105 660-1468 aa肽段蛋白，制备出高效价的多克隆抗体，该抗体与淋病奈瑟菌有较好的亲和力且有黏附抑制能力。

目的:原核表达人腺病毒（HAdV）7型DNA结合蛋白（DBP），制备DBP蛋白多克隆抗体。方法:合成HAdV-7 DBP基因并克隆至pET30a载体，转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞，IPTG诱导进行原核表达。经镍离子金属螯合层析纯化后免疫家兔制备多克隆抗体，使用间接酶联免疫吸附试验（ELISA）测定该抗体效价；使用Western blotting方法与间接免疫荧光方法（IFA）检测抗体特异性。以rDBP包被ELISA反应板使用间接ELISA对HAdV感染儿童急性期血清中抗DBP蛋白IgM和IgG抗体进行检测。结果:成功构建HAdV-7 DBP原核表达载体，表达的重组DBP蛋白经镍柱亲和层析纯化后纯度>95%，间接ELISA方法测得制备的多克隆抗血清的抗体效价为1∶1 024 000，Western blotting方法和IFA方法显示该抗体具有较高的特异性，间接ELISA方法检测HAdV感染儿童 急性期血清中抗DBP蛋白IgM和IgG抗体的阳性率分别为50.0%（19/38）和63.2%（24/38）。结论:成功构建HAdV-7 DBP蛋白的原达表达载体，获得了HAdV-7型DBP重组蛋白和高效价的兔多克隆抗体。

目的 建立检测蔬果及饮用水等样本中的氧乐果、辛硫磷、敌百虫、对硫磷等有机磷成分的胶体金免疫层析检测方法并研制检测试纸条.方法 N-羟基琥珀酰亚法合成有机磷人工抗原;制备乙酰胆碱酯酶抗原及纯化及其抗血清制备、纯化与标记;优化试纸条工作参数,并进行性能测试.结果 抗血清效价在1∶32～1∶64之间,蛋白含量约为2 mg/mL.纯化后的多克隆抗体在相对分子质量(Mr)25 000和55 000处出现目的条带,纯度较好;试纸条反应时间在5～10 min,样本检测限为200 ng/mL,特异性及准确性良好,试纸条有效期为6个月.结论 建立了简便快速检测多种有机磷成分的胶体金免疫层析检测方法,适合大量样本的现场初筛.

目的:制备了PGEX-4T-3/Myo5a原核表达载体,并表达与纯化融合蛋白,制备其多克隆抗体.方法:通过PCR扩增Myo5a末端一个基因小片段,Bam HⅠ和XhoⅠ双酶切后,连接到原核载体pGEX-4T-3,制备原核表达载体PGEX-4T-3/Myo5a.鉴定后,在BL21菌中诱导表达蛋白并对重组蛋白进行纯化,重组蛋白PGEX-4T-3/Myo5a采用聚丙烯酰胺凝胶电泳和免疫印迹进行鉴定.采用融合蛋白免疫家兔,制备其抗血清,测定抗血清效价和特异性.结果:经鉴定后原核表达载体PGEX-4T-3/Myo5a制备成功,表达的重组蛋白相对分子量约为30 kD.免疫家兔后抗血清滴度为1∶128 000,免疫印迹和间接免疫荧光证明其特异性.结论:实验成功制备了PGEX-4T-3/Myo5a原核表达载体,融合蛋白具备了较高的免疫反应性,并得到了其多克隆抗体,为进一步探讨Myo5a的生物学意义做了铺垫.

为深入研究黄颡鱼Tachysurus fulvidraco Cu稳态调控机制,从黄颡鱼cDNA中克隆获得了810和192 bp的ccs(Pfccs)和cox17(Pfcox17)基因编码序列,并成功构建了pET32a(+)-Pfccs和pET32a(+)-Pfcox17重组表达载体;转化重组质粒到E.coli Rosetta(DE3)感受态细胞中,以IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)作为诱导剂诱导表达,通过SDS-PAGE鉴定重组蛋白表达,发现PfCCS蛋白主要在沉淀中表达,PfCOX17蛋白主要在上清中表达;分别采用包涵体和亲和层析纯化的方法得到了纯度较高的重组PfCCS和PfCOX17蛋白;以纯化得到的PfCCS和PfCOX17蛋白免疫Balb/C小鼠3次,制备多克隆抗体.通过Western Blot鉴定了PfCCS和PfCOX17抗血清可以分别特异性识别重组PfCCS和PfCOX17蛋白,也可以分别特异性识别黄颡鱼内源性CCS和COX17蛋白.通过Western Blot对黄颡鱼CCS和COX17蛋白在鳃、心脏和肝脏中的分布情况进行检测,发现黄颡鱼CCS和COX17蛋白在肝脏中具有较高的表达水平,CCS蛋白在鳃中的表达水平最低,而COX17蛋白在鳃和心脏中的表达水平都很低.综上所述,研究成功制备了黄颡鱼CCS和COX17蛋白的多克隆抗体,为深入研究CCS和COX17蛋白在Cu转运中的作用及黄颡鱼Cu稳态调控机制奠定基础.

旨在构建人磷酯酰肌醇蛋白聚糖3(Glypican3,GPC3)原核蛋白,制备小鼠GPC3抗血清.扩增人GPC3基因cDNA的完整的开放阅读框,克隆至pET28a原核表达载体,在大肠杆菌BL21表达菌株中诱导表达磷酯酰肌醇蛋白聚糖融合蛋白,利用亲和层析的方法纯化his-融合蛋白,通过SDS-PAGE电泳检测蛋白的纯度,并测定蛋白含量;免疫Balb/c小鼠,制备抗血清.结果显示,成功制备了小鼠抗GPC3多克隆抗体,抗体滴度为1:51200,经Westem blot检查特异性良好.原核表达的重组人GPC3蛋白具有较好的免疫原性.

目的:亮氨酸拉链转录因子1(LZTFL1)是一种与纤毛信号转导相关的蛋白质,关于其如何在信号转导中发挥作用以及作用机制目前尚不清楚.莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)是研究纤毛信号传导的模式生物,而目前对莱茵衣藻LZTFL1蛋白的研究甚少,尚未有相应的检测抗体,因此制备LZTFL1多克隆抗体用于后续实验研究.方法:采用RT-PCR技术从C.reinhardtii CC125中提取总RNA,扩增981bp的目的基因Lztfl1,插入到pET-28a(+)原核表达载体,成功构建pET-28a(+)-Lztfl1重组质粒,转入E.coli BL21(DE3)经IPTG诱导后成功表达6×His-LZTFL1融合蛋白,融合蛋白经亲和纯化后免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,最后采用间接ELISA法测得抗血清效价达到1∶512 000,经Westem blot对C.reinhardtii CC125检测具有较高特异性.结果:首次实现了莱茵衣藻LZTFL1蛋白的原核表达,制备出一支兔抗莱茵衣藻LZTFL1蛋白的多克隆抗体,为后续研究LZTFL1蛋白在莱茵衣藻中的结构功能及在纤毛信号转导中的相互作用奠定了基础.

为制备抗卡他莫拉菌(Moraxella catarrhalis,Mc)表面蛋白UspA1胞外结构域的多克隆抗体(PcAb),对UspA1蛋白进行生物信息学分析,获取胞外结构域中抗原表位最为丰富的肽段,找到其对应的基因序列并引入大肠杆菌偏好性密码子,对其优化后化学合成全基因序列.将该基因序列按常规方法克隆入表达载体pET-28a(+)后表达重组UspA1-His融合蛋白并纯化.以该纯化抗原免疫新西兰大白兔,经4次免疫后,用Protein A亲和层析柱从抗血清中纯化出抗UspA 1-His融合蛋白PcAbIgG.经免疫荧光法、酶联免疫吸附法及Western blotting鉴定,抗UspA1-His融合蛋白PcAb能特异性识别UspA1蛋白的表面暴露区.该多抗的制备为下一步建立卡他莫拉菌快速检测技术奠定了基础.

目的 了解无荚膜不可分型流感嗜血杆菌(NTHi)临床菌株P6外膜蛋白(OMP6)编码基因(omp6)分布及其序列保守性,筛选并鉴定OMP6序列中优势T和B细胞(T-B)联合抗原表位及其免疫原性.方法 采用PCR扩增NTHi临床菌株全长omp6基因,T-A克隆后测序.采用生物信息学软件分析OMP6序列保守性与膜定位并预测其T-B联合抗原表位.采用噬菌体展示联合免疫印迹法和ELISA分别检测重组噬菌体PⅢ蛋白(rPⅢ)展示的OMP6中T-B联合抗原表位肽免疫原性和免疫反应性.结果 35株NTHi临床菌株均能检出omp6基因,其核苷酸和氨基酸序列相似性分别为98.3％～100％和99.3％～100％.OMP6为外膜表面蛋白,具有OMP6-2-25、OMP6-61-86和OMP6-98-126三个预测T-B联合抗原表位.Western Blot和ELISA结果显示,OMP6-2-25能与NTHi抗血清产生较强的杂交条带,96.9％(59/62)、69.4％(43/62)和74.2％ (46/62) NTHi感染患儿血清标本OMP6-2-25、OMP6-61-86和OMP6-98-126抗原表位肽抗体阳性.结论 OMP6是分布广泛且序列保守的NTHi跨膜蛋白,OMP6-2-25为OMP6优势T-B联合抗原表位,可作为NTHi多抗原肽疫苗的候选表位.