铁蛋白是普遍存在于各类有核生物、参与机体铁离子稳态调控的一类蛋白质,它可以自组装形成14 nm左右的中空笼状颗粒,常被作为药物和疫苗的递送载体.支原体铁蛋白的晶体结构显示,铁氧化活性中心和铁离子通道与其他物种存在结构上的差异.目前螺原体铁蛋白还未有相关研究.本研究发现,螺原体铁蛋白与包含支原体在内的其他物种铁蛋白均具有较低的同源性.利用大肠杆菌表达中华绒螯蟹螺原体铁蛋白(SeFer),经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后,蛋白能以可溶的形式表达于大肠杆菌细胞内.分别通过二乙氨基乙基(DEAE)弱阴离子交换层析、分子筛层析,获得高纯度的SeFer.在4℃和18℃,用坐滴气相扩散法对SeFer进行晶体筛选,该蛋白在多种条件下能生长晶体,通过同步辐射光源衍射,其晶体最好衍射至2.90 ?,属于I432空间群,收集的数据可用于后继结构解析.非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)、动态光散射(DLS)以及SeFer分子筛出峰位置显示,经大肠杆菌重组表达的SeFer相对分子质量为400 kD左右,粒径大小为15 nm左右,与理论值接近.利用Alphafold 2对SeFer进行结构预测,发现其具有与其他铁蛋白类似的二十面体球状结构,但是其铁氧化活性中心与支原体铁蛋白保守位点存在差异.本结果不仅为研究SeFer的晶体结构提供了基础,也为疫苗载体提供了新的候选.

本研究旨在建立一种灭活禽流感病毒原料液中完整病毒颗粒准确定量的方法.针对直接采用高效液相尺寸排阻色谱法(high performance size exclusion chromatography,HPSEC)检测灭活禽流感病毒原液存在杂质干扰的问题,首先以H5N8型抗原为对象,分别考察了聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)沉淀和离子交换色谱法(ion exchange chromatography,IEC)进行预处理.在优化条件下,经 DEAE FF阴离子交换层析纯化预处理,杂蛋白去除率为 86.87%,病毒血凝回收率为 100%.HPSEC分析预处理后的样品,8.5-10.0 min处色谱峰样品电泳检测显示主要为H5N8 病毒蛋白,动态光散射分析平均粒径为 127.7 nm,推测为完整病毒特征峰;在IEC预处理后的样品中加入抗体进行HPSEC检测,8.5-10.0 min处特征峰消失,显示IEC预处理有效去除了杂质干扰.通过将HPSEC与多角度激光散射技术(multi-angle laser scattering technique,MALLS)联用,可以准确获得样品中完整病毒颗粒的数量,且病毒颗粒数与色谱峰面积具有良好线性关系(R2=0.997).建立的IEC预处理-HPSEC-MALLS检测方法应用于其他亚型(H7N9)、批次和浓度的病毒原液中完整病毒颗粒数的准确检测,均具有良好适用性,且重复性好,相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)<5%,n=3.

目的:层析结合低温乙醇法制备静脉注射人免疫球蛋白(IVIG),检测制备过程中杂质去除效果及层析对制品质量的影响.方法:本实验系用健康人血浆,采用低温乙醇蛋白分离法分离纯化得到的组分II(以下简称FII)沉淀作为原料,经过一步阴离子交换层析制备IVIG(pH4),检测IVIG制品分子量大小分布、免疫球蛋白(Ig)A含量、IgG含量及IgG亚型分布、蛋白质二级结构,采用孔径为20 nm的纳滤膜过滤,对比分析低温乙醇蛋白分离法及联合阴离子交换纯化工艺制备的IVIG(pH4)制品的IgA,IgM去除效果及纳米膜的通量.结果:FII沉淀经5 倍注射用水溶解,搅拌2h后的IgG溶出率较高,阴离子交换层析结合低温乙醇法制备的IVIG(pH4)制品中IgA含量控制在100 μg·mL-1以内,提高了纳米膜(20 nm)病毒灭活的通量,与市售产品IgG亚型分布、二级结构一致,分子大小分布符合《中华人民共和国药典》规定.结论:阴离子交换层析可以降低产品中IgA,IgM等杂质的残留量,提高了纳米膜(20 nm)的通透性,且对IVIG制品关键质量无显著影响.

目的:E蛋白(Protein E,PE)是不可分型流感嗜血杆菌(Nontypeable Haemophilus influenza,NTHi)表面的一种纤溶酶原(plasminogen,Plg)受体,其C末端含有两个赖氨酸残基.NTHi可通过其表面的PE与Plg结合,从而利用机体的纤溶系统深层入侵宿主.基于脂蛋白(a)[Lipoprotein (a),Lp(a)]中载脂蛋白(a)[Apolipoprotein (a),Apo(a)]与Plg高度的同源性,拟证明Lp(a)是否会与重组表达的PE(rPE)结合.方法:原核表达并纯化rPE及敲除C末端两个赖氨酸残基的rPEAKK,密度梯度离心结合阴离子交换层析分离人血浆Lp(a),通过ELISA、Pull down、Western blot等方法研究rPE与Lp(a)的相互作用.结果:rPE与Lp(a)结合,但不与LDL结合,且rPEAKK与Lp(a)的结合能力明显低于rPE;赖氨酸类似物6-氨基乙酸(EACA)能有效抑制rPE与Lp(a)的结合;Lp(a)对rPE与Plg的结合具有微弱的抑制作用.结论:rPE能够与Lp(a)结合,其中rPE的C末端赖氨酸残基和Apo(a)的赖氨酸结合位点(lysine binding sites,LBS)是rPE与Lp(a)结合的主要位点.

白血病抑制因子(LIF)是一种在生物体内具有独特活性和重要调节作用因而广泛应用的多功能细胞因子.利用基因工程技术表达重组人白血病抑制因子(Recombinant human leukemia inhibitory factor,rhLIF)并进行包涵体的复性及纯化,将rhLI基因克隆到原核表达载体pET32a中,成功构建重组hLI基因工程菌,并研究该菌株发酵条件和纯化工艺.先将种子液进行发酵培养,诱导表达,收集诱导后的细胞;对细胞破碎,收集包涵体沉淀,洗涤包涵体;用6 mol/L盐酸胍变性重溶包涵体,镍离子亲和层析柱上直接复性及纯化,并用阴离子交换进一步纯化,复性率为75％,纯度达97％.结果显示基因序列与理论序列一致,SDS-PAGE分析结果表明其表达的外源蛋白质分子量与预期的目的蛋白质相对分子量大小相一致,均为35×103;Western blotting、MTT活性检测结果表明,此重组hLIF融合蛋白具有良好的抗原性和免疫原性.本研究成功建立了rhLIF原核表达、复性和纯化体系,可为进一步研究LIF生物学活性及产品开发提供试验基础.

目的 采用非亲和纯化方法从人血清中制备获得高纯度转铁蛋白(T RF),并用此为免疫抗原免疫新西兰大白兔,验证T RF蛋白的免疫原性.方法 首先采用两步硫酸铵沉淀法从血清中粗纯 T RF蛋白,再用两步阴离子交换层析柱进行纯化,最终得到 TRF.结果 TRF蛋白的聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-PAGE)纯度与外购纯品相当,且高效液相色谱(HPLC)纯度达到96.8%,纯化回收率为78.6%.对于同一批TRF样品, T RF检测试剂盒(免疫法)测得的活性浓度与紫外分光光度计法测得的蛋白浓度比值(Rc)约为0.95,说明制备的T RF与免疫检测试剂盒中的T RF抗体具有良好的抗原反应性.最后用纯化样品免疫新西兰大白兔,经过4次免疫后的抗血清效价滴度达到1:128000,说明制备的 T RF具有良好的免疫原性.结论 制备的高纯度T RF具有良好的抗原反应性及免疫原性,可用于动物免疫以制备抗T RF抗体,为配制T RF检测试剂(免疫法)提供良好的原料基础.

N-聚糖酶是一类广泛应用于糖蛋白的N-糖基化修饰研究中的去糖基化酶.本研究通过RT-PCR从水稻中克隆了一个高GC含量(69.48％)的N-聚糖酶基因(OsPNGase A,XM_015775832),通过无缝克隆技术构建酵母分泌型表达载体pPICZ(α)A-OsPNGase A,在毕赤酵母SMD1168H中进行诱导表达,发酵液经DEAE Sepharose阴离子交换层析和HisTrap HP金属离子螯合层析纯化,产量可达到12.3 mg/L,比活力为258 U/mg.SDS-PAGE结果显示,纯化的OsPNGase A为单一条带且与预期分子量一致.OsPNGase A能作用于水稻中重组表达的人转铁蛋白(TRF)、玉米中重组表达的鸡蛋抗生物素蛋白(Avidin)以及辣根过氧化物酶(HRP),并且对Avidin的酶切效果优于商业化的PNGase F.OsPNGase A反应的最适pH和温度分别为pH 6.0和40℃,在中性和碱性以及含有100 mmol/L还原剂β-ME和DTT的条件下仍具有活性.水稻OsPNGase A的成功表达为植物糖蛋白的研究提供一个新的工具酶,酵母分泌表达体系的建立为PNGaseA的大量制备奠定了基础.

构建人SAA1原核表达载体,建立SAA1蛋白大肠杆菌表达条件和纯化工艺,评价重组SAA1蛋白在制备免疫学检测标准物质中的应用前景.采用同源重组的方法构建表达载体,在N端加入6×His和SUMO标签帮助SAA1蛋白的可溶性表达和纯化;在小量体系中评价SUMO-SAA1蛋白的可溶性表达后,用镍亲和柱和阴离子交换层析方法纯化蛋白,用蛋白酶切除SUMO标签后再通过镍亲和柱层析方法获得高纯度人SAA1重组蛋白;用西门子N-Latex SAA试剂评价重组蛋白的免疫反应性和稳定性,并与SAA国际标准物质进行比较研究.结果表明SUMO-SAA1在大肠杆菌中大部分为可溶性表达且表达量高,产物纯度可达90％以上,稳定性良好并与SAA国际标准物质具有类似的免疫反应性.利用SUMO标签的助溶作用,成功在大肠杆菌中表达了人SAA1重组蛋白,该蛋白适合作为制备SAA1免疫检测的参考标准物质的原材料.

从大球盖菇Sr-01菌株液体发酵液中分离漆酶,研究温度、pH和金属离子对酶活的影响.采用硫酸铵分级沉淀、Q-Sepharose阴离子交换层析和Superdex 200凝胶过滤层析对大球盖菇漆酶进行分离纯化.以ABTS[2,2-连氮基-双-(3-乙基苯并二氢噻唑啉-6-磺酸)]为底物,分光光度法测定酶活.结果表明,纯化后的漆酶比活力为152.79 U/mg,回收率为35.8％.SDS-PAGE显示该漆酶为单体蛋白,相对分子质量约40 kD.该漆酶的最适反应温度和pH分别为35℃和4.0,Mg2+、Cu2+对酶活有激活作用,Fe2+、Cd2+、Hg2+则有显著抑制作用.在最优反应条件下,纯化后的漆酶比活力可达222.93 U/mg.

从镰刀菌Q7-31T燕麦秸秆诱导发酵的粗酶液中分离、纯化并鉴定金属蛋白酶.研究该蛋白酶的酶学特性,丰富和完善金属蛋白酶的基础资料;探究其在纤维素酶系降解纤维素过程中发挥的作用,旨在丰富和完善纤维素酶系降解机制.以燕麦秸秆为碳源诱导发酵镰刀菌Q7-31T,并在发酵第6天收酶.通过硫酸铵分级沉淀、Sephacryl S-100凝胶过滤层析和DEAE弱阴离子交换层析对粗酶液进行分离纯化得到金属蛋白酶,随后对其进行了酶学性质分析和串联质谱鉴定.结果显示,从镰刀菌Q7-31T菌株的粗酶液中分离得到一种蛋白酶FQME14,其相对分子质量为30 kD;串联质谱鉴定的结果表明FQME14属于M14家族;蛋白酶酶学性质研究表明:该蛋白酶的比酶活为2.85 U/mg,最适反应pH和温度分别为pH 7.0和40℃,在pH 5.0-pH 9.0的范围内具有很好的稳定性,蛋白酶在50℃以下稳定性很好,超过50℃酶活力降低.该蛋白酶对酪蛋白、卵清蛋白和牛血清白蛋白都有很高的降解能力.金属离子Mn2+和Co2+对酶活性有激活作用,Mg2+、Cu2+、Fe2+、K+、Ca2+和Na+对酶活性有不同程度的抑制作用.从镰刀菌Q7-31T粗酶液中分离纯化得到蛋白酶FQME14,并对其进行了酶学性质的研究和串联质谱鉴定,结果表明FQME14为M14家族蛋白酶,是一种新的金属蛋白酶.