目的 研究D-谷氨酸和D-丙氨酸营养缺陷型鼠伤寒沙门氏菌的安全性和免疫原性,探讨D-氨基酸营养缺陷株作为口服减毒活疫苗或载体的可行性.方法 通过聚合酶链式反应(PCR)扩增并测序进行基因型分析,同时利用生长曲线实验、扫描电镜和透射电镜观察菌株生长状态和形态,确认敲除相应基因后D-氨基酸营养缺陷型鼠伤寒沙门氏菌表型稳定;药敏试验探讨外源补充D-氨基酸后,营养缺陷株对作用于细胞壁的青霉素和氨苄青霉素的敏感性;安全性评价有设置不同免疫剂量攻毒,脏器病理切片,小鼠活体成像,菌株计数和粪便16s rRNA全长测序,以检测D-氨基酸营养缺陷型菌株的定植和侵袭能力;免疫小鼠测抗体滴度检测疫苗引起的免疫应答,免疫后攻毒测定D-氨基酸营养缺陷株的保护效力.结果 D-氨基酸营养缺陷型鼠伤寒沙门氏菌生长稳定,口服有效减毒,在小鼠体内停留时间缩短,激发的炎症反应较低.尤其是D-谷氨酸营养缺陷株,即使在外源补充D-谷氨酸的条件下耐药性也明显降低,既减少了对小鼠机体的损伤又能激发有效的保护性免疫应答.结论 D-谷氨酸营养缺陷型鼠伤寒沙门氏菌有希望作为减毒活疫苗或载体递送抗原,预防病原体感染.

结核分枝杆菌(MTB)引起的结核病是一种慢性呼吸道传染病,研制载体介导的ESAT-6疫苗是当前的热点之一,ESAT-6抗原是一种公认的疫苗分子.本研究概述了卡介苗、耻垢分支杆菌、母牛分支杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、格式链球菌、单核细胞增生性李斯特菌、根癌农杆菌、乳酸乳球菌、两歧双歧杆菌、毕赤酵母、流感病毒、高度减毒的牛痘病毒、腺病毒血清型5、慢病毒和昆虫杆状病毒等载体介导的结核分枝杆菌ESAT-6疫苗的研制现状.

目的 探讨高表达甲硫氨酸酶减毒沙门菌SGN1对鼻咽癌的抑制作用及其机制研究.方法 通过甲硫氨酸限制培养,检测对人鼻咽癌细胞HNE-2、5-8F和CNE-2细胞增殖、迁移能力、克隆形成率以及细胞周期凋亡的影响;将SGN1与鼻咽癌细胞HNE-2、5-8F和CNE-2共培养,观察其增殖情况;构建5-8F人鼻咽癌细胞系皮下移植瘤模型,观察SGN1对体内鼻咽癌移植瘤的抑制作用;结果 甲硫氨酸限制显著抑制鼻咽癌细胞的增殖、迁移能力、单克隆形成以及阻滞细胞周期G2/M期并诱导细胞发生凋亡.SGN1能抑制鼻咽癌细胞的增殖并诱导凋亡,体内实验结果表明SGN1治疗后,小鼠皮下移植瘤生长受到抑制(P＜0.05).结论 SGN1可促进鼻咽癌细胞发生凋亡且抑制肿瘤细胞迁移,为临床治疗提供一个新的治疗策略.

目的 探讨基于白细胞介素(IL)-24的减毒沙门菌载体SL7207/pBud-VP3-IL-24对胃癌细胞的靶向性及肿瘤免疫作用.方法 建立小鼠胃癌细胞荷瘤模型,将SL7207/pBud-VP3-IL-24(A组)、SL7207/pBud(B组)、生理盐水(C组)经口服饲喂胃癌荷瘤小鼠,分别采用组织匀浆菌落计数、RT-PCR分析及荧光蛋白定位检测减毒沙门菌株SL7207、apoptin-EGFP融合绿色荧光蛋白及IL-24基因在小鼠体内的分布,苏木精-伊红(HE)染色观察肿瘤组织病理变化,通过四甲基偶氮唑盐(MTT)法、乳酸脱氢酶(LDH)释放法及中性红试验检测淋巴细胞增殖反应、自然杀伤细胞(NK细胞)毒作用及腹腔巨噬细胞吞噬活性.结果 在A组治疗后7d,小鼠肿瘤组织发现有减毒沙门菌株SL7207;随着时间推移,肿瘤组织中细菌数量逐渐增多,第21天,肿瘤组织中细菌数量比其他组织明显增多(P＜0.05).病理切片提示胃癌组织细胞溶解坏死.同时,IL-24基因和apoptin-EGFP蛋白在肿瘤组织有所表达,RT-PCR定量显示IL-24基因在肿瘤组织较其他组织多(P＜0.05).MTT和LDH实验显示,A组淋巴细胞增殖(0.75±0.11)和NK细胞活性(0.38±0.06)％明显高于B、C组,差异有统计学意义(P＜0.05).中性红实验结果提示,A组小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能增强(0.49±0.10),差异有统计学意义(P＜0.05).结论 SL7 207/pBud-VP3-IL-24对胃癌组织具有靶向性,能在肿瘤组织优先表达其携带基因及蛋白,并通过增强机体非特异性免疫功能来调节抗肿瘤免疫.

目的:在小鼠体内观察卡介苗的锌离子依赖的金属蛋白酶-1 (Zinc metalloprotease-1, Zmp1) 对结核分枝杆菌抗原PPE68处理的影响.方法:68周龄BALB/c小鼠随机分为5组, 分别为p Bud CE4.1空质粒对照组 (n=7) 、表达PPE68抗原肽的p BudCE4.1-PPE68p质粒组 (n=9) 、表达PPE68抗原的p Bud CE4.1-PPE68质粒组 (n=9) 、PPE68抗原和Zmp1共表达的p Bud CE4.1-PPE68-Zmp1质粒组 (n=10) 及PPE68抗原肽和Zmp1共表达的p Bud CE4.1-PPE68p-Zmp1质粒组 (n=8) .各组质粒电转化减毒沙门菌株SL7207构建相应的重组沙门菌.以灌胃方式将各组沙门菌免疫小鼠3周.收集小鼠血液和肺肠灌洗液, 采用ELISA法测定血清中IFN-γ、IL-12含量及肺与肠道s Ig A的含量;分离培养脾细胞, 用CCK-8法检测脾淋巴细胞增殖情况.结果:与PPE68抗原组相比, PPE68和Zmp1共表达组的IFN-γ (117.29±16.86, P=0.034) 、IL-12 (40.46±7.11, P=0.0037) 、淋巴细胞刺激指数SI (3.30±0.49, P=0.004) 均降低;与PPE68抗原肽组相比, PPE68抗原肽和Zmp1共表达组相应因子含量下降不明显, IFN-γ (132.75±28.40, P=0.070) 、IL-12 (55.43±11.78, P=0.198) 、SI (4.70±1.57, P=0.124) .结论:卡介苗的Zmp1影响结核分枝杆菌抗原PPE68的处理过程, 这可能是影响BCG免疫效果的重要原因.

目的 探讨GLP-1重组减毒沙门菌治疗对2型糖尿病小鼠的Caveolin-1、胰岛β细胞自噬相关因子的影响.方法 将纳入的40只小鼠分为正常组、对照组、空载组及治疗组,每组各10只.正常组正常饲养,对照组、空载组及治疗组使用链脲佐菌素(STZ)造模;对照组及正常组采用生理盐水干预,空载组采用空载体重组减毒沙门菌干预,治疗组采用GLP-1重组减毒沙门菌干预;在造模前、造模成功后及治疗结束后进行眼眶取血,使用血糖仪检测血中血糖水平,治疗结束后检测小鼠Caveolin-1、胰岛β细胞自噬相关因子表达情况.结果 治疗组小鼠血糖水平治疗后显著低于对照组及空载组(P＜0.05);治疗组小鼠胰岛Caveolin-1水平治疗后显著高于对照组及空载组(P＜0.05),对照组及空载组Caveolin-1水平与治疗前比较差异无统计学意义(P＞0.05);治疗后治疗组小鼠胰岛Atg3、Atg12及Beclin1水平显著低于对照组及空载组(P＜0.05),对照组及空载组Atg3、Atg12及Beclin1水平较治疗前无明显差异(P＞0.05).结论 采用GLP-1重组减毒沙门菌治疗后可有效改善2型糖尿病小鼠Caveolin-1及胰岛β细胞自噬相关因子表达,有较广的应用价值.

目的 分析鸡白痢沙门菌减毒活疫苗候选株SKLZ△spiC的遗传稳定性.方法 将疫苗株SKLZ△spiC与其亲体株S06004进行体外混合培养、体内共同感染,同时将重组质粒pMD20-spiC电转化导入疫苗株SKLZ△spiC,连续传至20代后,进行PCR及测序鉴定.结果 在体外混合培养、体内混合感染条件下,疫苗株SKLZ△spiC均无法从野生株S06004获得靶基因spiC;疫苗株SKLZ△spiC无法从外源质粒获得靶基因spiC.结论 疫苗株SKLZ△spiC具有良好的遗传稳定性.

目的:观察质膜型唾液酸酶(human plasma membrane-associated sialidase,Neu3)对前列腺癌荷瘤小鼠恶病质的影响.方法:应用真核细胞转染技术,转染前列腺癌PC-3、LNCaP细胞.转染后,利用倒置显微镜观察细胞形态变化;利用MTT实验观察细胞增殖变化;划痕实验观察细胞迁移能力的变化.通过显微外科手术建立原位肿瘤模型,随机分为4组,Mock组、AS组、pGCsi-Scramble组及pGCsi-Neu3组,每组6只小鼠,利用减毒沙门氏菌作为运载体,监测Neu3对裸鼠进食量、体重等恶病质指标的影响;利用IL-6小鼠ELISA试剂盒检测小鼠血清IL-6.结果:PC-3细胞和LNCaP细胞转染pGCsi-Neu3质粒后细胞透光性下降,伪足减少,细胞增殖能力下降,迁移能力下降,与Mock组及pGCsi-Scramble组相比,有统计学意义(P<0.01).动态监测前列腺癌荷瘤小鼠体重和摄食量数据显示:Mock组、AS组和pGCsi-Scramble组,小鼠体重逐渐减轻,摄食量减小,试验结束时,与pGCsi-Neu3组相比体重、摄食量差异明显,有统计学意义(P<0.01).pGCsi-Neu3组小鼠血清IL-6水平明显低于Mock组、AS组和pGCsi-Scramble组,有统计学意义(P<0.01).结论:下调Neu3表达,在体内具有良好的延缓恶病质发生、发展作用,其可能机制是Neu3的表达水平下降抑制了前列腺癌PC-3、LNCaP细胞增殖和迁移,IL-6表达下降,食欲增加.Neu3可能成为治疗癌性恶病质新靶点.

目的 检测sseK2基因的缺失对鼠伤寒沙门菌生物学特性的影响,为探究该基因的功能及开发安全有效的鼠伤寒沙门菌活疫苗提供新思路.方法 首先通过重组自杀性质粒介导,两步筛选法敲除1047 bp sseK2基因并成功构建缺失株及其回复株,进而检测其生物学和免疫学特性.结果 PCR、双酶切及测序结果分析,证实构建了SL1344△sseK2缺失株及其回复株.生物学特性研究表明,缺失株SL1344△sseK2保留了亲本株SL1344的血清型1,4,[5],12:i:1,2,且能够稳定遗传缺失后的sseK2基因,生化特性和生长速度并未发生明显改变,但与亲本株SL1344相比,其毒力发生明显改变.缺失株SL1344△sseK2口服感染6周龄BALB/c小鼠的半数致死量(median lethal dose,LD50)为3.44×108菌落形成单位(colony-forming units,CFU),毒力较亲本株SL1344降低了1620倍.免疫保护效力试验显示,缺失株免疫17 d后对鼠伤寒沙门菌野生株攻毒小鼠的保护率为62.5％,小鼠免疫14 d后血清抗体IgG达到最高.回复株与亲本株生物学特性无显著性差异,基本回复到野生型水平.结论 成功构建了SL1344△sseK2基因缺失株,其遗传稳定,毒力明显降低,且具有较好的免疫原性,推测sseK2对SL1344的毒力具有重要的调节作用,为探究该基因的功能及评估其作为用于减毒活疫苗的候选株提供参考.

目的 评价鸡白痢沙门菌减毒活疫苗候选株SKLZ△spiC对非靶动物(鼠)的致病性.方法 采用鸡白痢沙门菌减毒活疫苗候选株SKLZ△spiC[1×107、1×109 CFU/(0.1 mL·只)]及鸡白痢沙门菌S06004(NalR)[1×107 CFU/(0.1 mL·只)],分别经肌肉注射和口服感染小鼠,同时设空白对照组(未感染).观察小鼠的临床症状、病理、体重、脏器内菌体载量、粪便排菌及脾脏细胞因子水平,分析鸡白痢沙门菌减毒疫苗候选株对小鼠的致病性.结果 与空白对照组比较,各组小鼠均未出现任何临床症状,肝脏、脾脏、盲肠病理观察均未见任何病变,体重变化差异无统计学意义(P＞0.05).与鸡白痢沙门菌S06004(NalR)感染组比较,减毒活疫苗候选株感染组小鼠肝脏、脾脏、盲肠内及小鼠粪便载菌量均降低.各感染组小鼠脾脏中炎性因子IL-1β、IFNγ、IL-12、IL-6表达量均较低,仅引起小鼠轻微短暂的炎症反应.结论 鸡白痢沙门菌减毒疫苗候选株SKL Z△spiC对非靶动物(鼠)无致病性,符合公共卫生安全要求.