利用对硝基-N-乙酰苯胺筛选培养基从海州湾海域海泥中筛选获得产几丁质脱乙酰酶细菌MCDA02.经过形态学、生理生化和16S rDNA序列分析初步鉴定该菌株为解角质素微杆菌.通过单因素优化和正交试验优化,得出最优发酵条件.在单因素优化基础上,利用正交试验优化获得菌株MCDA02最优发酵条件为发酵温度25℃,培养基起始pH7.0,装液量50 mL/250 mL,几丁质3％,发酵时间48 h.在此发酵条件下,菌株MCDA02发酵水平达到158.47 U/mL,是优化前的3.2倍.试验结果为菌株MCDA02几丁质脱乙酰酶的进一步研究奠定基础.

优化并全合成里氏木霉几丁质酶基因,在毕赤酵母中实现分泌表达.产物几丁质酶的蛋白浓度达0.17mg/ml,最适pH为5.6,最适温度为65℃,酶活为0.52U/ml.该酶在50℃及以下较稳定.利用该酶水解低脱乙酰度壳聚糖并对产物的组成及结构进行分析.超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱(ultra-performance liquid chromatography quadrupole time-of-flight mass spectrometry,UPLC-QTOF MS)检测及分析结果显示,酶解产物中包含至少41种聚合度2～18,不同脱乙酰度的壳寡糖组分;核磁共振(nuclear magnetic resonance,NMR)检测及分析结果显示,产物壳寡糖的还原端主要为N-乙酰氨基葡萄糖,非还原端则同时含有N-乙酰氨基葡萄糖及氨基葡萄糖.相关结果可为壳寡糖的结构与功能关系研究提供参考.

壳寡糖具有抗炎、抗肿瘤及激活植物免疫等一系列生物活性.与传统的高脱乙酰度壳寡糖相比,低脱乙酰度壳寡糖可能具有更高生物活性.表达热紫链霉菌几丁质酶基因并使用表达产物水解制备低脱乙酰度壳寡糖;优化并全基因合成热紫链霉菌几丁质酶基因,利用毕赤酵母进行分泌表达,对产物酶的性质进行鉴定;利用表达的几丁质酶水解制备低脱乙酰度壳寡糖,使用超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱(Ultra-performance liquid chromatography quadrupole time-of-flight mass spectrometry,UPLC-QTOF MS)对其组分进行分离及鉴定,使用核磁共振(Nuclear magnetic resonance,NMR)确定其末端结构特征.结果显示,表达的几丁质酶蛋白浓度为0.20 mg/mL,最适pH为5.6,最适温度为60℃,酶活为0.98 U/mL,该酶在80℃及以下时较稳定,该酶水解制备的低脱乙酰度壳寡糖中包含至少35种聚合度2-17、不同脱乙酰度的壳寡糖组分,这些组分的还原末端主要由N-乙酰氨基葡萄糖组成,非还原末端同时包含氨基葡萄糖及N-乙酰氨基葡萄糖.本研究表明毕赤酵母分泌表达的热紫链霉菌几丁质酶具有较好的热稳定性,具有应用于低脱乙酰度壳寡糖规模制备的潜力.

几丁质脱乙酰酶(Chitin deacetylase,CDA)是昆虫几丁质代谢酶系中的重要组分,是害虫防治的重要靶标.通过RT-PCR技术克隆得到编码甜菜夜蛾几丁质脱乙酰酶secda7基因(GenBank登录号为MG604929),该基因长1431 bp,包含开放阅读框长1134 bp,SeCDA7蛋白的预测分子量分别为43.156 kD.结构域分析显示,SeCDA7具有一个多聚糖乙酰基转移酶催化区,属于第Ⅴ类CDA蛋白.分别构建了原核和真核重组表达载体,利用大肠杆菌和Bac-to-Bac昆虫杆状病毒表达系统转染Sf9昆虫细胞,成功表达了SeCDA7蛋白,纯化SeCDA7蛋白并分析几丁质结合活性,结果表明SeCDA7蛋白具有几丁质结合活性;荧光定量PCR结果显示secda7基因主要在中肠组织表达.本研究实现了甜菜夜蛾几丁质脱乙酰酶基因secda7的外源表达,并鉴定出SeCDA7蛋白具有几丁质结合活性,为深入探究甜菜夜蛾几丁质脱乙酰酶的生理功能提供了理论依据.

几丁质是自然界中含量仅次于纤维素的第二大多糖,壳聚糖作为几丁质脱除乙酰基的衍生物,由于其较好的溶解性得到了广泛的应用.本综述通过搜集比对不同来源的多种脱乙酰酶蛋白序列,运用生物信息学方法对其催化活性中心结构域进行深入挖掘分析,阐明了多种脱乙酰酶的生物来源、催化机制和反应条件等方面的异同点.结果表明,目前研究的脱乙酰酶多来源于真菌和昆虫,大多属于CE4家族,具有NodB等催化活性中心,比较容易与聚合度>3的乙酰化低聚糖反应,不易催化难溶性多糖,且该类酶多在pH 8.0左右、40-70℃的环境下酶活达到最大,不同二价金属离子对不同酶的影响不同.最后,提出了从海洋宏基因组文库中快速特异地筛选新酶、分析酶解机理并进行分子改造等研究的新方向,旨为今后该领域科研人员研发高效、高特异性的脱乙酰酶提供了新思路.

为了研究来源于番木瓜(Carica papaya)的几丁质酶在毕赤酵母中异源表达、表征及水解产物,笔者重新设计了来源于番木瓜的几丁质酶基因序列,命名为cpchi19.将cpchi19构建到毕赤酵母表达载体pGBG1中得到重组菌,通过质粒构建、发酵表达、酶学性质研究及对低脱乙酰度壳聚糖酶解产物进行分析.该几丁质酶在毕赤酵母中表达量为0.18 mg/mL,酶活为0.32 U/mL;最适pH和温度分别为5.6和75℃;该酶在70℃及以下较稳定.超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱(UPLC-QTOF MS)分析发现,水解主要产物为聚合度2～20、不同脱乙酰度的38个壳寡糖组分.核磁共振(NMR)分析显示,部分乙酰化壳寡糖的还原末端主要为N-乙酰氨基葡萄糖,同时含少量氨基葡萄糖,而非还原末端则同时包含N-乙酰氨基葡萄糖及氨基葡萄糖.来源于番木瓜的几丁质酶在毕赤酵母中实现表达并成功制备低脱乙酰度壳寡糖,为该酶及其水解产物的应用提供了理论支撑.

[目的]茄二十八星瓢虫Henosepilachna vigintioctopunctata是茄科(Solanaceae)植物上的重要害虫.昆虫体内几丁质脱乙酰酶1(chitin deacetylase 1,CDA1)催化N-乙酰氨基-D-葡萄糖胺脱去乙酰基,促使几丁质转化为壳聚糖,控制昆虫体内几丁质纤维有序堆积,并维持角质层结构的完整性.抑制虫体中CDA1基因的表达会抑制壳聚糖的合成,影响昆虫表皮结构的形成,使昆虫不能正常发育而亡.[方法]利用RT-qPCR方法测定HvCDA1基因在茄二十八星瓢虫不同发育阶段(卵、1-4龄幼虫和预蛹)和4龄幼虫不同组织(表皮、脂肪体、中肠和马氏管)中的表达模式.通过饲喂茄二十八星瓢虫1龄幼虫不同浓度dsHvCDA1溶液浸泡处理1 min的茄子叶片后及直接饲喂4龄幼虫不同浓度dsHvCDA1溶液,探究沉默茄二十八星瓢虫HvCDA1基因对其幼虫存活和发育以及HvCDA1基因表达量的影响.[结果]发育表达谱结果表明,HvCDA1在茄二十八星瓢虫的各发育阶段均有表达,但在1龄末和2龄末幼虫中的表达量最高.组织表达谱结果显示,在茄二十八星瓢虫4龄幼虫的表皮中HvCDA1基因的表达量显著的高于其他组织中的.1龄幼虫取食50 ng/μL dsHvCDA1溶液浸泡处理的茄子叶片后,幼虫蜕皮后其枝刺不能直立,角质层不能正常形成,且出现取食障碍直至死亡;饲喂50,200和400 ng/μL dsHvCDA1溶液浸泡处理的茄子叶片后48 h时,死亡率分别高达84％,94％和100％.与对照组(饲喂dsGFP溶液浸泡处理的茄子叶片)相比,饲喂1龄幼虫50 ng/μL dsHvCDA1溶液浸泡处理的茄子叶片后48和96 h时,其HvCDA1基因的表达量分别下降了 38.63％和79.00％.另外,4龄幼虫单头饲喂50,200和400 ng dsHvCDA1溶液,可分别导致29％,40％和66％的幼虫化蛹后呈畸形且不能正常羽化.与对照组(饲喂200 ng/头dsGFP溶液)相比,饲喂4龄幼虫200 ng/头dsHvCDA1溶液后48和96 h时,其HvCDA1基因的表达量分别下降了 52.99％和70.09％.[结论]上述结果表明,HvCDA1基因在茄二十八星瓢虫的存活和发育中起重要作用.当该基因表达受阻,会负面影响茄二十八星瓢虫的蜕皮、化蛹以及羽化,最终死亡.本研究结果表明HvCDA1可作为1个潜在的防治二十八星瓢虫的RNAi靶标基因.