在热带地区种植的香蕉、番木瓜、甘蔗、木薯、天然橡胶、油棕等热带作物,是我国农业的重要组成部分,不仅为我们的日常生活和工农业生产提供了重要的原材料,而且为我国热带与亚热带地区的主要农业产量和经济增长做出了贡献.然而,这些作物的现代分子育种受其生物学特性和遗传复杂性的严重阻碍,多倍化、杂合性、无性繁殖、童期长和植株高大等问题导致热带作物的传统杂交育种周期长、难度大、进展慢.基因编辑技术的发展为热带作物育种带来了新途径和新机遇.CRISPR/Cas9系统介导的基因组编辑技术以其更高的靶向效率、多功能性和易用性,已被广泛应用于植物基因组编辑育种中.近年来,该技术在香蕉、木薯、天然橡胶、甘蔗等热带作物上也实现了广泛应用.本文介绍了基于CRISPR-Cas9系统的基因组编辑、CRISPR-Cas9在热带作物改良中的应用进展以及所面临的挑战和问题,同时对热带作物基因编辑育种方面提出建议,以期为后续研究提供思路,并为进一步开发应用该技术以有效改良热带作物的植物性状提供参考.

为了明确植物miR172家族成员的进化特性及其在不同组织部位的表达情况,该研究以芥蓝miR172a家族为例,通过芥蓝miR172a成熟体序列比对、前体(pre-miRNA)二级结构预测、系统发育进化树构建、靶基因预测及实时荧光定量等手段,对芥蓝miR172a和miR172b基因家族的进化特性及其在芥蓝不同组织部位中的表达规律进行分析.结果显示:(1)芥蓝miR172家族存在20个成熟体成员,通过比对发现20条序列都存在一个重叠区域,该区域中ACTAGATC 8个碱基高度保守,并且在芥蓝pre-miR172的3′和5′端均能形成成熟体.(2)mfold预测结果显示,miR172a家族5个前体成员的最小折叠自由能在-54.55～-78.60 kal/mol之间,均能自发形成典型、稳定的茎环二级结构.(3)系统发育进化树显示,芥蓝miR172a家族的前体成员具有一定的保守性和多样性,并与番木瓜pre-miR172a亲缘关系较近.(4)靶基因预测发现芥蓝miR172a共有13个不同靶标基因,多个成员也可以作用于相同靶标基因.(5)实时荧光定量PCR显示,芥蓝pre-miR172a和pre-miR172b家族不同成员在不同组织部位表达量差异显著,10个成员在9个组织部位中的表达各不相同.其中,芥蓝pre-miR172a-1、pre-miR172a-2、pre-miR172a-3和pre-miR172b在芥蓝荚中大量表达;pre-miR172b-5p和pre-miR172b-5p-2在芥蓝花中大量表达.研究表明,miR172在芥蓝花和荚的发育过程中起着重要的作用.

目的 研究番木瓜籽中苄基硫代葡萄糖苷(BG)对小鼠免疫活性的影响.方法 以制备得到的BG粗品为研究对象,研究其对小鼠体液免疫、非特异性免疫、脏器指数以及脏器组织形态的影响.结果 BG粗品能显著提高小鼠的胸腺指数、促进血清溶血素的生成以及增强腹腔巨噬细胞吞噬功能,而且对肝肾组织影响较小.结论 BG粗品具有较好地增强小鼠机体免疫的功能.

目的 研究番木瓜籽提取物对游离态白色念珠菌的抑制效果,并探讨对其相关菌丝特异性基因表达的影响.方法 采用微量稀释法测定番木瓜籽提取物对白色念珠菌标准株SC5314的最小抑菌浓度(MIC)与最小杀真菌浓度(MFC);采用荧光定量PCR法检测不同浓度的番木瓜籽提取物对白色念珠菌相关菌丝特异性基因Efg1、Als3与Ece1的表达水平.结果 番木瓜籽提取物对白色念珠菌的MIC为8μg/mL,MFC为8μg/mL;不同浓度下的番木瓜籽提取物能抑制白色念珠菌相关菌丝基因Efg1、Als3与Ece1的表达,在1μg/mL时,使其分别下调了1.7倍、2.1倍和0.20倍,2μg/mL时,分别下调了3.4倍、2.8倍和1.35倍.结论 番木瓜籽提取物能抑制白色念珠菌的生长,并能下调白色念珠菌相关菌丝特异性基因的表达.

为开发植物内生真菌这一微生物资源,采用组织分离法从番木瓜植株的叶片、果实和茎中分离内生真菌.通过黄酮类化合物显色反应、薄层层析法(TLC)、紫外光谱法(UV),对番木瓜内生真菌的次生代谢产物进行初步分析,筛选出1株产黄酮类物质的内生真菌菌株,并利用分生孢子形态特征和真菌内转录间隔区序列(Internal transcribed spacer,ITS)对该菌株进行分析鉴定.结果 表明,从番木瓜果实中分离获得编号为G41的内生真菌菌株可归类为青霉属橘青霉(Penicillium citrinum).研究证实番木瓜果实中存在可产黄酮类物质的内生真菌菌株,具有进一步开发利用的潜在价值.

长春花(Catharanthus roseus)可以产生多种萜类吲哚生物碱,其中包括多种天然的抗癌药物,但合成含量很低,茉莉酸信号通路可以调控这些萜类吲哚生物碱的生物合成,茉莉酸-异亮氨酸合成酶为茉莉酸信号通路中的关键元件.为了研究其功能,该文以长春花叶片为材料,分析了CrJAR1基因所编码的氨基酸序列,并进行原核表达.结果 表明:CrJAR1基因编码了585个氨基酸,该蛋白不存在跨膜区域,定位于细胞质中,且该蛋白不含有信号肽;进一步系统进化树分析表明,长春花CrJAR1与笋瓜和番木瓜的JAR1同源性最高;对二级、三级结构进行预测,发现CrJAR1蛋白主要由α-螺旋构成;同时,成功构建了pET-30b-CrJAR1重组表达质粒,并经IPTG诱导后在大肠杆菌BL21中异源表达,经16、37℃分别诱导至16 h后,均显示出最高的表达量.综上结果,对长春花中CrJAR1蛋白进行生物信息学分析,并成功在大肠杆菌中进行异源表达,这对体外该蛋白功能的研究具有深远影响,为调节茉莉酸信号通路甚至调控长春花中次级代谢产物的生物合成提供了指导.

全基因组重复与串联重复是发生基因重复的重要机制,也是基因组和遗传系统多样化的重要动力.LRR-RLK编码富含亮氨酸重复的类受体蛋白激酶,是被子植物进化史上发生大规模扩张而形成的多基因家族.拟南芥(Arabidopsis thaliana)AtLRR-RLK包含15个亚家族,AtLRR Ⅷ-2是其中发生串联重复比例最高的亚家族.通过分析拟南芥、杨树(Populus trichocarpa)、葡萄(Vitis vinifera)和番木瓜(Carica papaya)4种模式植物中LRR Ⅷ-2亚家族基因的扩张及差异保留情况,结果显示,LRR Ⅷ-2在杨树中的扩张程度最高,在拟南芥和葡萄中的扩张程度居中,但在番木瓜中发生丢失.拟南芥、杨树和葡萄LRR Ⅷ-2亚家族具有旁系同源基因对,但在番木瓜中未发现旁系同源基因.除杨树中的1对旁系同源基因外,4种模式植物中LRR Ⅷ-2亚家族的旁系和直系同源基因都受到较强的纯化选择作用.对LRR Ⅷ-2亚家族进化历史的深入分析有助于理解基因重复在植物进化中的作用和意义,可为预测同源基因功能及解析其它基因家族进化历史提供参考.

为了解miR167家族成员的分子特性及其可能互作的靶标在龙眼体胚发生早期的调控机制,采用生物信息学分析方法进行龙眼miR167基因家族序列分析、二级结构预测、分子进化树分析、靶基因预测及其靶标特异表达的FPKM值分析,并采用实时荧光定量PCR技术(quantitave real-time PCR,qPCR)检测miR167家族在体胚发生早期的转录水平.结果显示,龙眼miR167前体序列存在一个长为20 nt的重叠区域,miR167b的中间序列区域和3'端与此区域存在多个碱基差异;龙眼miR167前体成员均能形成茎环结构,且最小折叠自由能介于-79.95--46.90 Kal/mol之间;分子进化树显示龙眼miR167前体成员分别与番木瓜(Carica papaya)、番茄(Solanum lycopersicum)、高粱(Sorghum bicolor)和大豆(Glycine max)亲缘关系最近,miR167a、c、d、f在成熟体进化树中聚于同一支,靶标预测结果显示它们可能调控6个相同的靶基因,即E3泛素连接酶BIG BROTHER(BB)、AIRP2,MYB转录因子和生长素应答因子(ARF6、ARF8、ARF6-3),miR167b则单独分布于另一支中,并可能调控2个特异靶标,即赖氨酸特异性组蛋白去甲基化酶1(LSD1)和细胞周期素(cyclin-C1-2-like);qPCR结果显示dlo-miR167a、c、d的表达均呈上调趋势,dlo-miR167d、f在3个阶段的表达水平较低;FPKM值显示ARF6/8、BB在体胚发生早期的表达模式与dlo-miR167a、c、d趋于一致,与AIRP2呈负相关.本研究表明在体胚发生早期ARF6/8和BB可能不受龙眼miR167的靶向调控,miR167可能通过靶向AIRP2参与早期体胚发生的形态建成,提示龙眼miR167基因功能的协同性和独立性并存.

转基因番木瓜检测中,模板DNA的制备是关键一步.为了提高检测效率,建立快速制备番木瓜样品基因组DNA和PCR检测方法十分重要.建立了番木瓜基因组DNA的快速制备方法,包括样品准备、制备缓冲液匀浆和稀释上清.在完成不同番木瓜样品的基因组DNA快速制备后,对获得的DNA进行PCR检测验证.普通PCR验证结果显示,本方法制备的叶片和果肉基因组DNA溶液稀释5倍时,PCR扩增条带清晰,更高稀释倍数时,叶片基因组DNA扩增条带强于果肉基因组DNA;实时荧光PCR验证结果显示,叶片基因组DNA的PCR扩增效率位于合理区间.灵敏度测试结果表明,含量低至0.1％的叶片和果肉样品,内标准基因和外源基因特异性片段普通PCR和实时荧光PCR均能得到预期扩增,且重复性较好.本研究建立的番木瓜基因组DNA快速制备与PCR方法效果良好,体系稳定.

为了研究来源于番木瓜(Carica papaya)的几丁质酶在毕赤酵母中异源表达、表征及水解产物,笔者重新设计了来源于番木瓜的几丁质酶基因序列,命名为cpchi19.将cpchi19构建到毕赤酵母表达载体pGBG1中得到重组菌,通过质粒构建、发酵表达、酶学性质研究及对低脱乙酰度壳聚糖酶解产物进行分析.该几丁质酶在毕赤酵母中表达量为0.18 mg/mL,酶活为0.32 U/mL;最适pH和温度分别为5.6和75℃;该酶在70℃及以下较稳定.超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱(UPLC-QTOF MS)分析发现,水解主要产物为聚合度2～20、不同脱乙酰度的38个壳寡糖组分.核磁共振(NMR)分析显示,部分乙酰化壳寡糖的还原末端主要为N-乙酰氨基葡萄糖,同时含少量氨基葡萄糖,而非还原末端则同时包含N-乙酰氨基葡萄糖及氨基葡萄糖.来源于番木瓜的几丁质酶在毕赤酵母中实现表达并成功制备低脱乙酰度壳寡糖,为该酶及其水解产物的应用提供了理论支撑.