目的:层析结合低温乙醇法制备静脉注射人免疫球蛋白(IVIG),检测制备过程中杂质去除效果及层析对制品质量的影响.方法:本实验系用健康人血浆,采用低温乙醇蛋白分离法分离纯化得到的组分II(以下简称FII)沉淀作为原料,经过一步阴离子交换层析制备IVIG(pH4),检测IVIG制品分子量大小分布、免疫球蛋白(Ig)A含量、IgG含量及IgG亚型分布、蛋白质二级结构,采用孔径为20 nm的纳滤膜过滤,对比分析低温乙醇蛋白分离法及联合阴离子交换纯化工艺制备的IVIG(pH4)制品的IgA,IgM去除效果及纳米膜的通量.结果:FII沉淀经5 倍注射用水溶解,搅拌2h后的IgG溶出率较高,阴离子交换层析结合低温乙醇法制备的IVIG(pH4)制品中IgA含量控制在100 μg·mL-1以内,提高了纳米膜(20 nm)病毒灭活的通量,与市售产品IgG亚型分布、二级结构一致,分子大小分布符合《中华人民共和国药典》规定.结论:阴离子交换层析可以降低产品中IgA,IgM等杂质的残留量,提高了纳米膜(20 nm)的通透性,且对IVIG制品关键质量无显著影响.

目的 建立鹿茸和鹿角与其混淆品狍子角、坡鹿角、驯鹿角和驼鹿角的水溶性蛋白的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-polyacrylamide gel electrophoresis,Native-PAGE)和十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)鉴别方法,并对2种电泳方法进行比较.方法 采用Native-PAGE和SDS-PAGE两种电泳系统分别对不同产地鹿茸和鹿角与其混淆品水溶性蛋白的组成及其分子量分布范围进行比较研究.结果 在N-ative-PAGE图谱中,花鹿茸、马鹿茸、梅花鹿角和马鹿角均具有4条特征谱带,而混淆品狍子角、坡鹿角、驯鹿角和驼鹿角均具有1条特征谱带.正品组与混淆品组间特征谱带大小和位置有明显差异,但鹿茸和鹿角的电泳行为相似.在SDS-PAGE图谱中,花鹿茸、马鹿茸、梅花鹿角和马鹿角的特征谱带数目分别为4条、7条、3条和4条,而混淆品狍子角、坡鹿角、驯鹿角和驼鹿角均具有1条特征谱带,4种鹿茸和鹿角药材及其混淆品的特征谱带的大小和位置存在明显不同.结论 Native-PAGE法不能区别鹿茸与鹿角,但可区分它们与其混淆品药材.而SDS-PAGE法的图谱具有更多鉴别谱带,可明确区分鹿茸与鹿角及其混淆品药材,本研究为鹿茸和鹿角质量综合评价和控制方法提供了科学依据.

[目的]羧酸酯酶(carboxylesterase,COE)是昆虫体内一类重要的解毒酶,与昆虫的抗药性相关.本研究旨在对中华按蚊Anopheles sinensis羧酸酯酶Ae7(Asae7)进行初步晶体学研究,为解析AsAe7的空间结构及探讨其分子功能奠定基础.[方法]首先对Asae7进行生物信息学分析,然后进行分子克隆,并利用原核表达系统在体外对Asae7进行重组表达;结合Ni-NTA金属螯合层析和葡聚糖凝胶层析方法纯化融合表达蛋白;通过葡聚糖凝胶层析和化学交联结果分析AsAe7的聚合状态;采用坐滴气相扩散法对AsAe7进行结晶筛选.[结果]生物信息学分析表明,AsAe7是亲水性蛋白,分子量为61.053 kD,无跨膜区和信号肽;3D结构预测结果分析显示,AsAe7采取的是α/β-水解酶超家族折叠模式.多序列比对结果表明,在不同昆虫中Ae7蛋白具有高度保守性.分子克隆得到中华按蚊AsAe7的编码基因Asae7序列,大小为1 626 bp.成功构建重组质粒pET28a-Asae7;在大肠杆菌Escherichia coli中表达的融合蛋白AsAe7主要分布在上清中.通过镍柱亲和层析和凝胶过滤层析纯化出了高纯度且稳定的目的蛋白;通过凝胶过滤层析和化学交联获得纯化的AsAe7主要呈单体状态;同时通过晶体筛选获得了AsAe7的晶体.[结论]运用结晶学的方法初步获得了AsAe7的晶体,为后续解析AsAe7的晶体结构以及在原子分辨率水平上直观阐释AsAe7参与代谢抗性的分子机制奠定了基础.

目的 建立四引物扩增受阻突变体系-PCR(amplification refractory mutation system-PCR,ARMS-PCR)技术,检测河南地区慢性丙型病毒性肝炎(chronic hepatitis C,CHC)患者白细胞介素(interleukin,IL)-28B基因rs8099917位点单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)分布情况.方法 应用生物信息学软件设计IL-28B基因SNPrs8099917位点全长序列特异性四引物序列,建立ARMS-PCR技术;采集河南地区138例CHC患者外周血并提取DNA,行ARMS-PCR,PCR反应产物行体积分数1％琼脂糖凝胶电泳判定rs8099917位点基因型,并随机对20例患者标本中阳性条带的扩增产物进行直接测序确定基因型,评价ARMS-PCR的准确性.结果 ARMS-PCR成功建立;IL-28B基因rs8099917位点SNP基因型为T/T型(252 bp和182 bp)、G/G型(252 bp和131 bp)和T/G型(252 bp、182 bp和131 bp),电泳显示条带清晰,大小符合预期分子量,无非特异性条带扩增;138例CHC患者IL28B基因rs8099917位点SNP中T/T型105例(76.1％),G/G型4例(2.9％),T/G型29例(21.0％);以基因测序结果为标准,ARMS-PCR技术检测准确率为100％.结论 河南地区慢性丙型病毒性肝炎患者IL-28B基因rs8099917位点SNP基因型以T/T型为主,ARMS-PCR检测准确、简便经济、高效,适用于临床检测.

为深入研究三疣梭子蟹Toll受体的功能,在前期工作的基础上构建了PtToll-1胞外结构域原核表达载体,并成功获得其重组蛋白.将获得的重组蛋白免疫小鼠获得抗此重组蛋白免疫抗血清用于后续研究.SDS-PAGE结果表明,体外诱导表达重组蛋白rPt Toll-1以包涵体的形式出现在大肠杆菌裂解液的沉淀中,分子量大小约为87.18 kD;Western-Blot分析表明,小鼠抗血清能与rPt Toll-1特异性结合.利用免疫荧光及细胞免疫化学方法对三疣梭子蟹PtToll-1在消化道、肝胰腺、鳃、心脏和肌肉等组织及血淋巴细胞中的分布进行研究.此外成功构建PtToll-1完整蛋白的真核表达载体pEGFP-N2-Pt Toll-1,并转染HEK293T细胞研究其在哺乳动物细胞HEK293中的表达.组织免疫荧光结果显示,Pt Toll-1在三疣梭子蟹消化道、肝胰腺、鳃、心脏及肌肉等组织中均有分布,但在鳃及消化道的组织结构中表达较强;细胞免疫荧光及免疫化学结果均表明Pt Toll-1主要分布在血淋巴的细胞膜上;激光共聚焦显微技术观察发现,pEGFP-PtToll-1融合蛋白也主要在HEK-293T细胞膜上表达.研究结果将为三疣梭子蟹Toll受体蛋白的免疫学功能的研究奠定基础.

目的:合成有机聚合物聚乙二醇化聚十六烷基氰基丙烯酸酯(mPEG-PHDCA),制备载药mPEG-PHDCA纳米粒,并研究其体外释药行为.方法:采用Knoevenagel反应和阴离子聚合反应合成mPEG-PHDCA,通过核磁共振氢谱(1H-NMR)进行表征,凝胶渗透色谱(GPC)法测定重均分子量和多分散系数(PDI).以阿霉素为模型药,采用复乳-溶剂挥发法制备载阿霉素的mPEG-PHDCA纳米粒,透射电镜观察其微观形貌,粒径仪测定其粒径和Zeta电位.高效液相色谱法测定纳米粒中阿霉素的含量并计算载药量和包封率,透析袋法考察其体外释药特性,比较其与阿霉素溶液的体外释药效果.结果:经过1H-NMR和GPC表征,成功合成mPEG-PHDCA,重均分子量约为6000,PDI为1.13.所制载阿霉素的mPEG-PHDCA纳米粒呈圆球颗粒状,表面光滑、大小均匀、分布良好,无团聚现象,粒径、Zeta电位、载药量和包封率分别为(94.61±3.91)nm、(-11.68±0.83)mV、(2.17±0.67)％、(79.54±4.66)％(n=3).载阿霉素的mPEG-PHDCA纳米粒48 h的体外累积释药率达到85.38％,释药曲线符合Weibull方程(R2=0.9794);阿霉素溶液体外4 h已基本释药完全.结论:成功合成具有良好载药性能、生物相容性和缓释特性的mPEG-PHDCA,其有望成为新型纳米递药载体.

目的:UPLC分析不同产地荒漠肉苁蓉苯乙醇苷类成分,MALLS测定肉苁蓉粗多糖分子量分布,离子色谱测定单糖组成,全面比较不同产地荒漠肉苁蓉内在品质的差异,为荒漠肉苁蓉的综合评价提供方法依据和数据参考.方法:UPLC色谱条件:色谱柱:Waters Acquity UPLC(R) BEH C18(2.1mm×100 mm,1.7 μm);流动相:乙腈(A)-0.1％甲酸水(B),梯度洗脱条件:(～8 min,2％A;8～16 min,12％A;16～19 min,16％A;19～22 min,16％～22％A;22～25 min,19％ A;25～30 min,19％～25％ A;30～32 min,25％ A;32～35 min,25％～30％ A;35～38 min,30％～40％ A;38～40 min,40％～50％A.离子色谱分离条件:色谱柱:Carbo PacTMPA20(3mm×150 mm)Analytical;梯度洗脱条件:A为水,B为250 mmol·L-1的氢氧化钠,C为1 mol·L-1的醋酸钠;0～20 min,94％A,6％B,0C;20～20.1 min,89％A,6％ B,5％ C;20.1～35 min,74％ A,6％ B,20％ C;35.1～45 min,20％ A,80％ B,0 C;45.1～55 min,94％ A,6％ B,0 C.MALLS测定条件:色谱柱:TSK Gel G4000PWxl;流动相:0.1 mol·L-1氯化钠溶液;流速:0.5 mg·min-1;进样量:200μL;样品浓度:1 mg·mL-1.结果:通过对不同产地荒漠肉苁蓉UPLC图峰面积进行积分,得到5种苯乙醇苷类峰面积,并进行相对比较;MALLS检测得到不同产地荒漠肉苁蓉粗多糖的分子量及分布,同时离子色谱法检测到其均有7种单糖组成.结论:UPLC测定结果显示,不同产地荒漠肉苁蓉苯乙醇苷类成分相对含量差别较大,人工栽培肉苁蓉在秋季采收时含量较高;MALLS检测结果显示,不同产地荒漠肉苁蓉的多糖分子量大小、分布及单糖组成差异明显.

为了探讨鱼类Integrin-β的组织分布及其在病原刺激后的表达模式,本研究以中国南方主要海水养殖品种-红笛鲷为研究对象,根据实验室构建红笛鲷cDNA差减文库中的EST片段,设计引物,通过RACE技术得到红笛鲷Integrin-β基因的cDNA全长(GenBank登录号:MG792792,命名为Ls-Integrin-β),该基因全长3976bp,开放阅读框(ORF)包含2 409 bp碱基,编码802个氨基酸,理论分子量大小为88.99kD.氨基酸推导序列分析发现Ls-Integrin-芦具有整合素家族保守结构域,C端存在一个跨膜结构域.系统进化树分析红笛鲷与鰤Integrin-β相似度最高.Ls-Integrin-β在健康红笛鲷体内的多种组织均有表达,其中肌肉表达量最高,脑、体肾、皮肤其次,肠道表达量最低.哈氏弧菌刺激后,红笛鲷脾脏中Integrin-芦的表达在感染后6h显著性(p＜0.05)上调,在12 h达到顶峰.以上结果表明,Inte grin-β可能参与了宿主抵御病原入侵的免疫反应,为进一步了解红笛鲷抗菌免疫提供理论基础.

目的 分析在低温乙醇蛋白分离法基础上引入阴离子交换层析(anion exchange chromatography,AEX)纯化工艺处理,对静注人免疫球蛋白(pH 4)制品质量的影响.方法 检测并对比分析低温乙醇蛋白分离法及联合AEX纯化工艺制备的静注人免疫球蛋白(pH 4)制品分子量大小分布、抗补体活性(anticomplement activity,ACA)、抗-HBs效价、白喉抗体效价、IgA含量、抗体Fc段生物学活性、IgG亚型分布、N-糖基化类型、蛋白质二级结构和三级结构的异同.结果 在低温乙醇蛋白分离法基础上,引入AEX纯化工艺处理,可大幅度降低静注人免疫球蛋白(pH 4)制品中IgA含量;有利于去除制品中三级结构发生改变的蛋白质;未对制品其他质量指标产生显著影响.结论 在低温乙醇蛋白分离法基础上,引入AEX纯化工艺可提高静注人免疫球蛋白(pH 4)制品质量.

目的 评价水飞蓟蛋白安全性和抗氧化活性.方法 用碱溶酸沉的方法提取蛋白后,使用HPLC法测定水飞蓟蛋白的氨基酸组成及含量.采用限量法,对水飞蓟籽仁及水飞蓟蛋白进行经口急性毒性考察.采用D-半乳糖构建衰老小鼠模型进行水飞蓟蛋白的抗氧化研究.结果 测得提取出的水飞蓟蛋白分子量大小分布为19 kd、32 kd和40 kd,蛋白水解物中谷氨酸含量最高,达到了18.6％.经口急性毒性实验结果表明,水飞蓟籽仁及水飞蓟蛋白短期内大量口服无毒性.抗氧化研究表明水飞蓟蛋白能够提高胸腺指数、脾脏指数,恢复小鼠血清及肝脏中MDA及蛋白质羰基含量,降低SOD及GSH的活力.结论 水飞蓟蛋白所含氨基酸种类丰富,安全性较高且具有抗氧化活性.