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基于CRISPR技术构建发光噬菌体及其在大肠埃希菌鉴定中的应用
编辑人员丨5天前
目的:构建针对大肠埃希菌的重组发光噬菌体(HT7),并评估其对大肠埃希菌的鉴定能力。方法:首先通过基因工程构建小向导RNA表达质粒pCRISPR-sg(1~10)和PFN-1000同源重组质粒菌株,并用双层平板筛选切割效率最高的小向导RNA(sgRNA);采用同源重组与规律成簇的间隔短回文重复(CRISPR)系统联合介导的基因编辑技术,将Nanoluc萤光素酶基因整合入T7噬菌体10A基因下游的非编码区,并成功构建发光噬菌体HT7;通过噬菌斑实验和液体扩增实验评估HT7噬菌体与T7噬菌体生物特性差异;此外用2022年1月至2023年6月解放军总医院第一医学中心临床采集分离的51株大肠埃希菌、20株肺炎克雷伯菌、14株金黄色葡萄球菌、6株屎肠球菌、5株粪肠球菌、3株鲍曼不动杆菌和1株铜绿假单胞菌评估HT7噬菌体的检测专一性和检出限。结果:构建的10个CRISPR靶向切割系统中,sgRNA8靶标的切割效率最高,成斑效率为0.18;噬菌体经pCas9/pCRISPR/PFN-1000 3质粒系统3轮重组筛选后,PCR验证均为2 798 bp的重组噬菌体条带,说明成功构建了HT7噬菌体。重组噬菌体在裂解效率( P<0.001)、一步生长曲线( P=0.001)、感染复数( P=0.031)的生物特性分析中,均有显著差异,裂解暴发点和对数生长节点均延长了10 min,最佳感染复数为0.1;临床样本测试,可识别裂解6株大肠埃希菌,其余菌株均不裂解,4.5 h内可检出低于10 CFU/ml的病原菌。 结论:成功开发了一种高效的噬菌体基因编辑系统,并成功构建发光噬菌体HT7,该噬菌体在4.5 h内能特异性检测出低于10 CFU/ml的大肠埃希菌,且对其他菌株无裂解作用,显示出良好的检测专一性和低检出限。
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编辑人员丨5天前
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基于重组酶介导的等温扩增和CRISPR-Cas13a检测幽门螺杆菌的方法的建立
编辑人员丨5天前
目的:开发一种基于重组酶介导的等温扩增(RAA)和成簇的规律间隔短回文重复序列(CRISPR)及其相关蛋白(Cas13a)系统的幽门螺杆菌核酸检测体系。方法:选取2021—2022年于应急总医院收集的30株幽门螺杆菌以及大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、阴沟肠杆菌和肺炎克雷伯菌各2株。针对幽门螺杆菌UreC基因保守区序列,设计RAA-Cas13a 核酸检测体系所需的特异性引物及CRISPR RNA(crRNA)。再通过琼脂糖凝胶电泳筛选出产生非特异性产物最少的引物对,并应用Cas13a切割荧光探针产生的荧光强度筛选出切割效率最高的crRNA序列,构建了RAA-Cas13a核酸检测体系,通过检测梯度浓度稀释的幽门螺杆菌ATCC 43504基因组DNA以及5种不同的临床常见病原体基因组DNA,评价基于RAA-Cas13a核酸检测体系的最低检测限及特异性。通过RAA-Cas13a核酸检测体系与已建立的荧光定量聚合酶链式反应(qPCR)方法同时检测临床菌株,得到该方法与qPCR方法的一致性。采用双侧配对 t检验对两组间的荧光值进行比较, P<0.05为差异有统计学意义。 结果:建立的RAA-Cas13a核酸检测系统可以在1 h内检测出低至10拷贝/μl的靶标DNA( t=11.05, P<0.01),且与其他5种临床常见菌株无交叉反应。RAA-Cas13a方法与传统的qPCR方法具有良好的一致性,Kappa系数为1。 结论:建立了一种将RAA与CRISPR-Cas13a结合进行幽门螺杆菌检测的方法,可用于快速且灵敏的识别幽门螺杆菌感染。
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编辑人员丨5天前
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消化内镜下新型双极电刀的有效性及安全性动物实验评估
编辑人员丨5天前
目的:探讨一款消化内镜下新型双极电刀进行内镜黏膜下剥离术的安全性及有效性。方法:通过有限元分析方法对比新型双极电刀与传统单极电刀对肌肉组织热损伤区域的差异。离体动物实验分析二者对猪胃壁的纵向热损伤距离。活体动物实验比较二者行猪消化道黏膜下剥离术的整块切除率、切割效率等指标。结果:有限元模型表明,排除个体差异、手术操作因素的影响后,单极刀对肌肉组织热损伤区域的长、宽、深分别为双极刀的1.08倍、1.12倍和1.23倍。离体动物实验表明,相同功率下通电1 s,双极刀对猪胃壁的的纵向热损伤距离为(433.25±42.58)μm,小于单极刀的(898.03±111.59)μm( t=6.740, P=0.003)。活体动物实验中,两种电刀系统的黏膜整块切除率均是100.0%。双极刀的切割创面为(229.58±185.29)mm 2,所用切割时间为(164.37±96.27)s,单极刀的切割创面为(209.70±167.35)mm 2,所用切割时间为(162.65±69.97)s,差异均无统计学意义( P>0.05)。 结论:该新型双极电刀在模拟实验和动物实验中安全有效,尚需临床消化道手术的进一步证实。
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编辑人员丨5天前
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超声引导下勾刀腱鞘松解术治疗小儿狭窄性腱鞘炎
编辑人员丨5天前
目的:探讨B型超声引导下运用勾刀腱鞘松解术治疗小儿拇指狭窄性腱鞘炎的临床疗效。方法:收集2017年6月至2020年6月在苏州大学附属无锡九院收治的58例小儿拇指狭窄性腱鞘炎患儿的相关资料。其中,男33例,女25例,无拇指外伤史,术前X线摄片排除骨关节疾病。根据随机数字法,将患儿分成手术切开组(A组)及B型超声下勾刀切割组(B组)。A组患儿30例,男19例,女11例;年龄为(2.4±1.1)岁,患侧为左侧16例,右侧14例;B组患儿28例,男14例,女14例;年龄为(2.3±0.8)岁,患侧为左侧16例,右侧12例。A组患儿行腱鞘切开松解术,B组患儿行B型超声引导下勾刀腱鞘松解术。收集并对比观察两组患儿手术时间、术后疼痛评分、综合疗效及瘢痕情况。结果:两组患儿手术均顺利完成,B组患儿切口小,瘢痕程度轻,早期疼痛改善明显;切口长度在B组为(1.9±0.8) mm, A组为(12.5±1.4) mm,差异具有统计学意义( P<0.001);瘢痕情况评分在B组为(2.1±0.7)分,A组为(4.7±1.3)分,差异具有统计学意义( P<0.001);术后1 d的疼痛评分在B组为(1.5±0.5)分,A组为(2.7±0.7)分,差异具有统计学意义( P<0.001)。所有患儿均完成随访,两组患儿末次随访均无复发,疗效评定均为A级,治疗有效率为100%,术后复查B型超声均未见A1滑车处出现增生、粘连等情况,肌腱滑动情况良好。 结论:B型超声引导下勾刀腱鞘松解术治疗小儿拇指狭窄性腱鞘炎具有微创、瘢痕小、安全有效等优点,适合临床推广。
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编辑人员丨5天前
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"双稳定构型"椎弓及椎板钉固定法与改良Scott法治疗青少年症状性峡部裂的疗效比较
编辑人员丨5天前
目的:比较"双稳定构型"椎弓及椎板钉固定法与改良Scott法治疗青少年症状性腰椎峡部裂的疗效。方法:回顾性分析2017年1月至2021年10月中国人民解放军联勤保障部队第九〇〇医院骨二科因症状性腰椎峡部裂就诊并手术治疗的64例患者资料。男59例,女5例;年龄(24.9±5.2)岁;责任椎体:L 3 2例,L 4 10例,L 5 47例,L 4~L 5 5例;伴滑脱9例。依据手术方式不同分为"双稳定构型"椎弓及椎板钉固定法(观察组,31例)与改良Scott法(对照组,33例)。比较两组患者手术时间、术中出血量、术后引流量、峡部愈合率、内固定失效率,比较两组患者术后1、3个月、末次随访时腰痛视觉模拟评分(VAS)、日本骨科协会(JOA)评分、JOA评分优良率等,并观察并发症的发生情况。 结果:两组患者术前一般资料比较差异均无统计学意义( P>0.05),具有可比性。所有患者均获随访,观察组患者手术时间[(94.7±14.9)min]显著长于对照组[(84.4±16.4)min],差异有统计学意义( P=0.011);但两组患者术中出血量、术后引流量比较差异均无统计学意义( P>0.05)。观察组双侧峡部愈合率93.5%(29/31)显著高于对照组60.6%(20/33)、内固定失效率(0)显著低于对照组(12.1%,4/33),差异均有统计学意义( P<0.05)。所有患者术后1、3个月、末次随访时VAS评分均显著低于术前,JOA评分显著高于术前,差异均有统计学意义( P<0.05);末次随访时观察组患者VAS评分[0(0,1.0)分]显著低于对照组[1(0,2)分],JOA评分[(27.1±1.2)分]、JOA评分优良率93.5%(29/31)显著高于对照组的(25.7±2.1)分、75.8%(25/33),差异均有统计学意义( P<0.05)。对照组有4例患者随访中发现线缆切割出棘突导致内固定失效,失效率为12.1%,观察组未见内固定失效。 结论:"双稳定构型"椎弓及椎板钉固定法与改良Scott法均能不同程度缓解青少年症状性峡部裂的临床症状,但相比而言,"双稳定构型"椎弓及椎板钉固定法峡部愈合率更高,疗效更为确定。
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编辑人员丨5天前
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皮下内镜辅助切割吸引器与小切口修剪术治疗腋臭的比较
编辑人员丨5天前
目的:比较皮下内镜辅助切割吸引器与小切口修剪术治疗腋臭的效果与安全性。方法:收集2013年5月至2018年5月滨州医学院烟台附属医院整形美容科收治的腋臭患者,共71例(142侧)。38例(76侧)采用皮下内镜辅助切割吸引器切除腋下顶泌汗腺(内镜组),男14例,女24例,年龄18~45岁,平均24岁,病程1~15年,2级6例、3级32例;33例(66侧)采用小切口修剪术进行治疗(修剪组),男9例,女24例,年龄18~42岁,平均25岁,病程1~17年,2级5例、3级28例。内镜组于内镜直视下切割吸引器切除顶泌汗腺。修剪组翻转皮瓣,组织剪直视下修剪。依据Tung分级法进行疗效评价。对并发症情况、疗效和满意度采用卡方检验,对手术的平均时间采用独立样本 t检验,比较2组患者差异。 结果:2组患者均顺利完成手术。内镜组术后并发症发生率为3.95%(3/76),明显低于修剪组的25.76%(17/66),差异具有统计学意义( χ2=39.699, P<0.001)。内镜组手术时间为(58.212±4.897) min,较修剪组(54.079±6.096) min稍长,但是包扎时间、拆线时间和开始康复锻炼时间都明显较修剪组短,差异均具有统计学意义( P<0.05)。内镜组有效率为100%(75/75)明显高于修剪组的89.39%(59/66),差异具有统计学意义( χ2=8.479, P=0.004)。内镜组满意度为97.37%(74/76),明显高于修剪组满意度74.24%(49/66),差异具有统计学意义( χ2=33.102, P<0.001)。 结论:皮下内镜辅助切割吸引器比小切口修剪术治疗腋臭效果更佳、术后并发症少、康复快、满意度更高。
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编辑人员丨5天前
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玻璃体腔注射抗血管内皮生长因子药物治疗Coats病的前瞻性病例对照研究
编辑人员丨5天前
目的:观察传统激光光凝(以下简称为激光)、激光联合玻璃体腔注射抗血管内皮生长因子(VEGF)药物、单纯玻璃体腔注射抗VEGF药物治疗Coats病的疗效及安全性。方法:前瞻性病例对照研究。2016年12月至2019年11月于复旦大学附属眼耳鼻喉科医院眼科连续就诊且未经治疗的Coats病2B~3A2期患者60例60只眼纳入研究。根据治疗方式将患者分为激光组、联合组、注药组。激光组患眼初始治疗为单纯传统激光治疗;注药组患眼初始治疗为单纯玻璃体腔注射抗VEGF药物,每一个月1次,连续3个月;联合组患眼初始治疗为激光联合玻璃体腔注射抗VEGF药物,或抗VEGF药物治疗后1周内行激光治疗。随访时间>6个月,随访时均行最佳矫正视力(BCVA)、超广角眼底照相、荧光素眼底血管造影检查。对比观察3组间的治疗有效率、视网膜下液(SRF)、黄斑水肿、BCVA及并发症发生情况。结果:60例60只眼中,男性55例,女性5例;年龄(17.1±2.0)岁;均为单眼。2B、3A1、3A2期分别为26、23、11只眼。激光组、联合组、注药组各20例20只眼。注药组所有患眼初始治疗后,异常血管均无明显消退;SRF吸收、增加分别为4 (20.0%,4/20)、5 (25.0%,5/20)只眼。给予补充激光治疗16只眼,玻璃体切割手术(PPV)4只眼。激光治疗的16只眼中,治疗有效10只眼(50.0%,10/20 );治疗过程中发生玻璃体积血、纤维膜增生、并发性白内障分别为1、1、2只眼,均再给予PPV治疗;黄斑水肿反复、持续存在分别为4、1只眼。联合组患眼中,治疗有效11只眼(55.0%,11/20);治疗过程中出现SRF增多、纤维膜增生、并发性白内障分别为5、2、2只眼,均再次给予PPV治疗;黄斑水肿反复、持续存在各1只眼。激光组患眼中,治疗有效15只眼(75.0%,15/20 );治疗过程中出现大量玻璃体积血、纤维膜增生、并发性白内障分别为2、2、1只眼,均再次给予PPV治疗。结论:单纯抗VEGF药物治疗Coats病无效,需联合其他异常血管消融治疗。抗VEGF药物在Coats病治疗中,既可促进SRF的吸收,亦可能致其增加,应用需谨慎。
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编辑人员丨5天前
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采用不同风险切割值的唐氏综合征序贯筛查策略的卫生经济学评价
编辑人员丨5天前
目的:拟从卫生经济学角度,评价唐氏综合征序贯筛查策略作为产前诊断指征的适宜风险切割值。方法:依据文献或现场调研(产前咨询、筛查、诊断及妊娠终止所需的费用)设定参数,建立100万单胎妊娠孕妇理论模型。设定策略原则如下,策略Ⅰ:传统中孕期血清学三联筛查,风险切割值1/300(策略Ⅰ-1)或1/1 000(策略Ⅰ-2)行胎儿游离DNA(cell-free fetal DNA, cffDNA)检测,检测高风险者行产前诊断,即传统中孕期血清学三联筛查—cffDNA—产前诊断策略;策略Ⅱ:结合风险度先分流,高风险进行产前诊断,临界风险采用cffDNA,切割值自高而低分别为1/10(策略Ⅱ-1)、1/50(Ⅱ-2)、1/100(Ⅱ-3)、1/150(Ⅱ-4)、1/200(Ⅱ-5)、1/250(Ⅱ-6)、1/300(Ⅱ-7)。主要卫生经济学评价指标为增量成本效果分析,当增量成本费用较低并低于抚养1例患儿所需费用时,相应策略更具优势。次要指标为总费用、成本-效果分析、成本-效益分析,同时参考筛查效率。结果:(1)策略Ⅰ-1及Ⅰ-2可分别检出唐氏综合征1 921例和2 199例,低于策略Ⅱ(Ⅱ-1~Ⅱ-7:2 202~2 212例);漏诊且存活病例数分别为312例、100例,高于策略Ⅱ(Ⅱ-1~Ⅱ-7:98~90例)。策略Ⅰ-1总产前诊断病例数(2 081例)及每检出1例患儿需产前诊断病例数(1.1,2 081/1 921)最少、策略Ⅱ-7最多(37.2,82 385/2 212)。(2)卫生经济学评价中,策略Ⅰ-1总费用(92 889.6万元)、成本-效果(23.7万元)与效益/成本比值(4.90)最优,其次为策略Ⅱ-7(分别为95 738.0万元、37.1万元和3.11),策略Ⅰ-2最差(分别为104 088.3万元、40.4万元和2.85)。(3)将策略Ⅰ-1作为基线进行增量成本效果评价,策略Ⅰ-2增量成本最高(158.0万元),策略Ⅱ增量成本范围为153.5万元(Ⅱ-1)~125.9万元(Ⅱ-7),接近或低于抚养1例患儿费用(152万元)。(4)敏感性分析提示,cffDNA价格是决策的主要影响因素,当其价格降低至1 075元,策略Ⅱ-1增量成本效果比最低(75.7万元);继续降低至低于697元时,策略Ⅰ-2增量成本最低(少于52.3万元)。(5)敏感性分析发现,cffDNA接受率不影响增量成本相关结论,策略Ⅱ-7增量成本效果比低于其他策略及抚养1例患儿所需费用。产前诊断接受率降低至80%时,策略Ⅱ-7增量成本效果比最少,但增至166.9万元,高于抚养1例患儿费用。结论:cffDNA用于高风险人群策略(Ⅰ-1)产前诊断病例数少,除增量成本以外的卫生经济评价参数最优,但漏诊最多。以1/300(策略Ⅱ-7)为产前诊断切割值筛查效率较优、增量成本效果比最少,但产前诊断病例数增多。cffDNA价格是最主要的影响因素,当其降低至1 075、697元时,以1/10为切割值(策略Ⅱ-1),或"临界风险"人群全部采用cffDNA(策略Ⅰ-2),增量成本效果比最低,综合筛查效率成为最优策略。产前诊断接受率降低影响异常病例检出,同时增加增量成本,不利于出生缺陷预防工作开展。
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编辑人员丨5天前
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CRISPR/Cas9技术制备Hsf1基因敲除小鼠模型的应用研究
编辑人员丨5天前
目的:探讨运用CRISPR/Cas9基因编辑技术高效构建热休克因子1(heat shock factor 1,HSF1)基因敲除的小鼠模型,为小鼠原发骨肉瘤模型建立前期基础。方法:根据Hsf1基因结构的第9外显子选择相应的gRNA(guide RNA)并进行筛选,通过PCR扩增出sgRNA(small guide RNA)转录模版,得到4个上游引物。随后将sgRNA进行体外转录并通过TubeScreen平台筛选,筛选切割有效的sgRNA,从筛选结果中选取切割效率最高的sgRNA用于后续实验。运用PCR扩增出转录spCas9mRNA的模板,接着体外转录Cas9mRNA。将体外转录得到的sgRNA与Cas9mRNA一起注射入健康的C57BL/6小鼠受精卵内,剪取出生小鼠尾巴提取组织并进行PCR测序鉴定。选取F0代杂合子母鼠与野生型公鼠交配得到F1代子鼠,结合琼脂凝胶电泳和基因测序检测F1代鼠基因碱基的突变情况。选取F1代杂合子公鼠与F0代母鼠回交得到F2代子鼠,剪取鼠尾组织并测序,最终得到F2代纯合子敲基因小鼠。运用PCR观察sgRNA切割效率与鼠尾组织的测序,通过观察凝胶电泳结果来判断小鼠是否为杂合,同时利用snapgene软件进行基因序列比对判断碱基片段缺失。结果:经PCR扩增得到上游引物sgRNA-1primer-F、sgRNA-2primer-F、sgRNA-3primer-F、sgRNA-4primer-F与下游引物sgRNAprimer-R。经过sgRNA的体外转录和筛选,sgRNA-1, sgRNA-2和sgRNA-4切割效率高,被选取用于后续实验。将T7promoter添加到Cas9mRNA的5’端,运用PCR和体外转录试剂盒得到Cas9mRNA。把混合的Cas9-sgRNA溶液注入到小鼠受精卵中并进行培养。把培养至二细胞的受精卵注射到假孕母鼠的壶腹部,并成功获得F0代小鼠。通过琼脂凝胶电泳结果判断共得到F0代杂合子小鼠8只。将F0代3号杂合子母鼠与健康的野生型公鼠繁育后,结合PCR与测序比对,共得到F1代杂合子基因敲除小鼠3只。将三只F1代杂合子公鼠与F0代3号母鼠回交,得到F2代小鼠。通过对F2代小鼠电泳和测序比对的结果观察,证实7只小鼠缺失Hsf1碱基序列,电泳结果为突变型条带且不存在野生型条带,鉴定为纯合子;得到的F2代纯合子小鼠能够稳定繁育,结果证明本实验成功建立Hsf1基因敲除小鼠模型。结论:成功运用CRISPR/Cas9技术构建Hsf1基因敲除小鼠模型,稳定性强,可重复性高,为进一步研究Hsf1基因表达产物及原发骨肉瘤小鼠模型的建立奠定了基础。
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编辑人员丨5天前
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卷积神经网络在染色体分类中的应用研究
编辑人员丨5天前
目的:运用深度学习方法构建卷积神经网络(CNN)模型,实现中期染色体的自动分类,并评价模型染色体分类的准确率。方法:收集2013年1月至2019年7月在宁波市妇女儿童医院出生缺陷防治实验室接受染色体病检查者的3 300份样本。共纳入3 300×46张染色体图片,其中70%作为训练集,30%作为测试集,用于构建CNN模型,随后应用952张中期染色体图片对建立的模型的染色体计数及"切割+识别+排列+自动分析"的准确率进行评价。另取80张染色体图片资料,分别记录人和模型完成染色体分类的时间及准确率,综合评价模型的应用价值。结果:CNN模型的分裂相计数准确率为61.81%,单条染色体的"切割+识别+排列+自动分析"准确率为96.16%。CNN模型的分类耗时相对人工操作有了大幅度的提高,核型分析的准确率仅比遗传专科医师低3.58%。结论:基于CNN构建的染色体分类模型具有较高的分类能力,能够减轻遗传医师在核型分析的过程中手动切割分类染色体的劳动强度,提高工作效率,因而具有较好的应用前景。
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编辑人员丨5天前
