目的 鉴定远志Polygala tenuifolia bZIP基因,为远志抗逆性改良及次生代谢调控研究提供参考.方法 基于远志三代全长转录组数据库,采用生物信息学方法对远志bZIP基因家族成员进行鉴定和分析,并利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术分析其在不同组织及处理中的表达特性.结果 共鉴定得到27个含有特征性保守结构域的PtbZIP基因,编码蛋白质的氨基酸数量为143 aa(PtbZIP24)～846aa(PtbZIP9),相对分子质量范围为16201.52～92 932.30,等电点(pI)介于4.59～9.69,其中25个家族成员为不稳定蛋白,所有家族成员均为亲水性蛋白.蛋白二级结构主要由a螺旋和无规卷曲构成,均无信号肽,存在多种互作现象.进化树分析将27个PtbZIP蛋白分为A、B、C、D、F、G、I、S8个亚组,其中G亚组含有PtbZIP家族成员数量最多(共有8个),占总数的29.63％,没有PtbZIP基因被归类到E和K组.PtbZIP家族基因的密码子偏好性较弱,适应性较弱.表达模式分析显示,PtbZIP4/15在叶中的表达量最高,茎和根次之;PtbZIP8/24在茎中的表达量最高,叶和根次之;PtbZIP1/17的表达量为根＞叶＞茎;其余21个的表达模式均为根＞茎＞叶.qPCR结果表明,PtbZIP26基因受脱落酸、壳聚糖的诱导,且能显著应答干旱和盐胁迫.结论 鉴定了远志bZIP家族基因及其分子特征,为进一步研究PtbZIP基因在调控远志发育及次生代谢物合成方面的生物学功能奠定基础.

目的 探究中性粒细胞胞外捕获网(neutrophil extracellular traps,NETs)在骨肉瘤细胞增殖、迁移和侵袭中的作用及其相关机制.方法 纳入骨肉瘤患者和健康受试者各 20 例,通过ELISA检测血清中PAD4 和H3cit水平.提取两组人群外周血中性粒细胞,比较NETs形成差异.将NETs与骨肉瘤细胞MG63共孵育,期间加入DNA降解酶DNase Ⅰ,分为对照组、NETs组和NETs +DNase Ⅰ组.通过蛋白质印迹检测CCDC25 蛋白表达水平,CCK8 检测细胞增殖水平,Transwell 检测细胞迁移和侵袭水平.将 si-NC 和 si-CCDC25 转染至MG63,加入NETs共孵育,分为si-NC组和si-CCDC25 组,通过蛋白质印迹检测CCDC25 蛋白表达水平,CCK8 检测细胞增殖水平,Transwell检测细胞迁移和侵袭水平.结果 与健康受试者比较,骨肉瘤患者血清中 PAD4 和 H3cit 水平升高(P<0.05),NETs 形成能力增强.与对照组比较,NETs 组CCDC25 蛋白表达升高,细胞增殖、迁移和侵袭水平升高(P<0.05).与NETs组比较,NETs + DNase Ⅰ组CCDC25 蛋白表达降低,细胞增殖、迁移和侵袭水平降低(P<0.05).与 si-NC 组比较,si-CCDC25 组CCDC25 蛋白表达降低,细胞增殖、迁移和侵袭水平降低(P<0.05).结论 NETs通过释放的DNA激活骨肉瘤细胞CCDC25 表达,从而促进肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭.

目的:初步探索家鸡苹果酸脱氢酶 2 编码基因MDH2 的序列特征、组织表达及原核表达情况.方法:采用克隆技术与测序技术获取家鸡MDH2 基因互补脱氧核糖核酸(cDNA)全长,使用多种在线软件对其进行生物信息学分析,利用实时荧光定量聚合酶链式反应(PCR)技术检测该基因在不同组织中的表达情况,利用同源重组技术构建pET32a(+)-MDH2 表达载体,使用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导蛋白表达.结果:从新鲜家鸡砂囊内壁中成功克隆到 MDH2 基因,序列长度 1120 bp,其开放阅读框(ORF)为 1014 bp,编码 337 个氨基酸;MDH2 蛋白相对分子质量为 35.95 kDa,理论等电点 9.17,属于稳定碱性疏水性蛋白.MDH2 蛋白含 25 个磷酸化位点;二级结构主要包括α-螺旋、β-螺旋、无规则卷曲,无信号肽和跨膜结构域.MDH2 基因在心、肝、脾、肺、肾、砂囊内壁中都有表达,其中心、肾、砂囊内壁中表达量较高,pET32a(+)-MDH2 重组蛋白主要是以包涵体的形式存在.结论:MDH2 基因在家鸡体内广泛表达,但其在各组织/器官中表达趋势不同,提示其功能可能具有广泛性与多重性.

目的 通过比较不同来源的 H5N1甲型流感病毒 H5血凝素蛋白生物信息学,分析 H5N1甲型流感病毒H5血凝素蛋白的分子特征.方法 从Gene Bank基因数据库中获取15株H5N1甲型流感病毒H5血凝素蛋白的核苷酸和氨基酸序列,采用在线软件SignalP4.1预测信号肽,运用Clustal X,Bioedit等国际通用软件进行氨基酸和核苷酸的序列比对,计算核苷酸及氨基酸的同源性.在线软件 Antheprot分析二级结构.结果 15株 H5血凝素蛋白编码框架长约1707 bp(8株)/1704 bp(7株),编码含568个/567个氨基酸组成的多肽.H5血凝素氨基酸同源性为86.7%~99.2%,核苷酸同源性为85.6%~99.5%,H5血凝素蛋白富含潜在α螺旋(29%~35%)、β折叠(22%~25%)和卷曲结构(22%~25%)等二级结构.H5血凝素蛋白 aa1-aa16区域为潜在信号肽,血凝素蛋白 A1和 A2裂解序列为 aa323-aa333之间的 RERRRKKR↓GLF 序列,切割位点位于 R330和 G331之间;H5血凝素蛋白 A1亚单位存在4个高变区,分别是aa115-aa140(52.0%)、aa151-aa170(57.9%)、aa183-aa200(64.7%)和aa263-aa280(47.4%).但参与二硫键形成的10个半胱氨酸位点均未发生变异;构成受体结合域的 E186、K212、S217-K218、G221-Q222-S223-G224等位点较保守;构成T细胞和B细胞表位 aa141-155、aa206-223和 aa302-316等区域较保守.结论 H5N1甲型流感病毒 H5血凝素蛋白的受体结合域和免疫表位等重要功能结构域的序列比较保守稳定,在 A1和 A2裂解位点含高致病禽流感病毒分子特征相关的连续6个碱性氨基酸(R/K)序列.

目的:克隆光果甘草Glycyrrhiza glabra查尔酮合酶(chalcone synthase,CHS)基因并分析其基因多态性.方法:通过逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)从光果甘草主根中扩增得到CHS cDNA序列,测序并运用生物信息学软件对测序结果进行分析.结果:克隆得到19条长度为1 175 bp的光果甘草CHS cDNA序列,测序结果显示其一致性99.10％,存在81个变异位点,可分为17种单倍型;氨基酸序列分析显示,这19条cDNA序列共编码14种氨基酸序列类型,一致性99.34％,存在25个变异位点.生物信息学分析表明光果甘草CHS cDNA序列编码蛋白为稳定性亲水蛋白,平均相对分子质量42.6 kDa,等电点5.75～6.21,不含信号肽,无跨膜区,保守结构域包含1个查尔酮合酶超家族结构域,二级结构以α螺旋和无规卷曲为主.同源性分析显示,光果甘草CHS cDNA序列与乌拉尔甘草G.uralensis以及胀果甘草G.inflata在进化关系上最近,与小立碗藓Physcomitrella patens在进化关系上最远.结论:成功克隆并得到了光果甘草CHS cDNA序列,且这些序列编码区具有丰富的多态性.

目的 对细粒棘球蚴原头节的β4微管蛋白(EgTub4)基因进行生物信息学预测和分析,并探索该基因在大肠埃希菌中可溶性表达的最佳诱导条件,纯化目标蛋白. 方法 采用ProtParam、SMART、Predictprotein和Swiss-model软件分析EgTub4蛋白的理化性质和结构,采用SignalP4.1软件进行信号肽预测.提取细粒棘球蚴原头节的总RNA,并反转录成cDNA,PCR扩增EgTub4基因,构建原核重组表达载体pET28a-EgTub4、pET30a-EgTub4和pET32a-EgTub4,进行酶切鉴定,并测序.探索重组蛋白rEgTub4可溶性表达的最佳诱导条件[表达载体、诱导温度(T)、诱导剂(IPTG)浓度、诱导时间(t)和培养基类型].利用镍柱亲和层析法纯化重组蛋白,进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰氨凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹分析(Western blotting).结果 经生物信息学分析预测EgTub4蛋白理论等电点(pl)值为4.79,理论相对分子质量(Mr)为49 700;EgTub4不含信号肽,含有3个结构域,分别为微管蛋白GTPase结构域、C末端结构域和卷曲螺旋区.成功构建了重组质粒pET28a-EgTub4、pET30a-EgTub4和pET32a-EgTub4,经双酶切后,均可得到与目的基因相对分子质量相符的片段,测序正确.经Westem blotting分析,在表达质粒pET28a(+)、pET30a(+)和pET32a(+)中重组蛋白分别为Mr56 000、60 000、68 000.EgTub4基因在pET28a(+)中表达时不可溶,主要以包涵体形式存在,需要在变性条件下进行纯化.而在pET30a(+)和pET32a(+)中表达时均部分可溶,可以在非变性条件下进行纯化.综合考虑,本研究最终选择pET30a(+)作为EgTub4基因的表达载体.目标蛋白可溶性表达的优化条件为:T=25℃、[IPTG]=0.01 mmol/L、t=10h、2×YT培养液.最佳洗杂咪唑浓度为150 mmol/L,洗脱咪唑浓度为500 mmol/L.Western blotting分析结果显示,纯化的蛋白均能与β-微管蛋白抗体及His-Tag标签抗体反应,条带大小符合预期,约Mr 60 000. 结论 对EgTub4进行了生物信息学预测、分析和表达,得到该基因在大肠埃希菌中可溶性表达的最佳诱导条件,纯化目标蛋白.

亲环素是一个多基因家族,在植物生命活动中发挥着重要的作用.该研究以大花杓兰(Cypripedium macranthum)为材料,采用RT-PCR技术克隆到1个亲环素基因(CyP),并对其进行生物信息学分析.结果表明:大花杓兰CyP基因的开放阅读框序列为525 bp,命名为CmCyP(GenBank登录号为MH411125),编码174个氨基酸.预测CmCyP蛋白是一个位于细胞质、相对分子量约为18 kD、理论pI为8.73、无信号肽、跨膜结构域的亲水性蛋白质.磷酸化和糖基化位点预测分析发现,CmCyP蛋白存在18个潜在的磷酸化位点和2个潜在的糖基化位点.蛋白保守结构域预测分析发现,CmCyP蛋白包含一个高度保守的肽脯氨酰顺反异构酶结构域,属于单结构域亲环素.对二级结构进行预测分析发现,CmCyP蛋白中存在无规卷曲70个、延伸链56个、α-螺旋23个、β-折叠25个,这4种结构元件在三级结构中也有体现.系统进化树结果显示,大花杓兰CmCyP蛋白与铁皮石斛(Dendrobium catenatum)和万带兰(Vanda hybrid cultivar)的CyP蛋白的亲缘关系较近.该研究首次克隆了大花杓兰亲环素基因(CmCyP),为进一步探讨CmCyP基因的生物学功能奠定了基础.

目的 从家蝇的基因组库中筛选几丁质酶2 (MDCht2)基因,进行cDNA克隆及分子特性分析,对其时空表达模式进行初步探索. 方法 从家蝇基因组数据库中筛选MDCht2基因,以该基因的cDNA为模板进行PCR扩增,采用生物信息学相关软件对MDCht2基因及其编码蛋白质的基本理化性质、信号肽、蛋白质结构等进行分析,预测蛋白质功能.取家蝇不同生活史时期(卵,1龄幼虫,2龄幼虫,3龄幼虫,蛹,雌雄成虫)及3龄幼虫不同组织(体壁,气管,马氏管,唾液腺,脂肪体,肠道)标本,采用实时荧光定量PCR检测MDCht2基因表达情况. 结果 MDCht2基因cDNA全长1 932 bp,ORF框全长1 530 bp,编码509个氨基酸,理论相对分子质量为57.8×103,pI 5.67,属于亲水性的酸性蛋白,有信号肽,功能结构域位于第37～385位氨基酸间,无几丁质结合域.二级结构分析显示存在无规则卷曲(Cc),α螺旋(Hh),β折叠(Ee)3种类型.PCR扩增得到MDCht2基因长为1 530 bp的序列片段.实时荧光定量PCR检测家蝇MDCht2基因在蛹期的表达量较卵期上调6.477 01倍(P＜0.01),3龄幼虫表达量上调2.655 25倍(P＜0.01),1龄幼虫的表达量上调2.475 01倍(P＜0.05),表达水平排列顺序为蛹＞3龄幼虫＞1龄幼虫＞2龄幼虫＞卵＞雄成虫＞雌成虫.以体壁为参照,MDCht2基因家蝇气管中的表达量较高,气管中的表达量较体壁1.81.816 51倍(P＜0.01),表达水平为气管＞体壁＞唾液腺＞脂肪体＞肠道＞马氏管. 结论 成功克隆了家蝇的MDCht2基因并初步探索了其时空表达模式,即MDCht2基因在蛹期及气管组织高表达,为MDCht2的功能研究奠定了基础.

目的 构建结核分枝杆菌Rv1787基因的原核表达质粒进行体外表达,运用生物学信息分析方法分析Rv1787基因编码蛋白PPE25的生物学特征. 方法 以结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA为模板,PCR法扩增Rv1787基因,并与表达载体pET-32a构建重组质粒.原核表达重组质粒,SDS-PAGE分析表达产物并利用亲和层析的方法进行纯化.利用生物信息学软件ProtParam分析PPE25蛋白的理化性质,TMPRED和SignalP4.1 Service预测蛋白的跨膜区和信号肽,NPS@SOPMA和Swissmodel分别预测蛋白的二级结构和三级结构,Bepipred 1.0b server和DNAStar综合预测蛋白的B细胞抗原表位,综合运用SYFPEITHI、BIMAS、NetCTL、RANKPEP、NetMHC Ⅱ PAN 4.0 server预测蛋白的CTL细胞表位,综合运用SYFPEITHI、RANKPEP、NetMHC Ⅱ pan 3.2 server预测蛋白的Th细胞表位. 结果 pET-32a-Rv1787重组质粒测序结果与目的基因完全一致;SDS-PAGE分析表明,该融合蛋白以包涵体形式存在,相对分子质量为56×103,与预期大小相符.生物信息学分析结果显示,PPE25蛋白为疏水性蛋白,含多个跨膜结构域,无信号肽.二级结构主要由α-螺旋和无规则卷曲构成,结构比较松散.综合多种表位预测软件分析结果,筛选出3个优势B细胞抗原表位,7个CTL优势抗原表位和9个Th优势抗原表位. 结论 成功构建结核分枝杆菌PPE25蛋白编码基因Rv1787重组原核表达质粒,并利用生物信息学筛选出多个优势抗原表位,为进一步研究PPE25蛋白在结核病发生发展中的作用奠定了基础.

该研究从NCBI网站下载油棕全基因组序列信息,从The Arabidopsis Information Resource(TAIR)数据库中下载得到拟南芥WRKY转录因子序列,并在油棕基因组数据库中进行BLAST同源序列比对分析,通过NCBI在线工具CDD和PFAM数据库进行蛋白结构与分析,剔除无WRKY结构域的系列,利用生物信息学方法对油棕WRKY转录因子进行分析及功能预测.结果表明:(1)从油棕基因组数据库中发掘WRKY转录因子95个,该WRKY转录因子蛋白质所编码氨基酸大小为116～1303 bp,95个均为亲水性蛋白,总体为不稳定蛋白(EgWRKY25和EgWRKY56除外),60个蛋白以α-螺旋为主要二级结构元件,35个以无规卷曲为主要二级结构元件.(2)保守结构域系统进化树结果表明,油棕WRKY转录因子家族蛋白主要分为三大类,即I、Ⅱ和Ⅲ类,其中I类分为I C、I N亚类,Ⅱ类分为Ⅱa、Ⅱb、Ⅱc和Ⅱd亚类.(3)内含子和外显子结构显示,EgWRKY基因结构进化高度保守.以上结果为油棕WRKY转录因子的挖掘、功能分析及分子生物学研究奠定了基础,同时为分子育种和遗传改良提供了参考.