目的:探究放射性 125I粒子对Sprague Dawley(SD)大鼠肝泡型包虫以及裸鼠皮下泡型包虫的影响。 方法:20只裸鼠，体质量20～24 g，10周龄，皮下种植多房棘球蚴原头节后分组干预。将接种成功的16只裸鼠分为实验组( n＝8)、穿刺组( n＝4)和模型组( n＝4)。模型组无任何干预，穿刺组仅粒子穿刺针穿刺。实验组瘤体植入 125I粒子。14只无特定病原体雄性SD大鼠，体质量280～ 320 g，12周龄，建立肝泡球蚴病模型。随后分为干预组( n＝10)和对照组( n＝4)。干预组病灶植入 125I粒子。对照组仅开腹和关腹。两种模型动物均在干预45 d后处死。测定裸鼠瘤体大小变化。分别观察各组病灶泡型棘球蚴原头节活性和病理变化。 结果:干预第22、30、40天，实验组瘤体最大直径(10.7±5.2)mm、(10.9±5.0)mm、(8.5±4.3)mm，小于穿刺组(24.5±4.4)mm、(25.4±4.1)mm、(31.4±2.8)mm和模型组(22.5±7.3)mm、(25.0±5.4)mm、(26.7±6.3)mm，差异均有统计学意义(均 P<0.05)。实验组病灶中的原头节数量、活性低于穿刺组和模型组。光镜下，实验组泡型棘球蚴育囊及虫体结构明显被破坏，穿刺组和模型组泡型棘球蚴育囊的角质层和生发层结构清晰，含多个结构完整原头节。干预组与对照组SD大鼠的病理改变与裸鼠结果基本一致。 结论:放射性 125I粒子对泡球蚴原头节具有杀伤作用进而抑制泡型包虫病的进展。

目的 探究全反式维甲酸(ATRA)对多房棘球蚴原头节体外活性及生长的影响.方法 从保种沙鼠体内无菌剖取包囊,经过研磨、过滤、清洗获取活性良好的多房棘球蚴原头节.将原头节分为不同浓度ATRA组(10、25、50、100 μmol/L组,添加对应终浓度的ATRA)、二甲基亚砜(DMSO)组(DMSO终浓度为0.1％)和空白组(加入等量完全培养基),共干预9d,伊红染色后于显微镜下观察其活力和形态变化,计算原头节的存活率并绘制存活率曲线.将原头节与大鼠肝癌RH35细胞共培养5～6周,获得多房棘球蚴微囊泡后,使用不同终浓度ATRA(10、100 μmol/L)干预微囊泡9 d,显微镜下观察其活力和形态变化,同时设置DMSO组和空白组.干预原头节48h后,分别使用EdU细胞成像检测原头节EdU阳性率,使用半胱天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)试剂盒检测原头节中Caspase-3相对表达量;干预原头节24 h后,活性氧(ROS)检测试剂盒测定各组原头节ROS水平.两组样品的比较采用独立样本t检验,不同浓度ATRA组与DMSO组差异比较采用单因素方差分析(ANOVA).结果 10、25、50、100 μmol/L组中的死亡原头节体积明显缩小,可被伊红染液染成红色,随着时间延长和药物浓度升高出现轮廓模糊、透光性减弱、小钩脱落增多等.第4天时,10、25、50、100 μmol/L组原头节存活率分别为(87.33±4.90)％、(74.00±2.08)％、(64.33±2.03)％、(53.33±1.86)％,均低于 DMSO组[(95.67±1.20)％](F=98.41,P＜0.05);第 9 天时,10、25、50、100 μmol/L组原头节存活率仅为(62.00±2.64)％、(36.33±2.52)％、(7.67±1.53)％、0,均低于 DMSO 组[(85.67±2.08)％](F=1 154.34,P＜0.05).不同浓度的ATRA与多房棘球蚴微囊泡共培养9 d时,随ATRA浓度的升高,囊泡生长缓慢,囊内结构逐渐浑浊;空白组和DMSO组的微囊泡生发层和角质层结构完整.EdU细胞成像可见不同浓度ATRA组均呈现红色及蓝色荧光,10、25、50、100 μmol/L 组原头节的 EdU 阳性率分别为(51.63±3.09)％、(42.09±1.36)％、(38.46±0.65)％、(25.23±1.32)％,均低于DMSO组[(58.32±0.91)％](F=168.59,P＜0.05).10、25、50、100μmol/L组的 Caspase-3 活性分别为(19.23±2.27)、(26.27±3.45)、(43.29±2.10)、(72.80±1.40)U/L,呈浓度依赖性升高,均高于DMSO组[(14.22±0.52)U/L](F=404.08,P＜0.05).不同浓度ATRA组ROS均可见绿色荧光,强于DMSO组,10、25、50、100 μmol/L组荧光强度分别为260.96±2.52、282.10±7.40、330.30±12.46、346.10±6.39,均高于DMSO组(236.03±6.89)(F=80.53,P＜0.05).结论 ATRA对多房棘球蚴原头节体外活性及生长具有抑制作用,可诱导原头节内ROS显著积累,抑制原头节增殖活性、促进凋亡进程.

目的 探讨经肝门静脉感染的方式建立肝泡状棘球蚴小鼠模型的可行性,为临床实验研究提供良好的建模方法及依据.方法 本实验选用20只C57小鼠建立肝泡状棘球蚴模型.首先无菌处死腹部已经感染泡状棘球蚴的长爪沙鼠,将沙鼠腹腔剖开,取出泡球蚴组织,制备成浓度为20%的混悬液(20 000个原头节/mL),然后经肝门静脉注射200～300 μL混悬液到C57小鼠体内,实验过程中小鼠死于手术原因2只,死于麻醉原因2只,死亡率为20%;剩余16只小鼠中,4只未感染成功,作为未感染组,12只感染成功的小鼠作为感染组,感染建模成功率为75%.术后正常喂养小鼠10周,最后采用腹部超声成像、核磁共振成像及组织病理学观察小鼠肝脏病变情况.结果 未感染组小鼠肝脏大小形态及信号未见异常;感染组超声显示肝左叶可见明确病灶,病灶边界清晰,回声不均匀,可见高低混杂回声,内可见血流;核磁显示感染组肝左外叶可见明确病灶,边界清晰,病灶以稍长T2信号为主,并可见多发小囊泡影.未感染组病理结果为正常肝脏;感染组肝脏病灶内可观察到囊状泡以及纤维结构组织,并且囊泡周围的纤维成分较多,周边可以见到炎性反应带,内含炎性细胞、微血管及纤维组织.结论 经肝门静脉感染的方式,可以建立肝泡状棘球蚴模型,该方法简单易行,并且成功率相对较高.

目的 分析多房棘球蚴原头节感染小鼠外周血白细胞中髓源抑制性细胞(MDSC)及其亚型的比例动态变化,以及感染晚期小鼠血清中与MDSC增殖相关细胞因子的表达情况.方法 将24只BALB/c小鼠随机分为感染组和对照组,每组12只.感染组小鼠经腹腔注射1 200个原头节,对照组小鼠注射等量生理盐水.每组小鼠分别于感染后30、90和180 d随机各取3只,观察肝、脾组织形态学变化,并采集眼眶静脉丛外周血制备白细胞.外周血白细胞用外标抗体CD11b、Gr-1、Ly6G和Ly6C孵育后,流式细胞仪检测MDSC及其亚型多核MDSC(PMN-MDSC)和单核MDSC(M-MDSC)的占比.感染后180 d,采集感染组和对照组小鼠血清,ELISA检测白细胞介素6(IL-6)、IL-13、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的浓度.使用GraphPad Prism 9.0软件进行制图与统计学分析,两组间比较采用独立样本t检验.结果 感染多房棘球蚴原头节后30d,感染组小鼠肝组织出现囊泡,囊泡的体积随感染时间延长而增加;脾组织随感染时间延长逐渐肿大.流式细胞分析结果显示,感染后30、90和180 d,感染组小鼠外周血白细胞中MDSC占比分别为(13.2±2.4)％、(15.7±2.3)％和(41.3±4.0)％,对照组小鼠的占比分别为(12.4±3.2)％、(6.0±0.9)％和(22.3±1.1)％,感染后90和180 d感染组均高于对照组(t=3.949、4.682,P＜0.05、0.01);感染后30、90和180 d,感染组小鼠外周血白细胞中PMN-MDSC占比分别为(10.9±2.1)％、(12.5±2.4)％和(35.8±3.6)％,对照组小鼠的占比分别为(9.6±3.1)％、(4.5±0.6)％和(18.5±0.6)％,感染后 90 和 180 d 感染组均高于对照组(t=3.237、4.788,P＜0.05、0.01);感染后30、90和180d,感染组小鼠外周血白细胞中M-MDSC占比分别为(1.8±0.3)％、(1.1±0.1)％和(4.6±1.1)％,对照组小鼠的占比分别为(2.3±0.2)％、(0.5±0.1)％和(3.4±0.9)％,感染后 90d感染组高于对照组(t=3.246,P＜0.05).感染后180d,感染组小鼠血清中IL-6、IL-13、TNF-α和GM-CSF的浓度分别为(315.39±13.58)、(339.41±13.35)、(223.53±27.49)和(262.31±2.36)pg/ml,均高于对照组的(14.93±0.55)、(50.74±0.88)、(50.64±1.64)和(115.28±0.58)pg/ml(t=22.100、21.580、6.277、60.460,P＜0.01 或0.05).结论 感染多房棘球蚴原头节后,小鼠外周血白细胞中MDSC比例随时间延长而增加,以PMN-MDSC增加为主.感染晚期小鼠血清中IL-6、IL-13、TNF-α和GM-CSF浓度升高,可能促进MDSC的增殖与活化.

目的 探究细粒棘球蚴囊液外溢致敏过程中白细胞介素-1β(IL-1β)受体阻滞剂对肺损伤的治疗作用机制.方法 细粒棘球蚴包囊采集自新疆乌鲁木齐华凌屠宰场感染细粒棘球蚴的新鲜羊肝,收集包囊囊液,消化沉淀获得原头节,上清经内毒素处理获得致敏囊液.将24只小鼠随机分为对照组、致敏组、阻滞剂治疗组和阻滞剂预防组,每组6只.致敏组、阻滞剂治疗组和阻滞剂预防组小鼠分别腹腔注射约2 000个细粒棘球蚴原头节,对照组小鼠腹腔注射等体积生理盐水(约1ml).3个月后致敏组小鼠腹腔注射致敏囊液(0.1 ml/g体质量),阻滞剂治疗组小鼠先腹腔注射致敏囊液、15 min后尾静脉注射IL-1β受体阻滞剂(4 μg/g体质量),阻滞剂预防组小鼠先尾静脉注射阻滞剂、15 min后腹腔注射致敏囊液,对照组小鼠腹腔注射等体积生理盐水.取小鼠肺组织,制备石蜡切片后苏木精-伊红(HE)染色,显微镜下观察肺组织的炎症损伤情况.提取小鼠肺组织总RNA,qRT-PCR检测肿瘤坏死因子α(TNF-α)、IL-6、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-8(caspase-8)、磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)、蛋白激酶B(Akt)、核因子-κB(NF-κB)的mRNA相对转录水平.提取小鼠肺组织蛋白,以β肌动蛋白(β-actin)为内参,蛋白质免疫印迹(Western blotting)检测PI3K、Akt、NF-κB的蛋白相对表达水平.应用GraphPad Prism软件对数据进行统计学分析,组间比较采用单因子方差分析.结果 HE染色结果显示,致敏组小鼠肺组织局部充血,充血部位周围炎症细胞游出、淋巴细胞聚集;阻滞剂治疗组、阻滞剂预防组和对照组肺组织均未见明显炎症反应.qRT-PCR结果显示,对照组小鼠肺组织中IL-6、TNF-α、caspase-8、PI3K、Akt和NF-κB的 mRNA 相对转录水平分别为 1.057±0.363、1.020±0.217、1.004±0.097、1.000±0.031、1.035±0.312、1.029±0.304,致敏组分别为 2.013±0.514、2.189±0.194、6.433±0.340、1.594±0.117、2.902±0.181、1.342±0.146,阻滞剂治疗组分别为 1.243±0.279、1.268±0.225、0.869±0.172、1.103±0.180、1.371±0.199、1.008±0.202,阻滞剂预防组分别为 1.223±0.358、0.970±0.303、0.932±0.298、0.825±0.404、1.421±0.137、1.083±0.222;致敏组均高于对照组(t=3.481、2.759、37.640、2.237、12.670、2.274,均P＜0.05),阻滞剂治疗组和阻滞剂预防组均低于致敏组(t=3.221、7.593、35.240、5.610、13.920、3.287,3.088、8.299、28.610、4.475、15.930、2.390,均P＜0.05).Western blotting结果显示,对照组小鼠肺组织中PI3K、Akt和NF-κB的蛋白相对表达水平分别为0.516±0.075、0.638±0.103、0.198±0.086,致敏组分别为 0.831±0.061、0.917±0.069、0.784±0.120,阻滞剂治疗组分别为 0.535±0.108、0.612±0.206、0.247±0.145,阻滞剂预防组分别为 0.526±0.117、0.565±0.087、0.154±0.031;致敏组均高于对照组(t=5.650、3.901、6.871,均P＜0.05),阻滞剂治疗组和阻滞剂预防组均低于致敏组(t=4.142、2.434、4.945,4.013、5.477、8.821,均P＜0.05).结论 IL-1β受体阻滞剂在细粒棘球蚴囊液引起的过敏反应中能够通过抑制PI3K/Akt/NF-κB通路,降低肺部炎症反应,对肺损伤具有治疗作用.

目的 评价抗寄生虫中药水提物和有机溶剂粗提物体外对细粒棘球蚴的作用效果.方法 从感染绵羊肝脏细粒棘球蚴包囊中分离原头节,体外培养24h后,取活性大于95％的原头节(100 μl,约100个)加入96孔板,分别加入终浓度为0.8 mg/ml(低浓度组)、1.6 mg/ml(中浓度组)、3.2 mg/ml(高浓度组)的鸦胆子、苦楝皮、辣蓼、石榴皮、使君子、槟榔、贯众、鱼藤、马蔺子、五倍子和仙鹤草等11种抗寄生虫中药的水提物,体外作用72 h后,伊红染色法检测原头节活性,倒置显微镜观察下观察原头节的形态,计算死亡率;同时设相同浓度的阿苯达唑组和空白对照组.从具有体外抗原头节作用的中药中提取黄酮、多糖、皂苷和生物碱等粗提物,分别以终浓度1.00 mg/ml体外作用于原头节72 h后,观察原头节形态,计算死亡率;同时设空白对照组.对体外抗原头节效果明显的粗提物进行液相色谱与串联质谱联用分析.组间比较采用单因素ANOVA分析,两两比较采用LSD-t检验.结果 中药水提物作用72h后,鸦胆子、苦楝皮、辣蓼水提物高浓度组原头节边缘模糊,结构松散,基质溶解;其余8种中药水提物高浓度组原头节形态正常,各部分结构清晰;阿苯达唑组原头节生发层有轻微损伤;空白对照组原头节形态正常.体外培养72 h后,鸦胆子、苦楝皮和辣蓼水提物高浓度组原头节的死亡率分别为(99.63±0.57)％、(90.89±1.10)％和(51.93±0.60)％,中浓度组分别为(85.97±1.50)％、(81.14±1.19)％、(42.46±0.56)％,低浓度组分别为(78.34±1.35)％、(77.27±0.92)％、(36.66±0.60)％,与空白对照组[(0.62±0.51)％]相比差异均有统计学意义(F=180 678.22、41 488.99、44 346.38,19 543.86、27 887.32、34 590.79,20 059.467、41 953.68、17 993.77,均 P＜0.01),与阿苯达唑组[(30.03±2.02)％]比较差异均有统计学意义(F=6 585.72、4 210.84、646.46,2 956.80、2 849.68、210.83,2 365.92、2 712.28、58.12,均 P＜0.01);其余8种中药水提物高、中、低浓度组原头节的死亡率与对照组比较差异均无统计学意义(均P＞0.05).鸦胆子黄酮、苦楝皮黄酮、鸦胆子皂苷、辣蓼皂苷和辣蓼生物碱组原头节皱缩、结构松散、基质溶解,原头节死亡率分别为(98.33±2.89)％、(96.67±5.77)％、100％、(99.33±1.15)％和(56.67±2.11)％,与空白对照组[(10.33±2.51)％]比较差异均有统计学意义(F=1 584.00、563.71、3 808.47、3 099.52、14.65,均P＜0.01);其余中药粗提物组原头节的死亡率与对照组比较差异均无统计学意义(均P＞0.05).液相色谱与串联质谱联用分析结果显示,正、负离子模式下分别鉴定出741、398种代谢产物,其中正离子模式下从鸦胆子黄酮粗提物中鉴定出差异显著的黄酮类化合物4种,分别为漆黄素、5-甲基-7-甲氧基异黄酮、儿茶素和甜橙黄酮;负离子模式下鉴定出8种,分别为原花青素B2、槲皮素-3β-D-葡萄糖苷、枸桔苷、橙皮素、槲皮素、木犀草素、芹菜素和黄豆黄素.结论 鸦胆子、苦楝皮和辣蓼水提物,鸦胆子黄酮、苦楝皮黄酮、鸦胆子皂苷和辣蓼皂苷有明显体外抗细粒棘球蚴的作用,且效果优于阿苯达唑.

目的 通过观察阿苯达唑-葡聚糖纳米颗粒(ABZ-GPs)和阿苯达唑(ABZ)对多房棘球蚴原头节的杀伤作用,评价ABZ-GPs对多房棘球蚴病的疗效,为葡聚糖颗粒作为抗包虫病药物载体奠定基础.方法 设置ABZ、葡聚糖纳米颗粒(GPs)组、ABZ-GPs组和对照组,各用药组以终浓度50 μg/mL加入原头节培养基,每天用0.4％的台盼蓝染液染色以评价原头节存活情况,并使用扫描电镜(SEM)和透射电镜(TEM)观察原头节超微结构的变化.结果 成功构建了 ABZ-GPs,原头节与ABZ-GPs和ABZ共培养后,外翻型原头节明显增加,体表失去正常结构.培养第7 d开始至第10 d,ABZ-GPs组原头节存活率一直低于ABZ组,差异有统计学意义(t=3.091,P＜0.05).超微结构显示对照组和GPs组原头节吸盘清晰可见,体表微绒毛蓬松,角质层细胞形态均匀饱满;ABZ组原头节褶皱,吸盘变形,小钩排列紊乱,角质层见絮状空洞的分裂区域;ABZ-GPs组原头节明显褶皱,微绒毛消失,吸盘破坏,顶突小钩脱落,角质层广泛损伤,呈条状残留.结论 ABZ-GPs在体外对多房棘球蚴的杀伤作用优于ABZ原药.

目的 综合比较 95℃水浴法、碱裂解法及离心柱法提取多房棘球绦虫虫体基因组DNA的质量差异,筛选出适用于PCR鉴定多房棘球绦虫线粒体DNA分型的DNA提取方法.方法 无菌条件下取适量多房棘球绦虫原头节(Protoscoleces,PSCs)、囊壁组织样本为实验材料,分别采用 95℃水浴法、碱裂解法及离心柱法提取虫体样本中的基因组 DNA,检测其浓度与A260/A280 比值,并以提取的DNA为模板,通过PCR扩增多房棘球绦虫核基因延伸蛋白样蛋白(Ezrin/radixin/moesin-like protein,elp)和线粒体基因细胞色素 b(Cytochrome b,cob)、NADH脱氢酶亚基 2(NADH dehydrogenase subunit 2,nad2)和细胞色素 c 氧化酶亚基 I(Cytochrome c oxidase subunit 1,cox1)的片段,综合比较 3 种方法提取的基因组DNA扩增效果.结果 3 种方法均可从PSCs中提取出基因组DNA,琼脂糖凝胶电泳和核酸定量结果显示离心柱法提取的基因组DNA A260/A280 比值最高,差异具有统计学意义(P＜0.01),且在加样模板总量一致的情况下,以离心柱法提取的PSCs DNA为模板扩增的cob、nad2 和cox1 基因产物电泳条带清晰、明亮,片段长度准确;而使用 95℃水浴法和碱裂解法提取的PSCs 基因组DNA 仅有效扩增出cob 基因条带.通过离心柱法提取的囊壁组织 DNA 为模板仅扩增出elp 基因片段,小鼠组织基因组DNA未扩增出任何虫体的目的基因片段.结论 使用离心柱法从多房棘球绦虫 PSCs 中提取的基因组DNA质量最佳,能够有效扩增出虫体线粒体基因片段,且无宿主来源细胞的污染,可满足后续实验室对多房棘球绦虫不同虫株的基因型鉴定研究.

目的 筛选细粒棘球蚴(Echinococcus granulosus,Eg)原头节抗原分子,并进行克隆、表达及免疫反应性分析. 方法 在对细粒棘球绦虫六钩蚴和原头节阶段表达的转录组测序数据进行差异分析的基础上,筛选出原头节阶段特异性表达的抗原分子.PCR扩增后克隆至pET28a载体,构建原核表达载体pET28a-Eg-08002,转化至大肠埃希菌(Escherichia coli JM109,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,抗His标签镍亲和层析柱纯化重组蛋白rEg-08002,快速免染聚丙烯酰胺电泳分析表达产物;蛋白质印迹(Western blotting)分析rEg-08002的免疫反应性.ELISA分析重组蛋白rEg-08002与细粒棘球蚴病患者血清和健康人血清的免疫反应性. 结果 筛选出了原头节中高表达的抗原分子Eg-08002,大小为612 bp,构建原核表达载体pET28a-Eg-08002.快速免染聚丙烯酰胺电泳和Western blotting分析结果显示重组蛋白rEg-08002在E.coli JM109中获得高效表达,在相对分子质量(Mr)约为23 000处可见重组蛋白rEg-08002条带,主要以包涵体形式存在,rg-08002可被感染棘球蚴的小鼠血清识别.ELISA分析结果表明,12份细粒棘球蚴病患者血清和12份健康人血清的平均吸光度(A450)值分别为1.245±0.265和0.469±0.006,差异具有统计学意义(P＜0.05). 结论 筛选出了原头节中高表达的抗原分子Eg-08002,获得的重组蛋白rEg-08002具有较好的免疫反应性.

目的 探索青藏高原野生田鼠是否可以作为泡球蚴感染的动物模型.方法 将60只实验野生田鼠分为A组(皮下注射接种感染组)、B组(开腹肝穿刺注射感染组)、C组(经皮肝穿刺感染组),每组20只.感染3个月后观察各组大鼠的感染率、病死率.造模成功田鼠处死后分别从病灶浸润带、灶旁+50％病灶、病灶中心、液化部分、病灶边缘、病灶70％来进行HE染色,显微镜下观察包虫病灶的病理结构.从感染病灶中提取原头节,进行体外培养.计数资料比较采用x2检验.结果 A、B、C组田鼠泡球蚴感染的成功率分别为60％、80％、70％,3组比较差异无统计学意义(x2 =4.138,P=0.126).A、B、C组田鼠泡球蚴感染的病死率分别为5％、20％、15％,3组比较差异无统计学意义(x2=5.201,P=0.107).将造模成功的田鼠病灶切片,从浸润带(灶旁2～3 mm)、灶旁+50％病灶、病灶中心(无液化部分)、液化部分、病灶边缘(不含正常组织)、病灶70％来进行HE染色,镜下可见被红染囊泡的角质层较薄、不连续,囊泡外可观察到大量炎性细胞浸润,所有切片中均未发现原头节.随后将病灶组织体外培养并染色,可发现大量存活原头节,不着色且有活动性.结论 本研究证实高原野生田鼠作为青藏高原特有的物种,可以作为泡球蚴感染的动物模型,皮下接种感染泡球蚴是一种较合适的造模方法.