目的:建立并评估同步分离卵巢内不同发育阶段卵泡的方法——酶消化后滤网过滤法。方法:运用混合有胶原酶Ⅰ和脱氧核糖核酸酶Ⅰ的消化酶来消化小鼠卵巢预切组织，然后依次通过不同孔径（100 μm、40 μm、20 μm）的滤网以实现不同发育阶段卵泡同步分离的目的，将翻转冲洗100 μm滤网得到的卵泡记为A组（>100 μm），翻转冲洗40 μm滤网得到的卵泡记为B组（40~100 μm），翻转冲洗20 μm滤网得到的卵泡记为C组（20~40 μm）。评估并比较经不同孔径滤网筛选获得的卵泡群的数量、大小、形态、活力和发育潜能。结果:数量上，C组获得的卵泡数目最多，A组次之，B组最少；形态上，C组卵泡基底膜完整率高于A组和B组（ P<0.001， P<0.001）。活力上，A组卵泡的存活率70.59%（120/170）高于B组51.79%（58/112）和C组35.90%（28/78）（ P=0.001 6， P<0.001）。发育潜能上，经过96 h体外培养，A组卵泡直径由（113.64±9.57） μm增长至（150.95±45.90） μm（ P=0.002 4），B组卵泡直径由（88.12±9.12） μm增长至（120.61±18.00） μm （ P<0.001），C 组卵泡在培养第24 h内出现单层颗粒细胞贴壁，卵母细胞与颗粒细胞之间失去连接结构，卵母细胞完全裸露，未能培养成功。 结论:酶消化后多重滤网过滤法能快速有效获得大量形态完整、有活力和发育潜能良好的卵泡，且能达到不同发育阶段卵泡同步分离的目的。

目的:探讨DNaseⅠ对痤疮丙酸杆菌生物膜的抑制效应。方法:构建痤疮丙酸杆菌生物膜并给予DNaseⅠ处理，分为不同DNaseⅠ浓度组（0、5、10、20 U/ml）。采用四甲基氮盐法检测生物膜活力，结晶紫半定量法检测生物膜含量，激光共聚焦显微镜观察生物膜结构及活菌/死菌比值。组间差异比较采用单因素方差分析。结果:5、10、20 U/ml的DNaseⅠ处理后痤疮丙酸杆菌生物膜活力值分别为1.882 ± 0.421、1.653 ± 0.287、1.473 ± 0.154，与阴性对照组（2.668 ± 0.245）相比存在显著抑制，且DNaseⅠ浓度越高抑制作用越显著（ F = 9.68， P = 0.005）。5、10、20 U/ml DNaseⅠ组生物膜含量值分别为1.039 ± 0.003、0.489 ± 0.079、0.147 ± 0.034，与阴性对照组（1.359 ± 0.071）相比显著降低，且DNaseⅠ浓度越高生物膜含量越低（ F = 174.40， P < 0.001）。激光共聚焦显微镜观察结果显示，与阴性对照组相比，5、10、20 U/ml DNaseⅠ组生物膜结构被破坏，且DNaseⅠ浓度越高生物膜结构破坏越严重。5、10、20 U/ml DNaseⅠ组痤疮丙酸杆菌生物膜活菌/死菌比值分别为2.303 ± 0.457、1.534 ± 0.526、1.263 ± 0.354，比阴性对照组（4.475 ± 0.146）显著降低，且浓度越高生物膜活菌/死菌比值越低（ F = 56.75， P < 0.000 1）。 结论:DNaseⅠ对痤疮丙酸杆菌生物膜的结构有破坏作用，对其活力有抑制作用。

目的:针对现有技术的不足，尝试一种活性强、比例高的小鼠肠肌层细胞分离提取方法。方法:采用"降阶梯"策略构建解离液组合，逐层解离黏液层、黏膜层、固有层和黏膜下层，再使用消化液消化肌层细胞。其中，降阶梯式解离液是指胰蛋白酶浓度在黏液层、黏膜层和黏膜下层解离液中阶梯式降低；消化液是由胶原酶Ⅰ/Ⅳ、中性蛋白酶与脱氧核糖核酸酶Ⅰ(DNaseⅠ)组成。实验组1、2、3的胰蛋白酶浓度(wt%)梯度分别为：0.50、0.25、0.10；0.50、0.30、0.20；1.00、0.50、0.25。两两比较采用 t检验。 结果:成功分离出肠肌层，并获得了肠肌层细胞，实验组1的肌层暴露比例为(91.00±1.87)%，细胞活性为(79.20±0.49)%。实验组1的肌层暴露比例显著高于实验组2[(91.00±1.87)%比(80.00±3.16)%， t＝2.994， P<0.05]和实验组3[(91.00±1.87)%比(83.00±2.55)%， t＝2.530， P<0.05]；同时实验组1的细胞活性也显著高于实验组2[(79.20±0.49)%比(70.20±0.37)%， t＝14.600， P<0.01]和实验组3[(79.20±0.49)%比(62.40±0.40)%， t＝26.560， P<0.01]。 结论:本方法能够提取获得活性强、比例高的肠肌层细胞。

肝细胞癌(HCC)是一种起源于肝细胞的恶性肿瘤,其病因尚未完全明确,目前已知乙型肝炎病毒(HBV)感染是其主要的病因.早期临床症状不明显,晚期主要以肝区疼痛、黄疸、进行性消瘦为特征,严重时甚至可以出现上消化道出血、肝性脑病.HBV整合是HBV不断将自身脱氧核糖核酸(DNA)整合入宿主基因组中,并且在一定程度上起到促癌的作用,在乙型肝炎相关HCC中,整合子可导致与细胞周期和生命活动有关的癌症相关基因上调,诱导染色体不稳定,产生病毒癌蛋白(HBX),导致其他(可能致癌的)病毒-人转录本融合(HBV-LINEⅠ)和激活端粒酶,这些机制可能单独或协同发挥作用,导致HCC的发生.本文就HBV DNA整合在乙型肝炎相关HCC中的作用机制及临床意义进行综述,有助于改善和提高现行的抗病毒治疗策略,提前采取有效措施,降低HCC的发生率.

目的 观察肾纤维化模型中沉默信息调节因子 3(silent information regulator 3,Sirt3)的表达变化及有氧糖酵解水平变化,探讨Sirt3在肾间质纤维化中的作用及机制.方法 野生型小鼠及Sirt3基因敲除小鼠分别构建单侧输尿管梗阻肾纤维化模型,对侧肾脏为假手术对照组.HE染色及Masson染色观察肾脏病理变化,蛋白质印迹法检测Sirt3、纤维化相关标志性蛋白(纤连蛋白、Ⅰ型胶原蛋白)、有氧糖酵解关键酶(己糖激酶 2、M2型丙酮酸激酶)及凋亡相关蛋白天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶 3的表达,脱氧核糖核酸末端转移酶介导的缺口末端标记技术检测肾小管上皮细胞凋亡;体外培养人肾小管上皮细胞,分为对照组和si-Sirt3组,转化生长因子β1处理细胞,蛋白质印迹法检测上述纤维化相关蛋白及有氧糖酵解关键酶的表达水平,流式细胞术检测细胞凋亡.结果 在体内外纤维化反应中,肾小管上皮细胞凋亡和有氧糖酵解水平明显增加,Sirt3表达显著下调.而Sirt3基因敲除进一步加重了肾小管上皮细胞凋亡和异常的有氧糖酵解,促进了肾间质纤维化.结论 Sirt3可能通过抑制肾小管上皮细胞有氧糖酵解减轻肾间质纤维化,在慢性肾脏病中发挥保护作用.

目的 探讨含 OTU 结构域的泛素醛结合蛋白 2(OTUB2)影响RNA解螺旋酶 54(DDX54)的活性及其对中性粒细胞胞外诱捕网(NETs)的形成和结直肠癌(CRC)细胞活力、侵袭的影响.方法 分离CRC患者和健康对照组的外周血中性粒细胞,并使用佛波酯(PMA)或脱氧核糖核酸酶Ⅰ(DNaseⅠ)刺激中性粒细胞4 h;Western blot检测NETs标记物髓过氧化物酶(MPO)和瓜氨酸组蛋白H3(Cit-H3)的表达;干预SW480 细胞中OTUB2 或DDX54 的表达并将其和中性粒细胞共培养,细胞分为如下组:对照组(不做任何处理),NETs 组、vector 组、OTUB2 组、NETs+si-OTUB2 组(SW480 细胞、转染了vector、OTUB2 过表达质粒和si-OTUB2的SW480 细胞分别与 PMA 处理的中性粒细胞共培养),OTUB2+DNase Ⅰ组(转染了OTUB2 过表达质粒的SW480细胞与DNase Ⅰ处理的中性粒细胞共培养),si-OTUB2 组、OTUB2+si-NC 组和 OTUB2+si-DDX54 组(转染了 si-OTUB2、OTUB2 过表达质粒和 si-NC、OTUB2 过表达质粒和si-DDX54 的 SW480 细胞分别与中性粒细胞共培养).ELISA检测 SW480 细胞上清液中 MPO-DNA 复合物相对表达量和Cit-H3 的浓度;MTT和Transwell检测SW480 细胞活力和侵袭能力;RNA测序筛选OTUB2 调控的下游基因并使用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)、免疫共沉淀(co-IP)和谷胱甘肽 S-转移酶(GST)亲和纯化(GST-pull-down)、His-tag pull-down实验验证 DDX54 和OTUB2 的相互作用.结果 与健康对照相比,CRC患者外周血中NETs的形成增加.与对照组相比,NETs组CRC细胞活力和侵袭增加(P<0.05).与vector组比较,OTUB2 组MPO-DNA复合物相对表达量和Cit-H3 的浓度增加,细胞活力和侵袭增加(P<0.05);而与OTUB2 组比较,OTUB2+DNase Ⅰ组MPO-DNA复合物相对表达量和Cit-H3 的浓度减少,细胞活力和侵袭减少(P<0.05).Co-IP 实验、GST pull down 实验和His-tag pull down实验表明OTUB2 和DDX54 之间存在相互作用.与 OTUB2+si-NC 组比较,OTUB2+si-DDX54 组MPO-DNA复合物相对表达量和Cit-H3 的浓度减少,细胞活力和侵袭减少(P<0.05).结论 去泛素化酶OTUB2 可以通过上调DDX54 的增加NETs的形成并促进CRC细胞活力和侵袭.

从肺腺癌A549细胞培养上清液中分离胞外囊泡(EVs),通过动态光散射(DLS)和透射电镜(TEM)分析得到EVs的大小约为100 nm,并在样品中检测到EVs的特异性标记TSG101.通过琼脂糖凝胶电泳检测发现,胞外囊泡DNA(evDNA)分子片段的大小在12 kb左右.根据evDNA测序数据选择特定evDNA开展PCR试验,实现其有效检测.对EVs进行脱氧核糖核酸酶Ⅰ(DNase I)或ATP依赖的DNA酶(PS酶)处理,证实evDNA以线性方式存在于囊泡外侧.通过末端转移酶(TdT)向evDNA末端添加poly-dA,使用oligo-dT珠对其进行捕获,进一步证明其线性表面分布.此外,建立TetO-DNA/TetR-GFP可视化系统,在荧光显微镜下观察到TetR-GFP蛋白与EVs上TetO-DNA的结合.流式细胞术和PCR试验证实,可用TetR-GFP蛋白实现对携带TetO-DNA EVs的富集.本研究证实了evDNA以线性的形式分布在EVs表面,为进一步研究其生物学功能提供了重要基础.

目的 探究中性粒细胞胞外捕获网(neutrophil extracellular traps,NETs)在骨肉瘤细胞增殖、迁移和侵袭中的作用及其相关机制.方法 纳入骨肉瘤患者和健康受试者各 20 例,通过ELISA检测血清中PAD4 和H3cit水平.提取两组人群外周血中性粒细胞,比较NETs形成差异.将NETs与骨肉瘤细胞MG63共孵育,期间加入DNA降解酶DNase Ⅰ,分为对照组、NETs组和NETs +DNase Ⅰ组.通过蛋白质印迹检测CCDC25 蛋白表达水平,CCK8 检测细胞增殖水平,Transwell 检测细胞迁移和侵袭水平.将 si-NC 和 si-CCDC25 转染至MG63,加入NETs共孵育,分为si-NC组和si-CCDC25 组,通过蛋白质印迹检测CCDC25 蛋白表达水平,CCK8 检测细胞增殖水平,Transwell检测细胞迁移和侵袭水平.结果 与健康受试者比较,骨肉瘤患者血清中 PAD4 和 H3cit 水平升高(P<0.05),NETs 形成能力增强.与对照组比较,NETs 组CCDC25 蛋白表达升高,细胞增殖、迁移和侵袭水平升高(P<0.05).与NETs组比较,NETs + DNase Ⅰ组CCDC25 蛋白表达降低,细胞增殖、迁移和侵袭水平降低(P<0.05).与 si-NC 组比较,si-CCDC25 组CCDC25 蛋白表达降低,细胞增殖、迁移和侵袭水平降低(P<0.05).结论 NETs通过释放的DNA激活骨肉瘤细胞CCDC25 表达,从而促进肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭.

既往观点认为,放射治疗主要通过破坏肿瘤细胞脱氧核糖核酸双链直接发挥杀伤肿瘤细胞的作用,近年来研究发现,放疗也可通过上调局部与全身免疫反应,间接产生积极有效的抗肿瘤免疫应答.然而,放疗的免疫调节效应具有双面性,一方面可激活并产生抗肿瘤免疫促进效应,另一方面也可能产生免疫抑制作用.其中,放疗正向调节适应性与固有性抗肿瘤免疫反应的关键分子机制主要包括:诱导免疫原性细胞凋亡从而促进T淋巴细胞的增殖与活化;激活环磷酸鸟苷-腺苷合成酶-干扰素基因刺激蛋白通路引发Ⅰ型干扰素反应;改变肿瘤细胞表型,加强其免疫原性与抗原可视度;刺激肿瘤细胞与基质细胞释放多种炎症因子,重塑肿瘤免疫微环境;上调肿瘤细胞表面免疫检查点以及死亡受体等的表达,促进免疫识别与抗肿瘤免疫应答.而放疗负向抑制免疫反应的主要机制包括:诱导肿瘤细胞上调多种免疫抑制因子的基因表达;增强包括调节性T细胞、髓系来源抑制性细胞在内的多种免疫抑制细胞的功能与作用;导致淋巴细胞的数量减少以及免疫效应细胞的耗竭等.基于以上关于放疗免疫调节效应的机制原理探索,目前在放疗联合免疫治疗的临床实践中也显示出重大的研究进展,包括免疫治疗时代背景下的放疗远隔效应,即放疗照射野以外产生的有效抗肿瘤免疫应答,以及立体定向放疗或低剂量放疗联合免疫检查点抑制剂治疗时显著增加的疗效获益.然而,目前对于放疗联合免疫治疗产生的协同作用机制及其具体影响因素等仍不明确,未来需要在放疗与免疫治疗联合治疗的最佳放疗剂量、放疗分割模式、放疗照射部位与靶区设计、免疫药物选择以及放疗与免疫联合治疗顺序等研究方向开展深入探索,以进一步提高临床疗效,促进放疗免疫调节生物学效应的临床转化应用.本文将对放疗的免疫调节效应以及放疗与免疫治疗联合协同作用的基础与临床研究最新进展进行系统综述,以期为放疗联合免疫治疗的理论基础发展与临床实践进步提供参考.

[目的]探讨α1-抗胰蛋白酶(α1-AT)/DNA酶Ⅰ(DNase Ⅰ)、β-防御素1(HBD-1)、铁蛋白(SF)在重症社区获得性肺炎(SCAP)患儿中的表达及其临床意义.[方法]选取2020年1月至2021年5月开封市儿童医院收治的98例SCAP患儿(观察组),根据肺炎严重指数(PSI)分为低危组(n=15)、中危组(n=52)、高危组(n=31),根据检测结果分为细菌性肺炎组(n=50)、支原体肺炎组(n=22)、病毒性肺炎组(n=26),同时选取同期于本院体检的62例健康儿童作为对照组.比较不同组间血清α1-AT/DNaseⅠ、HBD-1、SF水平,采用Spearman法分析α1-AT/DNaseⅠ、HBD-1、SF与疾病严重程度的相关性,采用受试者工作特征(ROC)曲线评估上述指标对SCAP的诊断价值.[结果]观察组血清α1-AT/DNase Ⅰ、HBD-1、SF水平高于对照组,差异有统计学意义(P＜0.05).单因素方差分析显示,不同疾病严重程度的SCAP患儿血清α1-AT/DNaseⅠ、HBD-1、SF水平比较,差异有统计学意义(P＜0.05).中危组、高危组血清α1-AT/DNaseⅠ、HBD-1、SF水平高于低危组,且高危组高于中危组,差异有统计学意义(P＜0.05).支原体肺炎组、病毒性肺炎组α1-AT/DNaseⅠ、HBD-1、SF水平高于细菌性肺炎组(P＜0.05),支原体肺炎组、病毒性肺炎组比较,差异无统计学意义(P＞0.05).Spearman相关性分析显示,α1-AT/DNaseⅠ、HBD-1、SF 均与疾病严重程度呈正相关(rs=0.632、0.524、0.531,均 P＜0.01).ROC 曲线分析显示,α1-AT/DNaseⅠ、HBD-1、SF联合检测的曲线下面积、敏感度、特异度明显高于单项检测(P＜0.05).[结论]SCAP患儿血清中α1-AT/DNase Ⅰ、HBD-1、SF水平异常升高,且与病情程度有关,联合检测可提高SCAP诊断价值.