目的:探讨小神经胶质细胞去除联合骨髓间质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）移植修复脊髓损伤（spinal cord injury，SCI）的效果。方法:培养表达绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）的BMSCs并进行干细胞鉴定，体外检测GFP-BMSCs分泌营养因子情况，与背根神经节（dorsal root ganglions，DRGs）共培养，观察其促进轴突生长效果；应用集落刺激因子1受体（colony stimulating factor 1 receptor，CSF1R）抑制剂PLX3397去除小鼠脊髓中小神经胶质细胞，并对脊髓进行钳夹损伤（Crush损伤），成功建立去除小神经胶质细胞小鼠SCI模型，将GFP-BMSCs移植到去除小神经胶质细胞小鼠SCI区域。将小鼠随机分为单纯饲料组和PLX3397组。于术后7、30、60 d分别取材，进行HE染色、免疫荧光染色对比观察移植GFP-BMSCs存活情况及神经组织修复情况；应用Basso mouse scale（BMS）评分来评价小鼠运动功能恢复情况。结果:体外GFP-BMSCs能够分泌大量的神经营养因子，其与DRGs共培养，促进了DRGs神经轴突的生长。去除小神经胶质细胞明显提高SCI区域移植GFP-BMSCs存活，与单纯GFP-BMSCs移植相比，两者联合作用能够在一定程度上减少损伤区域面积，但差异无统计学意义（ t=2.141， P=0.065）。免疫荧光染色显示单纯移植GFP-BMSCs或去除小神经胶质细胞后移植GFP-BMSCs均未能使皮质脊髓束（corticospinal tract，CST）轴突跨过损伤中心到达脊髓远端，在损伤后1、7、14、21、28 d行BMS评分，单纯饲料组分别为（1.20±0.45）、（3.20±0.45）、（3.80±0.45）、（4.20±0.45）、（4.60±0.55）分，PLX3397组分别为（0.60±0.55）、（3.00±0.71）、（3.80±0.84）、（4.20±0.84）、（4.40±0.89）分，两组各个时间点BMS评分差异无统计学意义（均 P>0.05）。 结论:去除小神经胶质细胞提高了SCI区域移植GFP-BMSCs存活，但是未能促进CST轴突再生及脊髓损伤小鼠运动功能恢复，可能需要联合促轴突再生策略以提高SCI后神经功能恢复。

目的 探讨 2 型糖尿病肾病(DN)大鼠白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-10(IL-10)、转化生长因子-β1(TGF-β1)、组蛋白去乙酰化酶4(HDAC4)表达及其与血糖、尿蛋白-肌酐比值(UACR)的相关性.方法 采用随机数字表法将64 只健康雄性Sprague Dawley大鼠分为对照组(n =32)和DN组(n =32).DN 组大鼠给予高脂高糖饲料及腹腔注射链脲佐菌素40 mg·kg-1 制备DN模型,DN模型大鼠造模成功后正常饮食饮水.对照组大鼠正常饮食饮水,经腹腔注射等剂量柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液.于造模后第 0、4、8、12 周分批处死2 组大鼠,于每次处死前称大鼠体质量;使用血糖仪及配套试纸检测大鼠血糖;收集尿液,使用全自动生物化学分析仪检测大鼠尿微量白蛋白、尿肌酐水平,并计算UACR;于大鼠处死后立即取出双侧肾脏,其中一侧肾脏去除包膜后称肾质量,并计算肾脏指数(KI).采用Western blot法检测2 组大鼠肾组织中IL-6、IL-10、TGF-β1、HDAC4 蛋白表达,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测2 组大鼠血清中IL-6、IL-10、TGF-β1 和HDAC4 水平,采用Pearson相关分析DN大鼠血清IL-6、IL-10、TGF-β1、HDAC4水平与血糖、UACR的相关性.结果 造模后第 0、4、8、12 周,DN 组大鼠血糖水平及UACR均显著高于对照组(P＜0.05).造模后第 0 周,2 组大鼠的体质量比较差异无统计学意义(P＞0.05);造模后第 4、8、12 周,DN组大鼠的体质量均显著低于对照组(P＜0.05).造模后第 0、4 周,2 组大鼠的KI比较差异无统计学意义(P＞0.05);造模后第 8、12周,DN组大鼠的KI显著高于对照组(P＜0.05).造模后第0、4、8、12 周,DN组大鼠血清中IL-6、HDAC4、TGF-β1 水平均显著高于对照组,IL-10 水平显著低于对照组(P＜0.05).造模后第 0 周,DN组大鼠肾组织中IL-10 相对表达量显著高于对照组(P＜0.05);造模后第 8 周,DN组大鼠肾组织中IL-10 相对表达量显著低于对照组(P＜0.05);造模后第4、12 周,2 组大鼠肾组织中IL-10 相对表达量比较差异无统计学意义(P＞0.05).造模后第 0、4、8、12 周,DN组大鼠肾组织中IL-6、HDAC4 相对表达量均显著高于对照组(P＜0.05).造模后第 0 周,2 组大鼠肾组织中TGF-β1 相对表达量比较差异无统计学意义(P＞0.05);造模后第4、8、12 周,DN组大鼠肾组织中TGF-β1 相对表达量显著高于对照组(P＜0.05).Pearson相关性分析显示,DN 组大鼠血清IL-6、TGF-β1 水平与血糖呈正相关(r=0.614、0.514,P＜0.05),血清IL-10 水平与血糖呈负相关(r=-0.448,P＜0.05),血清HDAC4 水平与血糖无相关性(r=-0.177,P＞0.05).DN组大鼠血清IL-6、TGF-β1 水平与UACR呈正相关(r=0.405、0.470,P＜0.05),血清IL-10、HDAC4 水平与UACR无相关性(r=-0.134、-0.124,P＞0.05).结论 DN大鼠IL-6、TGF-β1、HDAC4 表达上调,IL-10 表达下调;DN大鼠血清IL-6、TGF-β1 水平与血糖、UACR呈显著正相关,血清IL-10 水平与血糖呈显著负相关.

[目的]环状RNA (circRNA)在可变剪接、转录调控和来源基因的表达调控等方面具有重要功能.本研究旨在分析意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica工蜂中肠circRNA的数量、种类、结构特征和作用,并通过构建和分析circRNA的调控网络探索circRNA的调控功能.[方法]在实验室条件下人工饲养意大利蜜蜂工蜂,利用circRNA-seq技术对意大利蜜蜂7和10日龄成年工蜂中肠样品进行深度测序.利用find_circ软件从质控后的数据中预测circRNA.通过BLAST比对GO和KEGG数据库,对circRNA的来源基因进行功能和代谢通路注释.利用TargetFinder软件预测circRNA靶向结合的miRNA及miRNA靶向结合的mRNA,通过Cytoscape v.3.2.1软件对circRNA-miRNA和circRNA-miRNA-mRNA调控网络进行构建及可视化.通过设计背靠背引物和线性扩增引物RT-PCR对预测出的circRNA进行验证.[结果]意大利蜜蜂工蜂中肠样品的测序平均得到136 463 071条clean reads,去除rRNA后各样品的anchor reads均在136 779 122条及以上.共预测出10 833个circRNA,长度主要介于15～1 000 nt;上述circRNA的类型丰富,其中已注释的外显子circRNA数量最多,分布在西方蜜蜂1号染色体的circRNA数量最多,其次为8号染色体.CircRNA的来源基因可注释到包括结合、细胞进程和细胞在内的45个GO条目,以及包括内吞作用、内质网蛋白加工及核糖体在内的121条KEGG代谢通路,表明circRNA在意大利蜜蜂工蜂中肠的生长、发育、新陈代谢和细胞生命活动等生物学过程中发挥重要作用.进一步构建circRNA-miRNA和circRNA-miRNA-mRNA调控网络,分析结果显示部分circRNA可能作为竞争性内源RNA吸附结合microRNA,从而调控基因的表达水平.最后,对随机选择的3个circRNA的RT-PCR结果验证了其真实存在.[结论]本研究对意大利蜜蜂工蜂中肠中的circRNA进行预测、分析及鉴定.研究结果提供了中肠circRNA的数量、种类、结构特征、作用和调控网络的信息,揭示了circRNA可能通过作用于来源基因和作为竞争性内源RNA在意大利蜜蜂工蜂中肠的生长发育和免疫防御中发挥作用,为深入研究circRNA在意大利蜜蜂中肠发育及胁迫响应过程中的功能奠定了基础.

目的 探讨去除型人皮肤成纤维饲细胞系的建立及其重建角膜表层的相关研究.方法 将增强型绿色荧光蛋白(EGFP)、端粒酶逆转录酶(hTERT)和单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)3种基因导入人皮肤成纤维细胞,建立荧光标记的永生化的可去除型TERT+TK-D人源饲细胞系.将创建的细胞系经丝裂霉素C处理后作为饲养细胞与人角膜缘干细胞共培养,并与3T3饲细胞的培养结果 作比较.结果 TERT+TK-D细胞系在体外经过6个月的连续传代后仍然表达绿色荧光蛋白,保持旺盛的分裂能力,对更昔洛韦敏感.TERT+TK-D组的克隆形成率(colony forming ef-ficiency,CFE)为(11.77±0.21)％,与3T3组CFE[(12.8±1.61)]％比较,差异无统计学意义(P=0.332);经过共培养,两组都形成了4～5层复层上皮细胞片.角膜缘干细胞克隆和上皮细胞片的免疫荧光染色及Real-time PCR定量分析结果 显示,TERT+TK-D组角蛋白K3表达低于3T3组;PCR结果 证实TERT+TK-D饲细胞在更昔洛韦作用下凋亡、裂解,没有混入培养获得的角膜上皮细胞片中.结论 转基因荧光标记的永生化的去除型人皮肤成纤维饲细胞有望替代3T3细胞用于角膜再生医疗.

共生菌Wolbachia能够诱导许多节肢动物发生产雌孤雌生殖现象.由于该菌无法在宿主细胞外离体培养,人们常采用抗生素处理获得Wolbachia去除或滴度降低的宿主种群,用以研究Wolbachia对宿主的调控作用,但抗生素可能会对宿主产生附加效应.前人研究主要集中在抗生素处理是否可以恢复感染寄生蜂的两性生殖,较少关注抗生素对宿主适合度的影响.本研究利用不同浓度四环素(0、5 mg/mL、15 mg/mL和25 mg/mL)连续饲喂5代来明确四环素对产雌孤雌生殖的松毛虫赤眼蜂Trichogramma dendrolimi适合度的影响.研究结果如下:(1)随各浓度四环素处理世代的增加,雌蜂的繁殖力先降低后升高.在F1代、F2代和F5代中,雌蜂繁殖力随四环素浓度的增加而显著下降,但在F3代和F4代中,抗生素浓度对雌蜂繁殖力无显著差异;(2)在四环素不同浓度处理下,F1代和F3代的羽化率与对照无显著差异,在F2代、F4代和F5代中,四环素对羽化率存在负面影响;(3)经四环素处理的松毛虫赤眼蜂子代雄性比显著高于对照组.在5 mg/mL的四环素处理条件下,松毛虫赤眼蜂子代雄性比随处理世代的增加而升高,但在25 mg/mL的四环素处理条件下随世代的增加先升高后下降.结果表明:四环素能够使孤雌产雌松毛虫赤眼蜂恢复两性生殖,但对松毛虫赤眼蜂的适合度存在不利影响.此外,随着四环素处理世代的增加,松毛虫赤眼蜂对抗生素产生了一定的适应能力.

目的 研究“运腹通经推拿法”对单纯性肥胖症模型家兔TLRs/MyD88/NF-κB信号通路的影响,探讨该疗法对脂肪细胞炎性反应的调控机制.方法 34只6月龄清洁级新西兰家兔,随机选取7只为空白组进食普通饲料,剩余27只采用经典高脂饲料喂养进行造模,6周后去除空白组和肥胖组内体质量最低和最高的家兔各2只以缩小误差.肥胖组重新随机分为模型组5只、对照组(盐酸西布曲明片)5只、推拿1组(低刺激量)、推拿2组(中刺激量)和推拿3组(高刺激量)各5只;五组家兔连续治疗6周,每周治疗6天.治疗结束后通过光镜分别观察六组家兔腹部脂肪组织HE染色病理切片结果;荧光定量PCR和Westtern blot分别检测各组家兔腹部脂肪组织TLR4、MyD88、NF-κB基因和蛋白表达.结果 空白组家兔脂肪细胞正常,模型组可见间质脂肪增生,部分区域有坏死、水肿;推拿1组脂肪细胞形态与模型组相类似;推拿2组、推拿3组和对照组脂肪细胞形态尚可,但尚未恢复到空白组水平,且三组之间未见明显差异;与模型组比较,对照组、推拿2组、推拿3组脂肪组织TLR4、MyD88、NF-κB基因和蛋白表达均显著下调(P＜0.05);与对照组比较,推拿2组、推拿3组脂肪组织mRNA及蛋白表达均显著下调(P＜0.05).结论 运腹通经推拿法治疗单纯性肥胖具有一定的优势,并且取得了和盐酸西布曲明片相当的治疗效果,作用机制通过躯体刺激可能调控单纯性肥胖症家兔TLR信号转导通路,从而抑制下游MyD88、NF-κB表达,阻断脂肪炎性细胞因子的分泌,改善脂肪细胞形态变化.

目的 探讨血府逐瘀汤通过影响骨形态发生蛋白(BMP)9表达抑制Notch信号通路调节髓核细胞增殖的机制.方法 雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠(6～8周龄,体重190～220 g),并随机分为3组:对照组(正常饲养的大鼠,n=12).诱导模型组(椎间盘退变诱导,通过腹膜内注射10％水合氯醛给大鼠施用麻醉然后将它们置于具有固定肢体的俯卧位.使用脱毛剂制备背部皮肤上4 cm×8 cm的区域.然后将灭菌的覆盖片放在大鼠上,沿着后腰的棘突切割中线切口.切割皮肤后,进行骨膜下剥离以充分暴露棘突,关节突和椎板.咬骨钳用于去除棘突,关节突,棘上韧带和棘突间韧带.双侧竖脊肌切开.然后将皮下筋膜和皮肤逐层缝合回来,n=24),血府逐瘀汤组(在诱导模型组的12只大鼠中,腹腔注射50 mg/kg血府逐瘀汤,连续注射3 w,n=12).通过电子显微镜(EM)检查各组大鼠椎间盘组织;通过qRT-RCR检测各组培养细胞中BMP9、Notch信号通路相关因子的mRNA相对表达;通过Western印迹检测髓核细胞中细胞外基质(ECM)蛋白的表达;通过CCK8测定不同组髓核细胞的增殖影响;通过TUNEL检测髓核细胞的凋亡情况.结果 诱导模型组与对照组相比BMP9 mRNA表达低.与诱导模型组相比血府逐瘀汤组BMP9 mRNA表达明显升高(P<0.05).诱导模型组与对照组相比,髓核细胞的含量明显降低.而血府逐瘀汤组较诱导模型组髓核细胞的含量明显升高(P<0.05).BMP9抑制转染组较培养细胞组,Notch信号通路相关因子Notch1、DLL1 mRNA表达明显升高,BMP9 mRNA表达明显降低(P<0.05).BMP9抑制转染组较培养细胞组细胞凋亡率明显升高,细胞活力明显下降(P<0.05),BMP9转染组较BMP9抑制转染组凋亡率明显下降,细胞活力明显升高(P<0.05).结论 血府逐瘀汤通过影响BMP9表达抑制Notch信号通路调节髓核细胞增殖.

目的 探讨微小核糖核酸(miR)-125a-3p靶向介导Notch1信号通路对Wistar大鼠骨质疏松性骨折愈合的影响.方法 6月龄Wistar大鼠58只,假手术组8只(假手术组),其余50只鼠切除卵巢建立骨质疏松大鼠模型,测骨密度验证模型成立,再手术建立一侧股骨中点骨折模型,克氏针固定.去除模型不成功大鼠后分组转染,每组8只,包括:模型组、inhibitor NC组(转染抑制剂阴性对照组)、miR-125a-3p inhibitor组(转染miR-125a-3p抑制剂)、si-Notch1组(转染Notch si-RNA干扰)、miR-125a-3p inhibitor+si-Notch1组(miR-125a-3p抑制剂及Notch1 si-RNA联用组).大鼠饲养8周后取断端组织,实时定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)检测miR-125a-3p及Notch1的表达,过生物信息学网站预测及双荧光素酶报告实验检测miR-125a-3p与Notch1的靶向作用,病理组织学及免疫组化观察、骨密度及生物力学测量共同分析各组骨折愈合情况.结果 模型组较假手术组骨密度下降(P<0.05).与假手术组相比,模型组中miR-125a-3p表达量(1.48±0.11)均上调,Notch1表达(0.75±0.02)下调(P<0.05).miR-125a-3p mimic与野生型Notch1-WT共转染组中荧光素酶活性强度[萤火虫荧光素酶(0.58±0.02)]下降(P<0.05).与inhibitor NC组相比,miR-125a-3p inhibitor组(0.62±0.29)及miR-125a-3p inhibitor+si-Notc1组(0.73±0.21)表达下调(P<0.05).与inhibitor NC组相比,miR-125a-3p inhibitor组Notch1表达(0.93±0.35)提高,si-Notch1组(0.40±0.15)表达降低(P<0.05).与si-Notch1组相比,miR-125a-3p inhibitor+si-Notc1组(0.79±0.33)Notch1表达提高(P<0.05).转染8周后,假手术组骨小梁开始大量形成,厚度均匀,排列紧密、方向一致.模型组、inhibitor NC组骨细胞数大量减少,骨小梁较细,间隙较大且排列紊乱.miR-125a-3p inhibitor组骨小梁厚度增加,骨细胞数增多,骨质改善,与假手术组显微形态较为相似.si-Notch组骨细胞数大量缺失,骨小梁间隙极大,显微结构较模型组病理形态更明显.miR-125a-3p inhibitor+si-Notc1组介于miR-125a-3p inhibi-tor组与si-Notch1组间,骨小梁厚度有所增加.同inhibitor NC组相比,miR-125a-3p inhibitor组(120.60±6.65)阳性表达增加,si-Notch1组(60.60±2.84)减少(P<0.05).同miR-125a-3p inhibitor组相比,miR-125a-3p inhibitor+si-Notc1组阳性细胞表达(78.00±2.27)降低,与si-Notch1组相比增多(P<0.05).第4、6、8周,同假手术组相比,模型组(104.25±10.52、110.25±13.03、116.75±10.59)骨密度下降(P<0.05).同inhibitor NC组相比,miR-125a-3p inhibitor组(119.02±9.55、131.25±10.57、146.75±12.47)骨密度上升,si-Notch1组降低(P<0.05).同miR-125a-3p inhibitor组相比,miR-125a-3p inhibitor+si-Notc1组各项骨生物力学指标下降(P<0.05).同假手术组相比,模型组各项骨生物力学指标,包括最大负载、极限应力及剪切应力下降(P<0.05);同inhibitor NC组相比,miR-125a-3p inhibitor组[最大负载:(125.01±12.05)N;极限应力:(86.75±5.11)Mpa;剪切应力:(1.62±0.34)N/mm2]各项骨生物力学指标上升,si-Notch1组降低(P<0.05).同miR-125a-3p inhibitor组相比,miR-125a-3p inhibitor+si-Notc1组[最大负载:(95.02±8.41)N;极限应力:(56.52±4.95)Mpa;剪切应力:(1.30±0.17)N/mm2]各项骨生物力学指标下降;与si-Notch1组相比上升(均P<0.05).结论 抑制miR-125a-3p可以促进Notch1表达,增加BMP-2的阳性表达、增强骨密度及生物力学强度,进而促进骨质疏松性Wistar大鼠骨折愈合.

目的 探讨亚低温辅助运动通过抑制脑神经凋亡改善缺氧缺血性脑损伤大鼠幼崽脑神经功能的机制.方法 选择无特定病原体(SPF)级新生7日龄Wistar大鼠,采用手术结扎左颈总动脉法建立缺氧缺血性脑损伤幼鼠模型.按照随机数字表法分为假手术组(假手术幼鼠,正常饲养不进行任何干预)、HIE模型组(HIE模型幼鼠,正常饲养不进行任何干预)和HIE模型+亚低温和运动干预组(HIE模型幼鼠,亚低温和运动干预),每组大鼠幼崽各5只,共干预63 d.分别于治疗前以及治疗后第42天和第63天,通过旋转脚架性能测试检测3组幼鼠平衡能力变化、去除胶带测试检测3组幼鼠行为能力变化;治疗结束后,采用蛋白质印迹(Western blotting)法检测治疗前后模型幼鼠的脑部凋亡相关蛋白因子细胞色素c(Cyt C)、活化型半胱天冬酶-3(cleaved-Caspase 3)、半胱天冬酶-3前体(pro-Caspase 3)、聚ADP核糖聚合酶1(PARP-1)、蛋白酶激活受体(PAR)的表达情况.结果 第42天和第63天,与假手术组相比,HIE模型组和HIE模型+亚低温和运动干预组幼鼠平衡维持时间均显著缩短,去除胶带所用时间、海马组织中凋亡相关蛋白Cyt C、cleaved-Caspase 3、PARP-1和PAR相对表达量均显著增加,差异均有统计学意义(P<0.05).与HIE模型组相比,HIE模型+亚低温和运动干预组幼鼠平衡维持时间均显著延长,去除胶带所用时间、海马组织中凋亡相关蛋白Cyt C、cleaved-Caspase 3、PARP-1和PAR相对表达量均显著降低,差异均有统计学意义(P<0.05).结论 亚低温辅助运动治疗能够显著改善缺氧缺血性脑损伤大鼠幼崽的行为能力,其作用机制可能与调控幼鼠海马组织凋亡蛋白及PARP-1、PAR的表达有关,其治疗效果虽较为显著但要达到完全康复,仍存在疗效差距.

目的:观察抗疏强骨颗粒对去卵巢模型大鼠血清碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、抗酒石酸酸性磷酸酶5b(tartrate resistant acid phosphatase 5b,TRACP5b)的影响及其可能作用机理.方法:将SD大鼠100只随机分为正常组、模型组、中药(大、中、小剂量)组,每组20只.除正常组外其余动物饲养1周去除卵巢建立骨质疏松大鼠模型,术后1周中药组按照相应剂量给药.观察各组大鼠灌胃前后一般情况、股骨组织病理学改变以及血清ALP、TRACP5b的表达情况.结果:模型组大鼠精神状况较差,毛发颜色晦暗无光泽,体质量下降显著,偶有毛发脱落等;中药组大鼠精神状况尚可,毛发颜色较正常组稍差,体质量轻微下降.HE染色显示模型组大鼠软骨细胞出现量空骨陷窝,细胞核聚缩,且排列不整齐,骨小梁内骨细胞明显减少;中药组软骨细胞排列尚规则,结构尚完整,空骨陷窝较少见,与正常组接近.治疗3月后与模型组相比,中药组大鼠血清ALP、TRACP5b含量均下降,中剂量组含量最低,差异具有统计学意义(P<0.05).结论:抗疏强骨颗粒能通过降低去卵巢模型大鼠血清ALP、TRACP5b表达,降低破骨细胞活性,抑制骨吸收,从而治疗绝经后骨质疏松症.