-
通督调神法针刺联合石冰醒脑颗粒对血管性痴呆大鼠肠道菌群微生物的影响
编辑人员丨1天前
目的 探讨通督调神法针刺联合石冰醒脑颗粒对血管性痴呆大鼠肠道菌群的影响及其可能的作用机制.方法 将80只大鼠随机分为假手术组、模型组、通督调神法针刺组、石冰醒脑颗粒组、通督调神法针刺联合石冰醒脑颗粒组,每组10只.采用改良双侧颈总动脉永久结扎法制备血管性痴呆模型.石冰醒脑颗粒组采用石冰醒脑颗粒溶解液灌胃,通督调神法针刺组采用通督调神针刺治疗,通督调神法针刺联合石冰醒脑颗粒组采用石冰醒脑颗粒溶解液联合通督调神法针刺治疗.采用Morris水迷宫实验评价各组大鼠认知和记忆功能变化,16S rRNA测序技术分析肠道菌群结构变化.Western blot法检测caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白表达水平.结果 与假手术组比较,模型组大鼠平均逃避潜伏期显著延长(P<0.05),caspase-3和Bax蛋白表达水平显著升高(P<0.05),Bcl-2蛋白表达水平显著降低(P<0.05);肠道中罗姆布茨菌等有益菌相对丰度显著降低(P<0.05).与模型组比较,通督调神法针刺组、石冰醒脑颗粒组、通督调神法针刺联合石冰醒脑颗粒组大鼠平均逃避潜伏期显著缩短(P<0.05);caspase-3、Bax蛋白表达水平均显著降低(P<0.05)、Bcl-2蛋白表达水平均显著升高(P<0.05),肠道中密螺旋菌等有害菌相对丰度降低(P<0.05).结论 通督调神法针刺联合石冰醒脑颗粒可改善血管性痴呆大鼠认知功能障碍,其作用可能是通过调节海马caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白表达,进一步影响肠道菌群而实现的.
...不再出现此类内容
编辑人员丨1天前
-
丁苯酞对血管性痴呆小鼠认知功能的影响及Nrf2/SIRT3信号通路的调节作用
编辑人员丨1天前
目的:探讨丁苯酞对血管性痴呆(vascular dementia,VD)小鼠认知功能及Nrf2/SIRT3信号通路中的调节作用。方法:将36只野生型小鼠(Nrf2 +/+)按照随机数字表法分为假手术组(Sham组)、模型组(Nrf2 +/+VD组)、丁苯酞治疗组(Nrf2 +/+NBP组),每组12只。将24只Nrf2基因敲除小鼠(Nrf2 -/-)按照随机数字表法分为Nrf2 -/-模型组(Nrf2 -/-VD组)和Nrf2 -/-治疗组(Nrf2 -/-NBP组),每组12只。采用反复三次结扎小鼠双侧颈总动脉的方法建立脑缺血再灌注致认知功能障碍的小鼠模型;应用Morris水迷宫实验检测小鼠的认知功能,HE染色观察海马CA1区神经元形态结构的变化,免疫组化分析小鼠海马CA1区caspase-3、caspase-9的阳性表达,Western blot检测小鼠海马Nrf2、p62、LC3、SIRT3的蛋白表达。 结果:(1) Morris水迷宫实验中:与VD组小鼠相比,Sham组与Nrf2 +/+NBP组小鼠第5天逃避潜伏期明显缩短[(20.69±8.91)s,(7.58±9.47)s,(8.41±12.20)s; q=3.58,5.07,均 P<0.05],目标象限停留时间百分比明显增加[(16.80±3.27)%,(25.25±5.51)%,(24.18±6.46)%; q=3.36,4.43,均 P<0.05];与VD组比较,Nrf2 -/-VD组小鼠第5天逃避潜伏期明显延长[(33.71±9.05)s],目标象限停留时间百分比明显降低[(10.84±3.26)%],均差异有统计学意义( q=3.56,3.58;均 P<0.05)。与Nrf2 -/-VD组比较,Nrf2 -/-NBP组小鼠逃避潜伏期、目标象限停留时间百分比均差异无统计学意义(均 P>0.05)。(2)病理学结果显示:与VD组小鼠比较,Sham组与Nrf2 +/+NBP组小鼠海马CA1区锥体神经元形态结构损伤更轻,Nrf2 -/-VD组的损伤更为严重,且经NBP治疗后神经元形态改善并不明显。(3)凋亡蛋白的表达:与VD组相比,Sham组与Nrf2 +/+NBP组小鼠海马CA1区caspase-3、caspase-9表达均降低( t=3.48,2.95,3.46,2.93,均 P<0.01),而Nrf2 -/-VD组的表达均增加( t=-2.99,-3.77,均 P<0.01);同Nrf2 -/-VD组小鼠比较,Nrf2 -/-NBP组小鼠海马CA1区caspase-3、caspase-9的表达差异无统计学意义(均 P>0.05)。(4)Western blot结果显示:与VD组相比,Nrf2 +/+NBP组小鼠海马Nrf2、SIRT3、p62蛋白表达增加,LC3Ⅱ/Ⅰ比值降低( t=-3.24,-4.04,-4.03,3.62,均 P<0.01);Sham组Nrf2表达、LC3Ⅱ/Ⅰ比值降低,SIRT3、p62表达增加( t=3.44,4.72,-3.92,-4.19,均 P<0.01);Nrf2 -/-VD组Nrf2、SIRT3、p62蛋白表达降低,LC3Ⅱ/Ⅰ比值升高( t=9.14,4.20,4.30,-3.78,均 P<0.01);同Nrf2 -/-NBP比较,Nrf2 -/-VD组Nrf2、SIRT3、p62蛋白表达降低,LC3Ⅱ/Ⅰ比值升高( t=2.40,3.24,1.21,-1.16,均 P<0.01);Nrf2 +/+NBP组Nrf2、SIRT3、p62蛋白表达升高,LC3Ⅱ/Ⅰ比值降低( t=-3.29,-5.00,-7.12,6.24,均 P<0.01)。 结论:丁苯酞可以减轻VD小鼠海马区的凋亡损伤,改善反复缺血再灌注损伤所致的认知功能障碍,其机制可能与调控Nrf2/SIRT3通路、抑制海马区神经细胞凋亡、自噬有关。
...不再出现此类内容
编辑人员丨1天前
-
二甲双胍改善慢性脑低灌注大鼠认知功能障碍的作用和机制
编辑人员丨1天前
目的:探讨二甲双胍(metformin)改善慢性脑低灌注大鼠认知功能障碍的作用和机制。方法:82只3~4月龄SPF级雄性SD大鼠按照随机数字表法分为假手术对照组(Con组, n=15)、假手术二甲双胍给药组(Met组, n=20)、双侧颈总动脉结扎(2-vessel occlusion,2VO)组(2VO组, n=22)、双侧颈总动脉结扎+二甲双胍给药组(2VO+Met组, n=25),采用双侧颈总动脉结扎法建立慢性脑低灌注模型,假手术组只分离血管,不接扎。建模后按照每天100 mg/kg剂量连续4周给予二甲双胍溶液饮用水。二甲双胍干预4周后,Morris水迷宫实验检测大鼠的空间认知功能,在体电生理技术检测大鼠的长时程增强,酶联免疫吸附实验(ELISA)检测海马组织的炎性因子肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)和白介素-6(interleukin-6,IL-6)浓度水平,同时采用高尔基染色观察海马神经元树突棘的密度,透射电镜观察海马神经元的突触结构,尤其是囊泡密度。采用SPSS 16.0进行统计分析,水迷宫7 d重复学习训练的逃避潜伏期数据采用重复测量方差分析,其余数据多组间比较采用单因素方差分析,进一步两两比较采用Dunnett's t检验。 结果:Morris水迷宫结果显示,在7 d的学习训练中,4组大鼠逃避潜伏期的时间和组别交互作用不显著( F=0.93, P>0.05),但是时间主效应( F=25.90, P<0.05)和组别主效应( F=13.20, P<0.05)显著;在第3~7天的平台位置学习中,2VO组大鼠逃避潜伏期显著长于Con组和2VO+Met组(均 P<0.05)。休息1 d后检测大鼠短期记忆,结果显示:2VO组大鼠逃避潜伏期显著长于Con组和2VO+Met组( P<0.01),同时2VO大鼠的平台区域滞留时间和穿梭次数均少于Con组( P<0.01)和2VO+Met组( P<0.01)。电生理结果显示:高频刺激后,2VO组相对兴奋性突触后场电位斜率[(1.29±0.09)]显著低于Con组[(2.07±0.09)]和2VO+Met组[(1.69±0.08)]( P<0.01)。ELISA结果显示:2VO组海马组织TNF-α含量水平显著高于Con组和2VO+Met组;2VO组海马组织IL-1β和IL-6含量水平显著高于Con组和2VO+Met组。2VO组海马神经元树突棘密度显著低于Con组和2VO+Met组。2VO组海马神经元不成熟树突棘密度和比例显著高于Con组和2VO+Met组。2VO组海马CA1区神经元的突触囊泡密度[(230.29±19.44)个/μm 2]显著低于Con组[(414.52±13.17)个/μm 2]和2VO+Met组[(313.19±12.42)个/μm 2](均 P<0.05)。 结论:二甲双胍能够降低慢性脑低灌注海马组织神经炎性反应,同时能够改善突触可塑性和认知功能障碍,在治疗血管性认知功能障碍方面可能具有潜在的应用价值。
...不再出现此类内容
编辑人员丨1天前
-
电针对慢性脑缺血大鼠学习记忆及海马神经干细胞分化的影响
编辑人员丨1天前
目的:观察电针对慢性脑缺血大鼠学习记忆能力和海马神经干细胞分化的影响。方法:选取雄性Sprague Dawley大鼠120只,采用改良永久性结扎双侧颈总动脉法造成慢性脑缺血模型,将造模成功的104只大鼠分为模型组和电针组,每组52只,电针组予以电针治疗,输出电流1 mA,频率15 Hz,连续波,每次20 min,每日1次,治疗7次后休息2 d。模型组不予特殊处理。按照治疗时间的不同,将每组大鼠再细分为术后1、2、4、6周4个亚组,每个亚组13只。术后1、2、4、6周,每组随机抽取6只大鼠进行BrdU注射,观察神经干细胞增殖及分化情况。利用Morris水迷宫、BrdU+NeuN及BrdU+GFAP免疫荧光双标方法,分别观察大鼠的空间学习能力及记忆能力,探讨海马齿状回神经发生的规律。结果:电针组大鼠在术后2、4、6周的学习记忆能力明显高于模型组大鼠( P<0.05);术后2周,大鼠海马颗粒细胞层细胞出现BrdU+NeuN及BrdU+GFAP双阳性表达,电针组大鼠分化神经元的数量多于模型组( P<0.05)。与模型组同时间点比较,电针组术后4周的GFAP阳性细胞数少,术后6周的GFAP阳性细胞数多,但差异均无统计学意义( P>0.05)。 结论:电针可以促进神经干细胞的分化,进而改善慢性脑缺血大鼠的学习记忆能力。
...不再出现此类内容
编辑人员丨1天前
-
肾脑蛋白介导的突触可塑性下降在慢性脑低灌注认知功能障碍中的作用及机制
编辑人员丨1天前
目的:探讨肾脑蛋白(kidney brain protein,KIBRA)下调在慢性脑低灌注所致认知功能障碍中的作用和机制。方法:90只雄性SPF Sprague Dawley (SD)大鼠,按照随机数字表法分为四组:假手术组( n=15)、慢性脑低灌注组(2VO组, n=25)、慢性脑低灌注脑立体定位注射AAV-KIBRA组(2VO+AAV-KIBRA组, n=25)、慢性脑低灌注脑立体定位AAV-vector组(2VO+AAV-vector组, n=25)。采用双侧结扎颈总动脉方法建立慢性脑低灌注模型,脑立体定位注射2 μL AAV-KIBRA或AAV-vector,观察30 d。利用Morris水迷宫、离体电生理、p21激活的蛋白激酶3(p21-activated kinase 3,PAK3)酶活性检测、蛋白印迹、免疫共沉淀和Golgi染色方法,分别检测大鼠的空间学习记忆能力、长时程增强(long-term potentiation,LTP)、KIBRA水平表达、PAK3酶活性的变化,并观察树突棘的分布。用SPSS 16.0统计软件分析实验数据,采用单因素方差分析(one-way ANOVA)比较各组间差异,采用LSD检验进行两组间数据差异显著性比较,方差不齐则采用Welch检验。 结果:大鼠慢性脑低灌注1月后,取大鼠海马进行匀浆和蛋白印迹检测KIBRA水平,发现2VO组KIBRA水平较假手术组明显下降[(73.49±4.12)%]( P<0.01),海马CA1区注射AAV-KIBRA显著上调KIBRA水平[(91.91±7.01)%]( P<0.01)。Morris水迷宫检测发现:2VO组大鼠在7 d的平台位置学习训练中的潜伏期[第3~7天学习结果:(48.18±2.82)s、(43.45±2.27)s、(32.27±2.22)s、(26.55±2.37)s、(17.18±2.67)s]显著长于假手术组[(41.67±2.74)s、(32.58±2.57)s、(22.50±2.94)s、(16.91±2.39)s、(8.75±1.52)s](均 P<0.05),2VO+AAV-KIBRA组在7 d的平台位置学习潜伏期[第3~7天分别为:(43.83±2.95)s、(35.25±2.15)s、(26.58±2.03)s、(19.92±2.17)s、(17.75±1.35)s]显著短于2VO组(均 P< 0.01)。撤除平台的Morris水迷宫检测,短期记忆结果显示2VO组大鼠达到平台区域的潜伏期显著长于假手术组,而2VO+AAV-KIBRA组大鼠到达平台潜伏期显著短于2VO组( P<0.01)。同时2VO大鼠的平台区域滞留时间和穿梭次数均少于假手术组( P<0.01),而2VO+AAV-KIBRA组的平台区域滞留时间和穿梭次数则显著多于2VO组( P<0.01)。离体脑片电生理记录显示:高频刺激后,2VO组相对兴奋性突触后场电位(1.43±7.43)显著低于假手术组(2.21±6.54),而2VO+AAV-KIBRA组相对兴奋性突触后场电位(1.90±8.15)高于2VO组( P<0.01)。大鼠海马组织进行免疫共沉淀发现沉淀KIBRA时,蛋白免疫印迹实验可以检测到PAK3。PAK3酶活性检测结果显示:2VO海马组织PAK3的相对酶活性(0.64±0.04)显著低于假手术组(1.02±0.07),而2VO+AAV-KIBRA组PAK3的相对酶活性(0.86±0.03)显著高于2VO组。Golgi染色显示:2VO海马神经元树突棘密度[(6.85±0.43)个/10 μm]显著低于假手术组[(11.83±0.58)个/10 μm],而2VO+AAV-KIBRA组神经元树突棘密度[(10.22±0.39)个/10 μm]显著高于2VO组。 结论:慢性脑低灌注后KIBRA下降在认知功能障碍中发挥重要作用,与突触功能可塑性下降有关,KIBRA下调通过调控PAK3活性而参与树突的结构可塑性。因此,KIBRA可能是防治慢性脑低灌注认知功能的重要靶点。
...不再出现此类内容
编辑人员丨1天前
-
大鼠慢性低灌注脑白质损伤中腺苷A 2A受体的作用及其机制
编辑人员丨1天前
目的:探讨大鼠慢性低灌注脑白质损伤中腺苷A 2A受体(A 2AR)的作用及其机制。 方法:将180只成年雄性SD大鼠采用随机数字表法随机化分为假手术组(SG组, n=60)、慢性低灌注组(CG组, n=60)、慢性低灌注加A 2AR抑制剂组(IG组, n=30)和慢性低灌注加A 2AR激动剂组(AG组, n=30)4组,每组按取材时间不同随机分为2、4、8周3个亚组,其中SG和CG组每个亚组20只,IG组和AG组每个亚组10只。CG组、IG组、AG组通过双侧颈总动脉结扎法建立慢性低灌注模型,建模1 h后IG组和AG组分别用A 2AR抑制剂(2 mg/kg)和激动剂(0.5 mg/kg)腹腔注射,CG组和SG组予生理盐水(5 mL/kg)腹腔注射,每天1次,直到各组观察终点。4组大鼠分别在术后2、4、8周进行水迷宫实验,观察对比各组大鼠到达平台潜伏时间和穿越平台次数。水迷宫实验结束后,SG和CG组10只大鼠处死后取胼胝体,另外10只大鼠和IG、AG组10只大鼠取脑组织制备成冠状面切片。采用Kluver-Barrera染色观察4组大鼠脑组织的病理变化。SG和CG组大鼠采用Western blot检测胼胝体中A 2AR、DNA甲基转移酶(DNMTs)蛋白的表达水平,实时荧光定量聚合酶链反应(qPCR)检测胼胝体中A 2AR、DNMTs mRNA的表达水平,重亚硫酸盐测序法PCR(BSP)检测A 2AR基因启动子区域甲基化水平。 结果:(1)水迷宫实验:SG组术后2、4、8周到达平台潜伏时间分别为(35.12±2.47)s、(37.64±1.59)s、(34.56±1.80)s,穿平台次数分别为(2.6±0.89)次、(2.6±0.54)次、(3.2±0.83)次;CG组术后2、4、8周到达平台潜伏时间分别为(39.58±0.82)s、(39.28±2.76)s、(42.44±2.84)s,穿平台次数分别为(1.4±0.54)次、(1.4±0.54)次、(1.6±0.55)次;IG组术后2、4、8周到达平台潜伏时间分别为(41.56±2.29)s、(44.26±1.60)s、(44.32±2.37)s,穿平台次数分别为(1.4±0.55)次、(1.0±0.71)次、(1.4±0.89)次;AG组术后2、4、8周到达平台潜伏时间分别为(37.64±2.41)s、(37.34±2.36)s、(39.24±1.73)s,穿平台次数分别为(1.8±0.45)次、(1.6±0.55)次、(1.8±0.83)次。SG、CG、IG组随低灌注时间延长到达平台潜伏时间呈上升趋势,差异均有统计学意义( P值均<0.05),AG组内不同时间点到达平台潜伏时间差异无统计学意义( P>0.05)。与SG组比较,CG组、IG组到达平台潜伏时间在术后2、4、8周时明显增加,AG组在术后2、8周时明显增加,差异均有统计学意义( P值均<0.05);与CG组比较,不同时间点IG组到达平台潜伏时间均明显增加,AG组均明显减少,差异均有统计学意义( P值均<0.05)。SG组内随时间延长大鼠穿越平台次数呈上升趋势,差异有统计学意义( P<0.05),CG、IG、AG组内不同时间点穿越平台次数差异均无统计学意义( P值均>0.05)。与SG组比较,CG组、IG组、AG组不同时间点穿越平台次数均减少,差异有统计学意义( P值均<0.05);CG组、IG组、AG组两两比较,不同时间点穿越平台次数差异均无统计学意义( P值均>0.05)。(2)大鼠脑组织Kluver-Barrera染色结果显示:SG组大鼠神经纤维排列整齐,无空泡形成,神经纤维髓鞘完整。与SG组相比,CG组、IG组、AG组大鼠神经纤维变得疏松,部分纤维排列紊乱,局部出现空泡,且随着慢灌注时间的增加,变化更加明显。与CG组相比,IG组神经纤维变得更加疏松,纤维排列紊乱,空泡增加;AG神经纤维变得紧密,紊乱程度有所降低,空泡减少。(3)Western blot检测胼胝体A 2AR和DNMTs蛋白相对表达量:组内比较,CG组A 2AR、DNMT3a、DNMT3b蛋白的相对表达量随时间延长均呈下降趋势,差异均有统计学意义( P值均<0.05);SG组各项指标和CG组DNMT1蛋白的相对表达量在不同时间点的差异均无统计学意义( P值均>0.05)。组间比较,CG组术后2、4、8周A 2AR蛋白的相对表达量均低于SG组,术后2、4、8周DNMT1、DNMT3a蛋白的相对表达量和术后2、4周DNMT3b蛋白的相对表达量均高于SG组,差异均有统计学意义( P值均<0.05)。(4)qPCR检测胼胝体DNMTs mRNA表达水平:组内比较,CG组术后2、4、8周DNMT3a、DNMT3b mRNA的相对表达量随时间延长均呈先上升再下降趋势,差异有统计学意义( P值均<0.05),A 2AR、DNMT1 mRNA相对表达量差异均无统计学意义( P值均>0.05);而SG组DNMT1 mRNA随时间延长呈下降趋势( P<0.05),A 2AR、DNMT3a、DNMT3b mRNA在不同时间点的相对表达量差异均无统计学意义( P值均>0.05)。组间比较,CG组术后2、4、8周A 2AR mRNA的相对表达量均低于SG组,DNMT1、DNMT3a、DNMT3b mRNA的相对表达量均高于SG组,差异均有统计学意义( P值均<0.05)。(5)BSP检测甲基化水平:CG组在CpG12位点出现明显G锋,而SG组则转化为A锋。CG组甲基化位点比例15.83%(19/120)明显高于SG组的4.17%(5/120),差异有统计学意义(χ 2=9.074, P<0.01)。 结论:A 2AR在慢性低灌注脑白质损伤中发挥保护效应,其表达水平下调参与介导脑白质损伤,A 2AR表达下调可能与A 2AR DNA启动子区域甲基化水平增强有关。
...不再出现此类内容
编辑人员丨1天前
-
睡眠碎片化对大鼠血管性认知障碍的影响及其与中枢炎症和氧化应激的关系
编辑人员丨1天前
目的:评价睡眠碎片化对大鼠血管性认知障碍的影响及其中枢炎症和氧化应激的关系。方法:雄性SD大鼠48只,8~10周龄,体重210~240 g,采用随机数字表法分为4组( n=12):假手术组(Sham组)、假手术+睡眠碎片化组(Sham+SF组)、血管性认知障碍组(VCI组)和血管性认知障碍+睡眠碎片化组(VCI+SF组)。采用结扎双侧颈总动脉的方法制备大鼠血管性认知障碍模型。VCI+SF组和Sham+SF组于血管性认知障碍模型建立后第26天开始建立睡眠碎片化模型,第29天行条件性恐惧实验和旷场实验。条件性恐惧实验结束后,采用ELISA法检测海马TNF-α、IL-6含量,微板法检测海马SOD、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、MDA及铁含量,Western blot法检测NF-κB、caspase-3及谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)表达水平。 结果:与Sham组相比,VCI组穿越格数、站立次数及僵直时间百分比降低,海马SOD及GSH-Px含量降低,MDA、IL-6、TNF-α及铁含量升高,NF-κB、caspase-3表达上调,GPX4表达下调( P<0.05);与Sham+SF组和VCI组相比,VCI+SF组穿越格数、站立次数及僵直时间百分比降低,海马SOD及GSH-Px含量降低,MDA、IL-6、TNF-α及铁含量升高,NF-κB、caspase-3表达上调,GPX4表达下调( P<0.05)。 结论:睡眠碎片化可加重大鼠血管性认知障碍,机制可能与诱导中枢炎症和氧化应激,导致海马神经细胞凋亡及铁死亡增加有关。
...不再出现此类内容
编辑人员丨1天前
-
基于弥漫性脑缺血家兔脑自主调节功能损伤模型的监测实验研究
编辑人员丨1天前
目的:探讨采用双侧颈总动脉永久结扎法构建弥漫性脑缺血家兔脑自主调节(CAR)功能损伤模型的可行性。方法:实验选用新西兰大白兔20只(脑缺血组10只,控制组10只)。采用双侧颈总动脉永久结扎法构建模型,控制组采用同样手术过程,但两侧颈总动脉不进行闭塞。术后分别有创采集脑室内颅内压(ICP)与股动脉动脉压(ABP),离线处理并建立压力反应性指数(PRx)。比较两组PRx以验证该模型模拟脑缺血CAR功能损伤的可行性。结果:弥漫性脑缺血家兔脑自主调节功能损伤模型验证脑缺血组和控制组的PRx存在显著性差异( P<0.05)。 结论:通过双侧颈总动脉永久结扎法构建的弥漫性脑缺血家兔脑自主调节功能损伤模型的方法可行且相对简单,对于早期脑缺血CAR损伤的研究可提供一个有效的监测对象。
...不再出现此类内容
编辑人员丨1天前
-
海马神经元线粒体DNA 6mA在血管性认知障碍中的作用研究
编辑人员丨1天前
目的:探讨海马神经元线粒体DNA N6-脱氧腺苷甲基化(6mA)在血管性认知障碍中的作用及相关机制。方法:(1)体内实验:采用随机数字表法将SPF级健康雄性大鼠分为假手术组及慢性脑低灌注(CCH)组,每组12只。CCH组大鼠结扎双侧颈总动脉建立CCH模型;假手术组大鼠仅分离双侧颈总动脉,不结扎。2组大鼠于造模后第50天采用旷场实验检测探索能力,第51~53天采用新物体识别试验进行认知功能评估,第54~59天采用Morris水迷宫法检测学习记忆能力。随后处死大鼠检测海马组织ATP浓度及活性氧(ROS)荧光强度并通过TUNEL染色检测海马CA1区神经元凋亡情况。(2)体外实验:HT-22细胞分为正常对照(NC)组、氧糖剥夺(OGD)组、OGD+siControl组、OGD+siMETTL4组。其中NC组正常培养细胞,OGD组给予低糖低氧处理12 h,OGD+siControl组及OGD+siMETTL4组分别给予NC-siRNA、METTL4-siRNA转染细胞后低糖低氧处理12 h。通过透射电镜观察细胞线粒体形态,采用流式细胞术检测细胞ROS荧光强度,通过JC-1荧光染色检测细胞线粒体膜电位,使用试剂盒检测线粒体复合物Ⅰ、Ⅲ活性。(3)体内及体外实验:采用免疫荧光染色实验及Western blotting实验检测大鼠海马组织神经元线粒体及HT-22细胞线粒体中METTL4及DNA 6mA表达。结果:(1)体内实验:与假手术组比较,CCH组大鼠出现认知障碍表现,表现为旷场实验中进入中心区域次数明显增多,探索新物体时间明显减少,水迷宫实验中穿越平台次数明显减少,逃避潜伏期明显延长,差异均有统计学意义( P<0.05)。与假手术组大鼠比较,CCH组大鼠海马ATP浓度明显下降[(18.820±1.177)nmol/L vs. (10.190±0.519)nmol/L],ROS荧光强度明显增加[(4 488.00±255.70)AU vs. (11 644.00±530.20)AU],差异均有统计学意义( P<0.05)。TUNEL染色实验结果显示CCH组大鼠海马神经CA1区凋亡神经元数量较假手术组大鼠明显增多。免疫荧光染色结果显示CCH组大鼠海马神经元中6mA及METTL4分布以线粒体为主,表达较假手术组大鼠均明显增加。Western blotting实验结果显示CCH组大鼠海马组织线粒体中METTL4表达较假手术组大鼠明显升高(1.729±0.168 vs. 1.000±0.000),差异有统计学意义( P<0.05)。(2)体外实验:透射电镜下,与NC组比较,OGD组细胞表现为线粒体嵴消失、膜断裂、空泡化明显。与OGD组细胞比较,OGD+siMETTL4组细胞ATP生成明显增加,ROS生成明显减少,线粒体膜电位明显升高,线粒体复合物Ⅰ和Ⅲ活性明显增加,差异均有统计学意义( P<0.05)。细胞免疫荧光染色实验结果显示,OGD组细胞mtDNA 6mA及METTL4表达较NC组明显增加,且两者以在线粒体中表达为著;OGD+siMETTL4组细胞线粒体DNA(mtDNA) 6mA及METTL4表达较OGD组细胞均明显降低。Western blotting实验结果显示,OGD+siMETTL4组细胞中METTL4表达较OGD组明显降低(1.578±0.261 vs. 2.970±0.280),差异有统计学意义( P<0.05)。 结论:CCH后认知障碍大鼠海马组织神经元线粒体特异性高表达的甲基化酶METTL4促使mtDNA 6mA表达增加,进而导致线粒体能量代谢障碍及ROS升高,可能为血管性认知障碍的机制之一。
...不再出现此类内容
编辑人员丨1天前
-
慢性脑低灌注对大鼠认知功能和肠黏膜屏障的影响
编辑人员丨1天前
目的:探讨慢性脑低灌注(chronic cerebral hypoperfusion,CCH)后大鼠认知障碍及肠黏膜屏障损伤之间的相关性,量化分析慢性脑低灌注所致实验大鼠认知行为改变,以及肠黏膜屏障紧密连接蛋白claudin-1与骨桥蛋白(osteopontin,OPN)的表达变化。方法:雄性SD大鼠30只,按照随机数字表法分为慢性脑低灌注组(CCH组)和假手术组(SHAM组),每组15只大鼠。通过双侧颈总动脉永久性结扎法建立CCH模型,SHAM组大鼠只分离颈总动脉不结扎。4周后采用旷场实验、物体辨别实验和Morris水迷宫实验检测大鼠的情绪唤醒能力,对新事物的探索能力及空间学习记忆能力。HE染色及免疫荧光染色实验检测大鼠回肠组织损伤情况,免疫蛋白印迹实验检测回肠组织OPN表达水平,ELISA实验检测大鼠血清OPN水平。采用SPSS 23.0及GraphPad 8.0统计软件处理数据,采用 t检验及重复测量方差分析等方法进行数据分析。 结果:旷场实验:与SHAM组[(28.70±10.70)次,(1 030.45±81.51)cm]比较,CCH组大鼠站立次数和运动总路程[(16.70±7.13)次,(736.64±136.71)cm]减少,差异有统计学意义( t=1.59,4.16,均 P<0.05);物体辨别实验:CCH组大鼠的辨别指数(0.44±0.26)低于SHAM组(0.91±0.07),差异有统计学意义( t=-7.76, P<0.05);Morris水迷宫定位航行实验显示,组别和时间主效应均显著( F=383.36,153.87, P<0.05)。简单效应分析显示,与SHAM组比较,CCH组大鼠逃避潜伏期与游泳总路程增加(均 P<0.05);空间探索实验显示,与SHAM组[(7.20±1.81)次,(9.96±2.95)s]比较,CCH组大鼠穿越次数[(3.00±0.82)次]减少,穿越潜伏期[(29.70±6.28)s]延长,差异有统计学意义( t=4.65,7.04,均 P<0.05)。肠道黏膜病理评分,与SHAM组[(1.98±0.34)分]比较,CCH组评分[(4.52±0.27)分]更高,肠道黏膜损伤更重( t=18.53, P<0.01);免疫荧光实验显示,与SHAM组(125 028.58±33 077.39)比较,CCH组肠道上皮细胞间的claudin-1累计光密度(47 154.50±7 507.29)降低( t=-16.10, P<0.01);免疫蛋白印迹实验,与SHAM组(0.38±0.11)比较,CCH组肠道OPN表达含量(1.20±0.95)增加( P<0.05);ELISA实验,与SHAM组[(3.42±0.66)μg/L]比较,CCH组血清OPN含量[(14.92±1.45)μg/L]明显增加( P<0.05)。认知受损程度与肠黏膜上皮claudin-1表达量、血清OPN含量间均呈负相关(均 P<0.01);肠黏膜上皮claudin-1表达量与血清OPN含量呈负相关( r=-0.952, P<0.01)。 结论:CCH可引发明显的大鼠认知功能受损及肠道黏膜屏障的破坏,血清OPN或可作为CCH致大鼠认知损伤及肠道黏膜屏障破坏的潜在血清学标志物。
...不再出现此类内容
编辑人员丨1天前
